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    微生物代謝合成呋喃酮的培養(yǎng)條件和酶學(xué)調(diào)控研究進(jìn)展

    2021-12-01 00:42:42潘百玲戴凌燕劉微彭輝鄧景致李志江
    關(guān)鍵詞:魯氏呋喃果糖

    潘百玲,戴凌燕,劉微,彭輝,鄧景致,李志江,3,4

    (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院;3.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心;4.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級培育協(xié)同創(chuàng)新中心)

    2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮(HDMF),商品名為呋喃酮,廣泛分布在自然界生物中。在濃度較高時HDMF具有焦糖香味,由于在濃度較低時呈現(xiàn)清香的草莓、菠蘿香味,又可稱為菠蘿酮或草莓酮。HDMF作為一種調(diào)味香料,與同類產(chǎn)品相比具有更低的香味閾值(0.04 ppb)[1],并且具有極高的商業(yè)價值,被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、煙草、化妝品等各種行業(yè)中[2]。HDMF雖然廣泛存在于天然產(chǎn)物中,但由于其含量很低,不能滿足日常所需,所用的多為人工合成產(chǎn)品。

    在歐洲和美國,將物理方法和生物合成法(酶催化或微生物發(fā)酵法)生產(chǎn)的香料標(biāo)記為“天然”的調(diào)味劑和芳香劑等[1]。天然的HDMF與人工合成的HDMF相比,香氣純正、濃厚,且安全性高,具有不可替代性。隨著人們對天然產(chǎn)品的需求不斷提高以及對HDMF的廣泛應(yīng)用,市場上對HDMF的需求量也越來越大,尤其是食品界對天然HDMF的需求量日益增加。因此,利用生物合成法生產(chǎn)天然HDMF是現(xiàn)階段研究和應(yīng)用的主要趨勢,并且具有良好的發(fā)展前景。

    1 呋喃酮的制備方法

    目前,HDMF的生產(chǎn)方法主要包括溶劑提取法、化學(xué)合成法和微生物合成法。HDMF天然提取法可以從菠蘿、草莓等水果中直接提取分離,但含量均較低,且分離、提取成本較高,因此天然提取法不適用于大量生產(chǎn)天然HDMF。關(guān)于HDMF的化學(xué)合成方法已得到廣泛研究,但化學(xué)合成的HDMF存在合成步驟較多、產(chǎn)物的香氣特征不佳、得率不高以及存在溶劑殘留等問題,不宜用于食品、飲料等產(chǎn)品中。

    生物合成法在食品生產(chǎn)中應(yīng)用比較廣泛[3-5],但生物合成法生產(chǎn)HDMF的研究還屬于探索階段,主要以微生物代謝合成為代表。目前研究發(fā)現(xiàn)能夠代謝合成HDMF的微生物主要包括酵母菌和乳酸菌兩種類型,其發(fā)酵所利用的碳源大多為1,6-二磷酸果糖,而1,6-二磷酸果糖成本較高,但利用D-果糖(FDP)可以代替1,6-二磷酸果糖。微生物發(fā)酵生產(chǎn)HDMF步驟簡單,將微生物在固定培養(yǎng)基中和特定條件下進(jìn)行培養(yǎng),通過次級代謝合成HDMF。因此,為滿足人們對天然呋喃酮香料的需求,微生物合成法生產(chǎn)HDMF已成為替代其他生產(chǎn)方法的新型生產(chǎn)技術(shù)手段。

