葡萄花色苷的組成及生物合成研究進(jìn)展

朱磊，李新月，胡禧熙，劉云清，于昕楚，武欣，臧延青，湯華成

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心；3.國家雜糧工程技術(shù)研究中心；4.黑龍江省農(nóng)科院大慶分院）

花色苷是植物色素中最重要的一類，它存在于高等植物的器官當(dāng)中，主要將紅、橙、藍(lán)、紫等不同的顏色呈現(xiàn)出來，其中，花和果實中的花色苷最為豐富。自然界中存在著種類繁多的花色苷，目前已經(jīng)從植物中鑒定出了600余種花色苷化合物[1]。這些天然的花色苷是合成食品色素的理想替代品，具有巨大的潛力，而葡萄是花色苷的主要來源之一。

葡萄花色苷的母核為花色素，由于花色素在自然界中極其不穩(wěn)定，需要經(jīng)過一系列的修飾作用形成不同種類的花色苷及其衍生物[2]。這些花色苷的生物合成途徑可以分為兩個階段：第一階段為苯丙烷類代謝途徑，第二階段為類黃酮途徑，整個合成過程受內(nèi)部因素（結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和MYB單倍體）和外部因素（植物激素和環(huán)境）的調(diào)控。重點闡述不同花色苷及其衍生物的組成及生物合成，為今后葡萄中花色苷的相關(guān)研究提供參考。

1 葡萄花色苷的結(jié)構(gòu)及分布

花色苷母核結(jié)構(gòu)為花色素，由一個吡喃環(huán)（C）和兩個芳香環(huán)（A和B）組成（圖1）[3]，主要包括花翠素（Delphinidin，Dp）、花青素（Cyanidin，Cy）、甲基花翠素（Petunidin，Pt）、甲基花青素（Peonidin，Pn）、二甲花翠素（Malvidin，Mv）和花葵素（Pelargonidin，Pg）（表1）[4]。

表1 六種基本花色素Table 1 Six primitive anthocyanidin

圖1 花色素的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 General structure of anthocyanin

葡萄花色苷受到嚴(yán)格的遺傳控制，在不同葡萄品種中分布差異很大。Christophe等[5]研究表明，花色苷只在有色葡萄品種中檢測到，白葡萄品種尚未檢測到，且在黑色品種的果實中花色苷占總酚含量的42%～51%，占主導(dǎo)地位，紅色品種的葡萄花色苷約占總酚含量的21%左右。一直以來，都認(rèn)為白葡萄中沒有花色苷的存在，在分析化學(xué)和生物學(xué)中，這一定性特征被用來定義白葡萄與有色葡萄的區(qū)別。然而，Andreasilva等[3]提出白葡萄品種“西利亞”可以釀制出粉紅色葡萄酒的原因是葡萄皮和果肉中存在少量花色苷。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，Arapitsas等[6]通過色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在白葡萄品種“霞多麗”“長相思”和“雷司令”的果皮中檢測出來痕量的花色苷，這一觀點被證實。

2 葡萄花色苷的修飾作用

2.1 羥基化作用

葡萄花色苷的A、B、C環(huán)上都可以發(fā)生不同程度的羥基化。根據(jù)B環(huán)上羥基化的程度不同，可將花色苷分為單羥基化花色苷（含Pg的花色苷）、二羥基化花色苷（含Cy、Pn的花色苷）和三羥基化花色苷（含Pt、Dp、Mv的花色苷）。一方面，羥基化會使花色苷變得不穩(wěn)定，但同時會讓花色苷的生物活性增強(qiáng)[7]。另一方面，B環(huán)羥基化程度增強(qiáng)，花色苷的藍(lán)色色調(diào)會增加[8]。

