MicroRNA在昆蟲中的研究進展

鄧昌鑫，何倩毓

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319）

MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為21～24 nt的非編碼RNA分子，它能夠通過抑制靶基因的翻譯或降解靶基因的mRNA來參與基因轉錄后的調(diào)控過程。研究表明，miRNA通過對基因的調(diào)控，在組織生長、生殖細胞發(fā)育、激素作用以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和活動等幾乎所有的生物學過程中均發(fā)揮著重要的作用[1]。動物中大概約有50%以上編碼蛋白基因的表達受到miRNA的調(diào)控。miRNA最初是由Lee等[2]在研究秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans中發(fā)現(xiàn)的，它的名稱是lin-4，長度為22 nt。2000年，另一個小分子RNA—let-7被發(fā)現(xiàn)[3]。let-7可以與lin-41基因的mRNA 3'端非翻譯區(qū)（3'untranslation region，3'UTR）結合，從而抑制lin-41基因的表達。隨著更為深入的研究，人們發(fā)現(xiàn)這是一類長約22 nt，能夠使靶基因發(fā)生轉錄后沉默的小分子非編碼RNA，于是將其命名為microRNA。

miRNA與siRNA（small interfering RNA）均具有沉默靶基因功能，但與siRNA不同的是：siRNA一般都是外源引入的，而miRNA一般是生物體自身產(chǎn)生的[4]。近幾年的研究表明，miRNA在昆蟲中廣泛存在，是調(diào)節(jié)昆蟲變態(tài)發(fā)育與生殖的重要因子。因此，在簡要介紹miRNA生物合成、調(diào)控機制及其靶基因和驗證的基礎上，著重介紹近年來miRNA在昆蟲變態(tài)發(fā)育與生殖調(diào)控中的研究進展。

1 miRNA的生物合成

miRNA的生物合成一般可分為4個過程：轉錄、細胞核加工、核輸出、細胞質(zhì)加工。在RNA聚合酶II的參與下，miRNA首先在細胞核中被轉錄形成miRNA的初級轉錄產(chǎn)物pri-miRNA。隨后pri-miRNA被核糖核酸酶Drosha和Pasha識別并剪切，形成發(fā)夾狀的前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA被核轉運受體exportin-5識別，與exportin-5及其輔因子RanGTP形成復合體后被轉運到細胞質(zhì)，隨后被核糖核酸酶Dicer剪切形成3′端帶有2個游離核苷酸的miRNA雙鏈復合體[5-6]。該miRNA雙鏈復合體中的一條鏈（miRNA）與Argonaute（Ago）一起構成RNA介導的沉默復合物（RISC）[7-9]，而另一條鏈（miRNA*）通常被降解（圖1）[10-12]。但最新的研究發(fā)現(xiàn)miRNA*并不會被降解，而是可通過與不同的Ago蛋白結合后，和成熟的miRNA一樣在調(diào)控基因表達中發(fā)揮著重要功能[13]。

圖1 miRNA的生物合成過程（引自文獻[12]）Fig.1 miRNA biosynthesis process（cited from literature[12]）