    2 代謝合成呋喃酮的微生物種類及分子機(jī)制

    目前,生物方法合成HDMF主要以微生物代謝為主,主要有魯氏酵母、畢赤酵母和乳酸菌等,其中關(guān)于魯氏酵母研究的最多。

    2.1 魯氏酵母

    2.1.1 魯氏酵母代謝合成呋喃酮

    魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)是一種能在高鹽或高糖條件下生長繁殖的一種酵母菌。魯氏酵母在參與醬油釀造的過程中能夠產(chǎn)生呋喃酮類等香味物質(zhì),對醬油獨(dú)特風(fēng)味的形成起到重要的作用[6-7]。Sugawara等[8]研究也表明這種風(fēng)味物質(zhì)存在于味噌發(fā)酵食品中,其形成是魯氏酵母的酶促生化反應(yīng)。目前已知最重要的HDMF生物合成途徑就是通過魯氏酵母代謝產(chǎn)生。Hecquet等[9]研究表明,魯氏酵母在含有D-1,6-二磷酸-果糖和D-葡萄糖的營養(yǎng)液中可以合成呋喃酮。在添加10%(w·v-1)D-1,6-二磷酸-果糖和5%(w·v-1)D-葡萄糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)11 d后得到的HDMF最高濃度約80 mg·L-1。Li等[10]研究表明D-果糖調(diào)控后的魯氏酵母菌在培養(yǎng)到第5 d時,其主要的香味物質(zhì)酮類和酯類等開始增加,實(shí)驗(yàn)組的HDMF含量達(dá)到對照組的7.5倍;當(dāng)調(diào)控進(jìn)行到至7 d時,產(chǎn)物之間差距變小,說明呋喃酮的合成與D-果糖調(diào)控有關(guān)。繼續(xù)對D-果糖產(chǎn)生呋喃酮的分子機(jī)制進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)隨著D-果糖的消耗,糖酵解(EMP)和磷酸戊糖途徑(PPP)中HDMF合成的初級代謝產(chǎn)物逐漸增加。這表明,D-果糖可以通過EMP和PPP途徑生成呋喃酮。近些年關(guān)于酵母菌代謝途徑的研究越來越多,對于呋喃酮類物質(zhì)生物合成途徑及其機(jī)理的闡述仍不完整。

    2.1.2 魯氏酵母細(xì)胞通過EMP碳代謝途徑合成HDMF

    糖酵解途徑(EMP)是一種厭氧途徑,由于是酵母合成HDMF必不可少的代謝途徑,因此在酵母代謝中糖酵解途徑起到了非常重要的作用。EMP需要多種酶類共同作用,而這些酶類物質(zhì)在EMP中可以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行、調(diào)節(jié)能量并在環(huán)境改變時進(jìn)行信號傳導(dǎo),因此在EMP中起到了關(guān)鍵性的作用[11]。這些酶中包含的三種重要的單向酶:磷酸果糖激酶(PFK1,EC 2.7.1.11)、丙酮酸激酶(PK,EC 2.7.1.40)以及己糖激酶(HK,EC 2.7.1.1)。在魯氏酵母細(xì)胞中,HK將D-果糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸-D-果糖,將葡萄糖催化為6-磷酸葡萄糖。葡萄糖-6-磷酸被磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(G6PI,EC 5.3.1.9)催化為果糖-6-磷酸,然后在磷酸果糖激酶的作用下磷酸化為果糖-1,6-二磷酸,這步反應(yīng)是不可逆的[12]。在醛縮酶(FBA,EC 4.1.2.13)作用下果糖-1,6-二磷酸裂解成三磷酸甘油醛(GAP)和二羥基磷酸丙酮(DHAP)[13]。磷酸二羥基丙酮被認(rèn)為是HDMF的前體物質(zhì)。

    2.1.3 魯氏酵母細(xì)胞通過PPP途徑合成HDMF

    磷酸戊糖途徑(PPP)作為魯氏酵母細(xì)胞中糖代謝的關(guān)鍵途徑,為魯氏酵母菌的代謝提供了必不可少的條件[10]。PPP包括氧化和非氧化兩個過程,當(dāng)PPP在氧化過程中,6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH,EC 1.1.1.49)使6-磷酸葡萄糖氧化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯,進(jìn)而在6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(6PGL,EC 3.1.1.31)的作用下又催化為葡萄糖酸-6-磷酸,隨后又在6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6GPDH)的作用下氧化為5-磷酸核酮糖[10]。G6PDH和6PGDH作為該途徑的不可逆酶,可以用來與NADPH一起來調(diào)節(jié)磷酸戊糖途徑的代謝效率。PPP途徑的非氧化反應(yīng)的方向取決于代謝底物和產(chǎn)物的相對含量。轉(zhuǎn)酮酶(TKT,EC 2.2.1.1)和轉(zhuǎn)醛酶(TALDO,EC 2.2.1.2)是介導(dǎo)非氧化性PPP可逆反應(yīng)的兩種關(guān)鍵酶。在TKT的作用下,核酮糖-5-磷酸和木糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化為三磷酸甘油醛和7-磷酸景天庚酮糖[10](S7P)的過程是可逆的;而在TALDO的作用下,S7P和GAP轉(zhuǎn)化為4-磷酸赤蘚糖和果糖-6-磷酸是不可逆的[10],然而果糖-6-磷酸是參與糖酵解途徑合成HDMF前體物。