2.2 甲氧基化作用

花色苷可以分為非甲氧基化（含Dp、Pg、Cy的花色苷）和甲氧基化（含Pn、Pt、Mv的花色苷）兩種類型。甲氧基化作用發(fā)生在B環(huán)C3和C5位，隨著甲氧基化的增強(qiáng)，花色苷的穩(wěn)定性和紅色色調(diào)都會有所加強(qiáng)[9]。不同品種葡萄中甲氧基化花色苷所占總花色苷的占比各不相同，如歐亞種葡萄中的“天賜”“馬瑟蘭”“美樂”等高達(dá)90%以上[10]，而北美種群的一些葡萄品種不到30%[11]。

2.3 糖基化作用

在葡萄中，糖基通過C3位或C3、C5位的糖苷鍵與花色素相連，分別形成花色素單糖苷和花色素雙糖苷[11]。葡萄花色苷中最常見的糖基是單糖，絕大多數(shù)為葡萄糖[12]。糖基化作用可以提高花色素固有的不穩(wěn)定性，Kim等[13]研究表明，只含花色素單糖苷的葡萄酒比含有花色素雙糖苷的葡萄酒對熱和光的穩(wěn)定性差。前人認(rèn)為，歐亞種葡萄中只存在花色素單糖苷[14]，但隨著研究的深入，在歐亞種葡萄中檢測到了花色素雙糖苷。Milica等[15]選取13個葡萄品種進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)所有葡萄提取物中都含有微量的二甲花翠素-3，5-O-雙葡萄糖苷，其中，就包括歐亞種“美樂”“品麗珠”“西拉”等。邢冉冉[16]選取了具有真實性的赤霞珠葡萄為實驗材料，使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)葡萄果實中含有4種花色素3，5-O-雙葡萄糖苷。此外，圓葉葡萄中只含有花色素雙糖苷[17]。在東亞種群葡萄中，花色素雙糖苷含量較高，占總花色苷的50%～99%不等[18-19]，而北美種群的河岸葡萄中，花色素雙糖苷僅占總花色苷的37%左右[20]。

2.4 ?；饔?/h3>

在自然界中，花色苷的取代糖基（即糖部分）上的羥基（-OHs）通常通過酯鍵被有機(jī)酸?；?，從而產(chǎn)生?；ㄉ铡Ｔ谄咸阎?，這種酰化反應(yīng)一般發(fā)生在葡萄糖的C6位上，可以大大增加花色苷的結(jié)構(gòu)多樣性，有利于穩(wěn)定顏色，還可以提高花色苷的顏色強(qiáng)度[21]。乙酰、香豆酰和咖啡酰是主要的酰化基團(tuán)[22]。其中，香豆?；惢ㄉ掌骄伎偦ㄉ盏?0%～30%[23-26]。乙?；惢ㄉ赵跉W亞品種葡萄比例較高，平均占總花色苷的22%[25]，其他葡萄品種中的乙酰化類花色苷含量較低，如歐美雜交種“摩爾多瓦”乙酰化僅有5%[27]?？Х弱；ㄉ照伎偦ㄉ盏?%以下[24，26，28-29]，其中，“黑比諾”“蜜萄斯”等不含有咖啡?；ㄉ誟25-26]。此外，Cristina等[30]在紅酒中發(fā)現(xiàn)了微量的乳酸?；幕ㄉ铡Ｈ欢?，并非所有品種的葡萄都含有酰化花色苷，如山葡萄和圓葉葡萄[18，20]。

2.5 花色苷衍生色素

單體花色苷在葡萄產(chǎn)品和葡萄酒中不穩(wěn)定，容易氧化。一系列復(fù)雜的機(jī)制有助于提高花色苷的顏色穩(wěn)定性，其中就包括花色苷衍生物的形成，例如吡喃花色苷和聚合花色苷[31]。