2 miRNA對靶基因的調(diào)控機制

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對靶基因表達水平的調(diào)控主要通過剪切降解和抑制翻譯等作用方式實現(xiàn)。miRNA對靶基因調(diào)控的主要過程是RISC復合物在miRNA的指導下通過堿基互補配對與靶基因的mRNA的3'UTR區(qū)結合后，再通過阻遏翻譯或降解靶基因mRNA，實現(xiàn)在轉錄后水平上抑制靶基因的表達[14]。然而，miRNA究竟是通過阻遏翻譯還是降解靶基因mRNA來實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控主要取決于miRNA與其作用靶標的結合程度。當miRNA與其靶標mRNA完全或近乎完全互補時，主要引起mRNA的降解；當兩者不完全互補時，主要是通過抑制靶標mRNA的翻譯起作用[15]。在動物中，miRNA主要通過翻譯抑制的作用方式來實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控，而在植物中，其主要作用方式是對靶基因mRNA進行降解。然而，近些年在植物中發(fā)現(xiàn)了抑制靶基因mRNA翻譯的miRNA[16-17]，動物包括昆蟲中也存在靶基因mRNA被降解的情況[18-21]。果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA介導的基因沉默首先傾向于抑制翻譯，而后通過mRNA的腺苷酸化和衰變而得以鞏固[22]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA與其靶基因的結合關系并非唯一：一個miRNA可以作用于一個或幾個不同的靶基因mRNA，而一個靶基因mRNA序列上也可以存在多個miRNA的靶位點[23-24]。此外，miRNA作為一類重要的轉錄后調(diào)控因子，本身也受其他基因的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在一些miRNA的啟動子區(qū)域存在著眾多轉錄因子的結合位點，而這些轉錄因子又是miRNA的主要靶標。不僅如此，這些轉錄因子的啟動子區(qū)域又存在著響應激素的活性位點，這樣就構成了一個精妙的反饋通路，增強了生物對外界環(huán)境的適應能力[25-27]。如果蠅miR927可通過抑制JH初級反應基因Kr-h1（Krüppel homolog1）的表達而調(diào)控果蠅幼蟲至蛹的變態(tài)發(fā)育，同時miR-927自身的表達又受到JH及其受體Met的抑制，從而形成正反饋調(diào)控機制[27]。由于miRNA對mRNA調(diào)控及自身調(diào)控方式的多樣化，使miRNA的功能更豐富，也讓miRNA對靶基因的調(diào)控變得更為復雜，同時為基因的調(diào)控方式和功能的研究帶來了新的思路、開辟了新的領域。

3 miRNA及其靶基因的預測及驗證

有關miRNA的鑒定方法，目前應用最廣的是生物信息學研究法。生物信息學預測miRNA的方法，首先是根據(jù)miRNA的結構特征在基因組序列中預測可能的miRNA。這些算法根據(jù)miRNA前體序列的發(fā)夾結構特征在基因組非編碼區(qū)域和非重復區(qū)域中進行miRNA預測，然后根據(jù)物種的進化保守性過濾候選miRNA。其中，已知的miRNA前體在搜索算法中起著重要作用，利用已知的miRNA的結構可用于程序學習過程的訓練從而區(qū)分真實的預測和假陽性。目前，成千上萬的miRNA通過生物信息學方法已被預測出。隨著miRNA數(shù)量的不斷增多，許多數(shù)據(jù)庫也隨之建立，其中miRBase[28]（http：//www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫是miRNA的主要在線存儲庫，數(shù)據(jù)庫中的每個條目均代表miRNA轉錄本的預測發(fā)夾部分，其中包含有關成熟miRNA序列的位置和序列的信息。除miRBase數(shù)據(jù)庫外，Rfam[29]是用于RNA注釋的系統(tǒng)，其中包含miRNA家族信息；miRIAD[30]被設計來托管基因內(nèi)編碼的miRNA及其宿主基因的信息；而mirtronPred[31]則可以從內(nèi)含子序列中預測mirtrons；mirSTP[32]則是用于識別miRNA轉錄起始位點（transcription start sites，TSS）的程序；MetaMirClust[33]提供有關miRNA簇及其保存的全面信息。有通過生物信息學方法預測出miRNA后，可進一步通過實驗方法，例如高通量測序等方法鑒定目標miRNA。這種方法比用經(jīng)典正向遺傳學識別新型miRNA的方法要快得多。隨著下一代測序技術（Next-Generation Sequencing，NGS）的發(fā)展，miRNA現(xiàn)在正以驚人的速度、系統(tǒng)地被發(fā)現(xiàn)。通過這些生物實驗手段發(fā)現(xiàn)的miRNA對計算方法發(fā)現(xiàn)的miRNA進行了極大的補充。