    2.2 畢赤酵母

    畢赤酵母(P.capsulata)既是一種嗜甲基酵母菌,也是一種嗜好有氧生長的菌株,可在碳源僅為甲醇的營養(yǎng)液中快速生長。其生長的pH在3.0~8.0之間,對乙醇具有耐受性,這使它有較好的發(fā)酵基礎(chǔ)。因此可以更有利于使其實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng),其菌體密度可高達(dá)100 g·L-1干細(xì)胞[14]。

    早期研究發(fā)現(xiàn),畢赤酵母菌可以通過轉(zhuǎn)化利用L-(+)-鼠李糖代謝合成HDMF。Roscher等[15]對莢膜畢赤氏酵母(P.capsulata)利用廉價碳源L-(+)-鼠李糖產(chǎn)生HDMF進(jìn)行了研究,研究表明畢赤酵母在當(dāng)培養(yǎng)基中含有酪蛋白和鼠李糖時可以產(chǎn)生HDMF,產(chǎn)量最高約為2 mg·L-1,此時培養(yǎng)到第4 d;而未添加鼠李糖培養(yǎng)基中未檢測HDMF,從而推斷HDMF產(chǎn)生于L-(+)-鼠李糖加熱后中間產(chǎn)物。張海林等[16]從酒曲中篩選到一株季也蒙畢赤氏酵母,經(jīng)紫外誘變、亞硝基胍誘變處理后所得HDMF產(chǎn)量為92.5 mg·L-1。王鵬霄[2]從菠蘿、草莓等水果中分離篩選到利用D-果糖產(chǎn)HDMF的畢赤酵母和漢遜酵母,產(chǎn)量分別可達(dá)6.84 mg·L-1和10.96 mg·L-1。

    2.3 乳酸菌

    乳酸菌是食品發(fā)酵方向研究較多的一類益生菌,乳酸菌及其代謝產(chǎn)物已在食品、醫(yī)藥、等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在食品行業(yè),乳酸菌的利用是不可缺少的,如酸奶的制備、肉類和蔬菜的發(fā)酵制品以及一些酒的生產(chǎn)[17],目前乳酸菌是食品發(fā)酵工業(yè)研究較多的一類益生菌,也可產(chǎn)呋喃酮。Kowalewska等[18]發(fā)現(xiàn),在生長有瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)的氨基酸脫脂牛奶培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生HDMF。Preininger等[19]證實(shí),乳酸菌L.helveticus和L.delbrueckii分別在乳清粉水懸液中培養(yǎng)7 d后產(chǎn)生598μg·L-1和427μg·L-1HDMF。Hayashida等[20]對一株廣泛用于乳酪生產(chǎn)的菌種——乳酸乳桿菌乳酸亞種L.cremoris產(chǎn)HDMF能力進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,在添加谷氨酸鈉的培養(yǎng)基中補(bǔ)充核糖或半乳糖均有HDMF產(chǎn)生,而只有在添加半乳糖的培養(yǎng)基HDMF產(chǎn)量較高,培養(yǎng)到第3 d時產(chǎn)量可達(dá)到1.17 mg·L-1。

    綜上所述,微生物代謝合成HDMF的研究還在探索階段,主要菌種為魯氏酵母菌,其次為畢赤酵母菌和乳酸菌,但HDMF的合成機(jī)理尚不清楚。利用魯氏酵母生菌代謝合成HDMF是目前最常用的HDMF生物合成途徑,而利用畢赤氏酵母和乳酸菌生物合成HDMF的研究較少。