吡喃花色苷是最重要的花色苷衍生色素之一，在紅酒的發(fā)酵和陳釀過程中產(chǎn)生，有助于紅葡萄酒向磚紅色方向變化，并能高度促進(jìn)其顏色穩(wěn)定性[32]。吡喃花色苷的基本結(jié)構(gòu)由A、B、C、D四個環(huán)組成，除了基本花色苷的3個環(huán)外，還包括C4位和C5位羥基間通過環(huán)化加成反應(yīng)增加的一個吡喃環(huán)D（圖2）[31]，這個新的吡喃環(huán)D可以將不同種類的取代基連接在C10位上。根據(jù)C10位上的取代基團(tuán)不同，吡喃花色苷分為Vitisins型吡喃花色苷、甲基吡喃花色苷、酚基吡喃花色苷、黃烷醇基吡喃型花色苷和吡喃花色苷二聚體等[33]。其中，Vitisins型吡喃花色苷是原有的花色苷與糖發(fā)酵過程中釋放的某些代謝產(chǎn)物（如丙酮酸，乙酰乙酸和乙醛）通過加成反應(yīng)所形成的產(chǎn)物，在葡萄酒中最豐富[34]。

圖2 吡喃花色苷的基本結(jié)構(gòu)Fig.2 General structures of pyranoanthocyanins

另外，在葡萄酒陳釀過程中，葡萄酒中的單體花色苷與多酚類物質(zhì)發(fā)生聚合作用，生成聚合花色苷，主要有3種類型，直接與黃烷醇連接形成的聚合花色苷、通過烷基與酚類物質(zhì)連接形成的聚合花色苷、與鞣花單寧形成的聚合花色苷等[35]。該過程影響花色苷的平衡，使花色苷變得更加穩(wěn)定，同時還可以保持聚合物中花色苷的顏色。據(jù)報道，在酒精發(fā)酵結(jié)束時，約有25%的花色苷與黃酮類化合物聚合，經(jīng)過一年的陳釀，這一比例將上升到40%以上，直到幾年后出現(xiàn)完全聚合為止，隨著時間的推移，聚合作用將花色苷從紅色轉(zhuǎn)移到棕色，甚至橙色和黃色[36]。

3 葡萄花色苷的生物合成

3.1 葡萄花色苷的生物合成途徑及關(guān)鍵酶

花色苷的生物合成經(jīng)歷苯丙烷類和類黃酮合成途徑（圖3）[12]。其中，柚皮素在黃烷酮-3-羥基化酶（F3H）的催化作用下，生成二氫黃酮醇，進(jìn)而形成三個支路，最終生成六類基本花色苷。其中，類黃酮3′-羥化酶（F3'H）和類黃酮3′，5′-羥化酶（F3′5′H）催化二氫山奈酚羥基化為二氫槲皮素和二氫楊梅素[37]。Robinson等[38]利用F3′H和F3′5′H基因沉默的轉(zhuǎn)基因葡萄來研究這2個基因?qū)ζ咸压麑嵒ㄉ盏挠绊?，結(jié)果表明二者中單一基因表達(dá)量降低并沒有顯著改變葡萄皮中花色苷的含量，而是導(dǎo)致了花色苷組成的變化。當(dāng)編碼F3′5′H基因被沉默時，三羥基化花色苷的比例從86%下降到4%左右，F(xiàn)3′H基因被沉默時，三羥基花色苷比例明顯增加，達(dá)到90%～95%。而當(dāng)兩個基因的表達(dá)量同時降低時，轉(zhuǎn)基因的花色苷含量下降了20%～30%，這說明，F(xiàn)3′H和F3′5′H決定了花色素的B環(huán)羥基化模式，對羥基化花色苷的組成都具有重要意義。