    3 調(diào)控微生物合成呋喃酮的培養(yǎng)條件對其產(chǎn)量的影響

    3.1 滲透壓

    3.1.1 NaCl濃度

    微生物代謝合成HDMF時會受到一些外界環(huán)境的影響。一些鹽類、糖類的添加就是為了改變其滲透壓從而影響代謝物的合成。有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌產(chǎn)呋喃酮類物質(zhì)時,NaCl的添加對酵母菌產(chǎn)呋喃酮有較大影響。周亞男等[21]在對魯氏酵母產(chǎn)HDMF發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn),酵母菌產(chǎn)HDMF的能力隨NaCl濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。當(dāng)添加NaCl濃度為180 g·L-1時,HDMF含量最高為6.69 mg·L-1。當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)升高時,HDMF產(chǎn)量出現(xiàn)明顯下降趨勢,可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基中滲透壓增大,當(dāng)滲透壓過大時,影響菌體生長。Hauck等[22]也發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中NaCl濃度高有利于HDMF的合成,用其他高滲物質(zhì)代替NaCl時,則效果較差。馮杰等[23]利用醬油中篩選的埃切假絲酵母進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基在200 g·L-1的NaCl濃度條件下菌體的濃度達(dá)到最高,而NaCl濃度為220 g·L-1時HDMF產(chǎn)量和菌體濃度最高,當(dāng)NaCl濃度為240 g·L-1。

    時HDMF產(chǎn)量最低。Hecquet等[9]在研究魯氏酵母時,發(fā)現(xiàn)高濃度NaCl有利于魯氏酵母合成HDMF。經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲得一株耐高滲透壓酵母菌株SX-21,并觀察在不同濃度NaCl條件下合成HDMF的能力,在添加14%NaCl的培養(yǎng)基中,菌種生長較慢,需發(fā)酵培養(yǎng)10 d,在含有16%NaCl的培養(yǎng)基中,菌種生長被抑制,雖然高濃度的NaCl對SX-21酵母菌株合成HDMF有較大的促進(jìn)作用,但濃度不宜過高。

    3.1.2 FDP濃度

    有研究發(fā)現(xiàn),D-果糖、乳糖、鼠李糖都能促進(jìn)HDMF的生成,而添加FDP則更有利于HDMF合成。Hecquet等[9]研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)DP是魯氏酵母代謝合成呋喃酮較好的前體物質(zhì)。研究外源添加FDP對酵母合成呋喃酮的影響,在含有12%NaCl的培養(yǎng)基中添加12%FDP,其合成呋喃酮的量與添加10%FDP相當(dāng),說明培養(yǎng)基中添加10%FDP時呋喃酮產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到最高,而超過該濃度時產(chǎn)量受到抑制。Hecquet等[9]也發(fā)現(xiàn),在含有10%FDP的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母達(dá)到11 d時,HDMF的濃度高達(dá)80 mg·L-1。與外源添加FDP的試驗(yàn)相比,HDMF生成不能由酵母自身生成的FDP轉(zhuǎn)化,只能由外源添加的FDP轉(zhuǎn)化生成[24]。由此可知,外源添加FDP有利于HDMF的合成,HDMF的產(chǎn)量隨FDP的濃度增加而增加,但當(dāng)濃度超過10%時HDMF的產(chǎn)量受到抑制。

    3.2 初始p H值

    各種微生物都有其生長的最適pH值,低于或高于最適pH值都會使微生物的生長受到抑制。張海林等[16]在研究NTG-SX-103酵母菌發(fā)酵產(chǎn)HDMF時發(fā)現(xiàn),初始pH對微生物合成HDMF有較大影響,在培養(yǎng)基起始pH為3.8條件下酵母菌生長緩慢,而當(dāng)起始pH值為5.8時生成HDMF的產(chǎn)量最高,達(dá)到101 mg·L-1。當(dāng)起始pH5.8為時,與起始pH為4.6時相比,菌體的總量相差不大,但HDMF產(chǎn)量提升了1.7倍。因此,起始pH值對酵母生成HDMFF有較大的影響。