圖3 葡萄中花色苷的生物合成路徑Fig.3 Biosynthesis pathway of anthocyanins in grapes

二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）將二氫黃酮醇還原成相應(yīng)的無色花色素[37]。在花色素合成酶（ANS）的催化作用下，無色花色素可以被氧化成相應(yīng)的有色花色素。其中，ANS屬于OGD家族，被認(rèn)為是第一個將黃酮類物質(zhì)引入花色素分支的關(guān)鍵酶，在花色苷的生物合成中起著關(guān)鍵作用[39]。接著，葡萄花色苷合成的控制位點類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）催化不穩(wěn)定的花色素進(jìn)行糖基化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的花色素單糖苷[40]。研究人員發(fā)現(xiàn)只有3GT在葡萄漿果轉(zhuǎn)色后表達(dá)，而且在有色葡萄中表達(dá)水平比在白葡萄中高很多[41]，由此確定了3GT是決定葡萄漿果顏色的關(guān)鍵基因。甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）催化花青素和花翠素的單糖苷甲基化，生成甲基花青素、甲基花翠素和二甲花翠素的糖苷。這些不同種類的花色素單糖苷在類黃酮-5-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（5GT）和花色素?；D(zhuǎn)移酶（AT）的作用下，轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的花色素雙糖苷和酰基化花色苷[35]。此外，花色素雙糖苷也可在AT的作用下生成?；ㄉ誟42]。

3.2 葡萄花色苷的生物合成調(diào)控

3.2.1 調(diào)節(jié)基因

花色苷作為類黃酮途徑的次級代謝產(chǎn)物，在轉(zhuǎn)錄水平上受到多個調(diào)控基因的復(fù)雜調(diào)控，MYB和MYC是最主要的兩類調(diào)節(jié)因子。其中，MYB相關(guān)基因?qū)ζ咸鸦ㄉ丈锖铣傻恼{(diào)控起到至關(guān)重要的作用，主要調(diào)節(jié)3GT的表達(dá)[43]。

目前，從葡萄中分離出來的MYB相關(guān)基因主要有mybA、mybB、mybC、mybD、mybE、mybF、mybG及mybH等[42]。VvmybA基因型是決定葡萄果皮顏色多樣性的主要因素，主要包括VvmybA1基因型、VvmybA2基因型和VvmybA3基因型[44]。其中，VvmybA1是決定花色苷合成和葡萄呈色的主要基因，具有轉(zhuǎn)錄組織特異性，只在漿果皮中表達(dá)，包括VvmybA1a、VvmybA1b和VvmybA1c三種等位基因[45]。VvmybA1a的5′側(cè)翼區(qū)域有一個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Gret1，它會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子功能喪失，不能合成花色苷[46]，因此，自然界中出現(xiàn)了白葡萄。VvmybA1b和VvmybA1c都具有轉(zhuǎn)錄功能，VvmybA1c不含有Gret1，VvmybA1b中含有一個單拷貝的長末端重復(fù)序列（solo-LTR）作為功能調(diào)節(jié)基因[47]。

除VvmybA1外，來自葡萄的另外兩個VvmybA調(diào)節(jié)基因家族VvmybA2和VvmybA3也已被克隆和鑒定[46]。據(jù)報道，VvmybA1和VvmybA2功能極其相似，都能調(diào)節(jié)3GT的表達(dá)，促進(jìn)葡萄的顏色積累，VvmybA3的功能未知，還需進(jìn)一步探究[45]。此外，部分MYB轉(zhuǎn)錄因子是花色苷生物合成途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子，例如mybL2、myb4[48-49]。

3.2.2 MYB單倍型

MYB單倍型是影響葡萄果皮花色苷含量的主要遺傳因素，由于顏色位點上的兩個相鄰的MYB等位基因是共同遺傳的，因此，將它們稱為MYB單倍型（圖4）[50]。單倍型HapC-N是最原始的MYB單倍型，由功能性VvmybA2r和VvmybA1c等位基因組成。HapC-Rs包含非功能性VvmybA2w和功能性VvmybA1c。HapA由非功能性的VvmybA1a和VvmybA2w組成。HapB源于HapA，包含功能性的VvmybA1b和非功能性的VvmybA2w。Amanda等[51]和Hiroshi等[52]研究表明，黑皮“黑皮諾”變?yōu)榘灼ぁ鞍灼ぶZ”顏色轉(zhuǎn)變的原因是由于HapC-N中的VvmybA1c和VvmybA2r等位基因的缺失，這就導(dǎo)致了HapD成為無功能的單倍體。而“紅高”果皮的顏色恢復(fù)是由于VvmybA1基因座上功能性VvmybA1BEN等位基因的出現(xiàn)，導(dǎo)致HapG成為有功能的單倍體，并推測功能性VvmybA1BEN等位基因是VvmybA1a與VvmybA3同源重組的結(jié)果。