    3.3 搖床轉(zhuǎn)速

    張海林等[16]研究發(fā)現(xiàn),HDMF產(chǎn)量隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高而升高。HDMF的產(chǎn)量在搖床轉(zhuǎn)速為250 r·min-1時達(dá)到最大值,是在培養(yǎng)菌株時搖床轉(zhuǎn)速為0時的4.4倍,產(chǎn)量相對較低,是搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1時的1.4倍。因此,搖床轉(zhuǎn)速對菌株生成HDMF有著較大的影響。

    3.4 發(fā)酵溫度

    張海林等[16]研究發(fā)現(xiàn),其篩選的NTG-SX-103酵母菌的最高耐受溫度為40℃,一旦溫度高于40℃時,酵母的生長便會受到抑制。以添加100 g·L-1FDP和80 g·L-1NaCl的麥汁為出發(fā)培養(yǎng)基,考察溫度對NTG-SX-103生產(chǎn)HDMF的影響時發(fā)現(xiàn),在不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵液中的菌體濃度基本一致,當(dāng)溫度為26℃時HDMF最高產(chǎn)量為90.2 mg·L-1,當(dāng)溫度為38℃時最低為85.5 mg·L-1。王鵬霄[2]對篩選出的P3株菌(畢赤酵母)發(fā)酵溫度對產(chǎn)HDMF的影響進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為34℃時,HDMF產(chǎn)量最高為32.46 mg·L-1;當(dāng)溫度為38℃時其產(chǎn)量最低,僅為21.58 mg·L-1??颠h(yuǎn)軍[25]在高耐性魯氏酵母高密度發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn),魯氏酵母的最佳發(fā)酵溫度為28℃,而最佳發(fā)酵溫度既適合菌體的生長,又適合代謝產(chǎn)物的合成。因此,發(fā)酵溫度對HDMF的生產(chǎn)有著一定的影響。

    3.5 接種量

    張海林等[16]向添加了80 g·L-1NaCl和100 g·L-1FDP麥汁的培養(yǎng)基中分別接入濃度為2%、4%、6%、8%的菌種,同時培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)不同接種量的條件下菌體濃度基本沒有太大的變化。在接種量為4%時最高HDMF產(chǎn)量為92.6 mg·L-1,最低HDMF產(chǎn)量為87.6 mg·L-1,所以接種量對NTG-SX-103菌株生成HDMF影響較小。接種量的變化只影響前期培養(yǎng)的菌體濃度,對后期發(fā)酵的菌體濃度則基本不受到影響,而HDMF作為次級代謝產(chǎn)物在發(fā)酵后期生成,接種量對HDMF的生成影響較小。周亞男等[21]研究發(fā)現(xiàn)隨著酵母菌數(shù)增加,除酵母菌濃度為5×107cfu·mL-1時,生成HDMF含量最低為0.74 mg·L-1,其他不同濃度生成HDMF的含量相差不大,最高為4.93 mg·L-1,最低為4.06 mg·L-1,最佳酵母菌濃度可選為5×108cfu·mL-1,接種量為5×108cfu·mL-1時的HDMF含量最高[21]。因此,不同接種量對生成HDMF的影響較小。

    3.6 不同碳源

    張海林等[16]以添加80 g·L-1NaCl的13 Bé麥汁為培養(yǎng)基,分別添加葡萄糖、FDP、乳糖、鼠李糖和麥芽糖,麥汁培養(yǎng)基為空白對照,研究不同碳源對HDMF產(chǎn)量的影響。發(fā)現(xiàn)以FDP為碳源時HDMF的產(chǎn)量達(dá)到45.6 mg·L-1,以其它糖類為碳源時HDMF的產(chǎn)量在14~17 mg·L-1。由此可知,F(xiàn)DP能更好的促進(jìn)HDMF的生成,F(xiàn)DP是HDMF的前體物質(zhì),對HDMF的生成影響很大。