圖4 葡萄中MYB單倍型在顏色位點的進(jìn)化模型Fig.4 Model of the evolutionary of MYB haplotypes at the color locus in Vitis species

顏色位點的功能性單倍型的數(shù)量影響葡萄果皮中的花色苷積累。研究表明，白色品種葡萄的非功能性HapA（HapA/HapA）是純合的，而有色葡萄至少包含一種功能性單倍型。此外，具有兩個功能性單倍型的葡萄中花色苷含量高于僅具有單個功能性單倍型的葡萄[53]。果皮中花色苷含量高的品種（如“司特本”、“美樂”和“早熟坎貝爾”）都包含兩個功能性單倍型，所有具有一個功能性MYB單倍型的品種（如“利扎馬特”和“粉多加意”），花色苷含量較低[50]。

3.2.3 植物激素

葡萄中花色苷的累積與脫落酸（ABA）緊密相關(guān)，Jeong等[54]研究結(jié)果表明，ABA可以促進(jìn)葡萄果皮中CHS、CHI、DFR、F3H、ANS、3GT和VvmybA1等基因的表達(dá)，促進(jìn)花色苷的合成。此外，通過外施ABA可以提高葡萄果實花色苷含量，而不會對收獲葡萄的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[55-56]。曹慕明等[57]研究表明ABA能顯著提高“巨峰”中的花色苷，綜合各項指標(biāo)，250 mg·L-1的ABA處理的效果最優(yōu)。馬文婷等[58]研究結(jié)果表明，300 mg·L-1的ABA處理增加了“蛇龍珠”葡萄果實中花色苷的含量且改變了基本花色苷的比例，其中，花翠素與花青素的比例顯著升高。

乙烯（ETH）作為一種植物激素，在果實成熟前大量合成，可加速葡萄中花色苷的積累。在實際操作中，經(jīng)常用乙烯處理葡萄漿果刺激CHS、F3H、ANS、DFR、LDOX和3GT等相關(guān)基因的長期表達(dá)，從而促進(jìn)花色苷的合成[59]。于淼等[60]研究表明，乙烯可以提高VlmybA1和VlmybA1-2的轉(zhuǎn)錄水平。此外，乙烯處理可以增加花色苷的含量，Human等[61]研究表明，施用乙烯可以提高甲基花青素的含量，同時花色素單糖苷的比例也會上升。

茉莉酸甲酯（MeJA）是內(nèi)源性植物調(diào)節(jié)劑，在生物脅迫下充當(dāng)信號分子，并參與觸發(fā)花色苷的合成，進(jìn)而促進(jìn)葡萄果實著色。在實際應(yīng)用中，經(jīng)常將MeJA噴施到葡萄葉面上，可以激活PAL和促進(jìn)DFR、ANS、UFGT、MYB等基因的表達(dá)[62]。此外，Portu等[63]研究表明，經(jīng)過MeJ處理的葡萄可獲得較高花色苷濃度的葡萄酒，葡萄酒中的總花色苷含量增加，其中，單體花色苷及?；ㄉ沼酗@著上升。

此外，一些植物激素對葡萄漿果中花色苷的積累有負(fù)面影響。例如，將2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）或1-萘乙酸（1-NAA）應(yīng)用于葡萄漿果，可抑制花色苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)以及調(diào)節(jié)因子VvmybA1，從而抑制花色苷的合成和積累[64]。

3.2.4 環(huán)境

葡萄花色苷的生物合成除了由自身基因型決定外，還會受到很多外部環(huán)境因素的影響，如光照、溫度、水分等。這些都會影響結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，改變葡萄花色苷的含量和組成，從而對其合成與積累存在直接或間接的影響[65]。

與其他水果不同，葡萄在有無光照的條件下均能在果皮中積累花色苷。Spayd等[66]表明，光照充足的葡萄中花色苷含量高于光照較弱的葡萄，但當(dāng)暴露強(qiáng)度超過一定限度時，花色苷含量降低[67]。同樣，遮光處理會在一定程度上造成CHS、F3H和VlmybA1在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量降低，從而減少花色苷的累積[68]。與含量相比，光照對花色苷的組成影響更大。經(jīng)過遮光處理的葡萄含有更高比例的三羥基化花色苷和?；ㄉ誟69]。因此，為了最大限度地提高葡萄漿果中花色苷的產(chǎn)量，適度的陽光照射是必要的，但不同品種之間的程度不同。此外，光質(zhì)和光照時間的長短也會影響花色苷的累積，如紫外線會促進(jìn)花色苷的合成，長日照比短日照更有利于花色苷的累積[70]。

除了光照，適當(dāng)?shù)臏囟龋?5℃左右）會促進(jìn)花色苷的積累[71]。Gao等[72]研究表明，葡萄內(nèi)源ABA受溫度的影響，高溫狀態(tài)下會使其降低，從而影響VvmybA1的表達(dá)，導(dǎo)致花色苷的合成受到抑制。Chiara等[73]研究表明，低溫處理會在一定程度上促進(jìn)PAL、3GT的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花色苷的含量，經(jīng)驗證，低溫條件下的葡萄總花色苷含量是高溫處理的2倍。同樣，溫度也會改變葡萄花色苷的組成，高溫增加香豆?；疢v、Pt和Dp衍生物的含量，而低溫和遮陰則導(dǎo)致Cy和Pn衍生物含量升高[65-66]。

水分不足的情況下會使總花色苷含量提高30%～50%，但葡萄脫水過多，花色苷的含量反而下降[74]。在實際操作中，研究人員經(jīng)常通過水分脅迫的方法來管理葡萄果園的水分狀況，從而對葡萄花色苷進(jìn)行調(diào)控。Yang等[75]通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)相結(jié)合，表明水分脅迫可以促進(jìn)CHS、F3H、3GT等一般生物合成基因的表達(dá)進(jìn)而使花色苷和合成花色苷的物質(zhì)含量升高。另外，還可以刺激F3′5′H、OMT等與B環(huán)修飾有關(guān)的基因，豐富相關(guān)羥基化和甲氧基化花色苷的含量[76]。此外，水分脅迫可以促進(jìn)Vvmyb1、Vvmyba1、Vvmyb5a和Vvmybc的表達(dá)，從而促進(jìn)葡萄花色苷的累積[77]。

4 結(jié)語

在國內(nèi)，由于葡萄具有資源優(yōu)勢、可綜合利用、應(yīng)用領(lǐng)域廣的特點，葡萄中的花色苷具有廣大的開發(fā)前景[78]。但是，目前對葡萄花色苷的研究還不夠全面。在轉(zhuǎn)錄因子方面，科研人員主要對VvmybA1基因型進(jìn)行了比較全面的研究，對存在于葡萄中的其他MYB轉(zhuǎn)錄因子研究不足，值得深入研究。目前，5GT轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的報道較少，根據(jù)3GT的推測，MYBA轉(zhuǎn)錄因子很有可能調(diào)控5GT的表達(dá)，或者還存在其他調(diào)節(jié)基因?qū)ｉT調(diào)控5GT的表達(dá)，仍需進(jìn)一步研究。外部因素（植物激素和環(huán)境因素）對花色苷生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響已有大量報道，但這些報道的結(jié)論各不相同，不能相互關(guān)聯(lián)，這些結(jié)果都有待驗證。