    4 調(diào)控微生物合成呋喃酮的關(guān)鍵酶

    4.1 己糖激酶HK

    催化己糖磷酸化的酶統(tǒng)稱為己糖激酶,是植物和其他有機(jī)體代謝活動的重要調(diào)控酶。HK既調(diào)控植物體內(nèi)貯存糖和游離糖的利用率,也調(diào)控糖酵解和磷酸戊糖途徑的代謝速率[26]。糖代謝進(jìn)入細(xì)胞后的第一步就是由特定的糖激酶催化磷酸化,因此HK在生物體糖代謝的過程中起著重要作用。在糖代謝合成HDMF途徑中(圖1),D-葡萄糖或D-果糖在HK的催化下形成6-磷酸葡萄糖或6-磷酸果糖,是糖代謝途徑的重要中間產(chǎn)物,廣泛地存在于動植物和一些微生物體中,并且是磷酸戊糖支路的起始物[10]。而糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑參與生物合成呋喃酮途徑,葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸是重要代謝產(chǎn)物,因此己糖激酶在微生物法合成HDMF中起到重要作用。

    圖1 從葡萄糖和果糖開始的呋喃酮代謝合成路線圖Fig.1 The metabolic synthesis route of furanones starting from glucose and fructose

    4.2 醛縮酶FBA、磷酸果糖激酶PFK1和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶6PGDH

    已經(jīng)闡述了糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑參與生物合成呋喃酮途徑,PFK1作為EMP中的關(guān)鍵酶,將果糖-6-磷酸催化為FDP。在EMP途徑中的FBA將FDP可逆地轉(zhuǎn)化為DHAP和GAP。6PGDH可以在PPP途徑中催化6-磷酸-D-葡萄糖酸氧化為核酮糖-5-磷酸。并對它們進(jìn)行了酶活的測定,發(fā)現(xiàn)在添加FDP的培養(yǎng)基中的PFK1活性在發(fā)酵7 d時相對于對照組顯著提高;在發(fā)酵5 d時,YPD+Fru組中的FBA較YPD組顯著上調(diào)2.45倍(P<0.001),在添加FDP的培養(yǎng)基中的6PGDH在發(fā)酵5 d和7 d時高于YPD組(P<0.001)。因此,Li等[10]認(rèn)為PFK1、FBA和6PGDH作為D-果糖合成呋喃酮過程中的關(guān)鍵酶。

    4.3 轉(zhuǎn)酮酶TKT

    轉(zhuǎn)酮酶是磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶,催化磷酸酮糖與磷酸醛糖之間的相互轉(zhuǎn)移[27]。轉(zhuǎn)TKT參與了芳香族氨基酸的前體物質(zhì)合成,因此是芳香化合物合成過程中的關(guān)鍵酶。TKT將戊糖磷酸途徑與糖酵解途徑緊密地聯(lián)系在一起,根據(jù)細(xì)胞代謝的需求切換反應(yīng)的方向,提供不同的代謝產(chǎn)物,當(dāng)細(xì)胞對5-磷酸核糖的需求超過NADPH時,TKT可與其它分子一起將糖酵解途徑產(chǎn)生的果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸通過反向磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化為核糖-5-磷酸,反之TKT可與其它分子一起將核糖-5-磷酸通過磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸。細(xì)胞中超過85%的核糖-5-磷酸是由轉(zhuǎn)酮酶參與產(chǎn)生的,而該途徑可逆(圖1)。因此轉(zhuǎn)酮酶在微生物法合成HDMF中起到重要作用。

    4.4 磷酸丙糖異構(gòu)酶TPI

    磷酸丙糖異構(gòu)酶是糖酵解過程中重要的異構(gòu)酶,催化二羥丙酮磷酸和D-甘油醛-3-磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化[28],糖酵解途徑參與生物合成HDMF的途徑,且二羥丙酮磷酸為HDMF的重要前體物質(zhì)(圖1),因此磷酸丙糖異構(gòu)酶在HDMF的生物合成途徑中有著重要作用。

    4.5 6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶6PGL和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶G6PI

    在PPP途徑的前三個步驟中,涉及到了葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶三種酶,在他們的作用下可將葡萄糖6-磷酸轉(zhuǎn)化為5-磷酸核酮糖[10]。核糖-5-磷酸會在TKT的作用下還原成果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸,而果糖-6-磷酸在PFK1和FBA的作用下可逆地裂解為DHAP和GAP(圖1)。6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶也是糖代謝中重要的異構(gòu)酶和氧化還原酶,它催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之間相互轉(zhuǎn)化。因此,在生物合成HDMF途徑中,6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶6PGL和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶G6PI也有著重要作用。

    4.6 乙醇脫氫酶ADH

    甲基扭曲桿菌(Methylobacterium xtorquens)菌株可以在草莓的培養(yǎng)過程中分離得到,當(dāng)該菌對草莓的愈傷組織進(jìn)行處理后,相比于未處理過的組織,其HDMF的含量明顯增高。Zabetakis等[29]研究表明,可以從草莓愈傷組織和甲基扭曲桿菌中分別得到兩種分子量不同的ADH,并探討了兩種ADH在合成HDMF過程中的作用,發(fā)現(xiàn)甲基扭曲桿菌分泌的ADH更有利于HDMF的合成[1],所以認(rèn)為ADH在微生物合成HDMF中起到重要的作用。

    4.7 醌氧化還原酶QOR

    草莓氧化還原酶早期被認(rèn)為是醌氧化還原酶(QOR),是一種成熟誘導(dǎo)的負(fù)生長素調(diào)節(jié)酶,催化草莓果實(shí)中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)HDMF的形成[30]。草莓中HDMF的直接前體顯示為4-羥基-5-甲基-2-亞甲基-3(2H)-呋喃酮(HMMF),而草莓QOR被認(rèn)為負(fù)責(zé)還原HMMF的α,β-不飽和鍵,形成芳香活性化合物HDMF。QOR在果實(shí)中積累薄壁組織,主要在果實(shí)生長和成熟的后期表達(dá),與果實(shí)中的呋喃酮產(chǎn)生平行存在。QOR對與呋喃酮生產(chǎn)相關(guān)的環(huán)境刺激作出反應(yīng),在黑暗中,草莓果實(shí)在25℃時的QOR表達(dá)水平和HDMF產(chǎn)量均比15℃時高[30],低溫貯藏時,HDMF的濃度和QOR蛋白豐度也顯著低于室溫貯藏下的水平。因此,QOR的調(diào)節(jié)對于調(diào)控HDMF含量是很重要的。

    5 展望

    隨著生活水平的提高,人們對食品安全非??粗?,“綠色”“天然”產(chǎn)品的關(guān)注度更高。綜上所述,利用生物合成法生產(chǎn)的呋喃酮香料就屬于“天然香料”的范疇,其產(chǎn)品的污染小、成本較低、產(chǎn)品香氣突出,且可持續(xù)發(fā)展。通過大量的研究發(fā)現(xiàn),通過對菌株培養(yǎng)條件的改變以及有關(guān)酶的調(diào)控來提高呋喃酮的產(chǎn)量,所以,利用生物合成法生產(chǎn)商業(yè)價值較高的HDMF具有非常重要的前景。但目前生物合成法生產(chǎn)HDMF還屬于基礎(chǔ)理論研究階段,產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還沒有實(shí)現(xiàn),并且利用微生物法合成的HDMF所用的前體物質(zhì)成本較高,降低生產(chǎn)的成本并且提高HDMF產(chǎn)量是目前研究急需解決的問題。

    雖然目前國內(nèi)外有關(guān)HDMF的生物合成技術(shù)研究不多,但是隨著市場對天然呋喃酮香料需求量的不斷增加,采用微生物合成法生產(chǎn)價格昂貴、產(chǎn)量低的天然HDMF將成為研究的熱點(diǎn)之一。隨著分子生物學(xué)、酶工程、基因工程等技術(shù)的不斷完善,為生物合成法生產(chǎn)HDMF提供了更有力的技術(shù)支撐和研究保障??梢岳脴?gòu)建基因工程菌改變菌種的功能性狀使其達(dá)到高產(chǎn)HDMF的目的,這將成為未來提高HDMF產(chǎn)量的一個研究方向。

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