發(fā)現(xiàn)miRNA，確定其靶標并進一步推斷miRNA功能一直是理解miRNA生物學過程及其在疾病發(fā)展中的作用的關鍵策略。在缺乏高通量識別miRNA靶標的生物學方法的情況下，許多miRNA靶標預測的計算方法已被開發(fā)。例如：mirSVR[34]，PicTar[35]，TargetScan[36]等。不同的miRNA靶標預測算法使用不同的技術和標準來預測靶標，包括堿基配對、靶標位點的進化保守性等。通常，miRNA靶標預測算法使用的模式和標準的不同會對算法的輸出和性能產(chǎn)生重大影響。選擇標準的微小變化會導致預測中的巨大差異，靶標預測算法中性能最佳的是TargetScan和PicTar[37]，他們的預測主要限于3'UTR中的保守位點，但其假陽性率為68%[38]。在昆蟲miRNA研究中，靶基因預測主要使用的工具有miRanda[39-43]（http：//www.microrna.org/microrna/），microT-CDS[44]（http：//www.microrna.gr/microT），RNAhybrid[45]（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/mahybrid），TarBase[46]（http：//carolina.imis.athena-innovation.gr/），RNA22[46]（https：//cm.jefferson.edu/rna22）以及TargetScan[47]（http//：www.targetscan.org/）等。Alexiou等[48]做過一項評估，miRanda[49]，miRBase[50]，PicTar，PITA[51]，TargetScan這些算法的精度為50%左右，靈敏度范圍為6%～12%。因此，進行預測時可以用多個軟件共同預測來提高準確率。盡管這些預測工具有其局限性，但在實驗中也有著廣泛的應用。目前這些預測工具根據(jù)基因組數(shù)據(jù)已完成了許多物種的miRNA靶標預測，并將結果儲存到數(shù)據(jù)庫，使得研究人員可以在數(shù)據(jù)庫進行下載或查詢。最近，一些新穎的鑒定miRNA靶標的生化方法已被開發(fā)，從而可深入了解miRNA的結合位點。例如，通過交聯(lián)免疫沉淀法（HITS-CLIP）分離RNA的高通量測序技術，可直接鑒定miRNA靶標[52]。隨著大量miRNA被鑒定以及miRNA靶基因被預測，有關miRNA的研究已迅速轉向推斷miRNA在特定生物學條件下的功能和調(diào)控機制。

4 miRNA在昆蟲變態(tài)發(fā)育中的作用

昆蟲的變態(tài)主要由保幼激素（juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）協(xié)同調(diào)控。通常，20E促進蛻皮，而JH阻止變態(tài)；因此，當20E與JH共同作用時，使得昆蟲保持幼蟲狀態(tài)，而在JH幾乎不存在的情況下20E會引發(fā)變態(tài)[53]。在分子水平上，這兩種激素都是通過一系列轉錄因子來實現(xiàn)對昆蟲變態(tài)發(fā)育的調(diào)控。通常情況下，20E與其異源二聚體受體蛻皮激素受體（EcR）和超螺旋體（USP）結合后形成20E受體復合物，該復合物隨后激活下游轉錄因子的級聯(lián)表達，最終誘導昆蟲從幼蟲到蛹的變態(tài)[54-55]。保幼激素則通過其核受體異源二聚體Met（Methoprene tolerant）/SRC（steroid receptor coactivator）啟動轉錄因子Kr-h1的表達，Kr-h1抑制Br（Broad）表達而發(fā)揮阻止變態(tài)或“維持原狀”的作用[56-57]。Kr-h1也可通過抑制E93的表達而阻止成蟲特征的出現(xiàn)[58-59]。簡而言之，在最后一個幼齡期開始時，JH的產(chǎn)生停止，Kr-h1轉錄下降，E93的表達增加，這些變化共同促進了變態(tài)的發(fā)生。

近年來，昆蟲中miRNA的研究表明miRNA在調(diào)節(jié)昆蟲變態(tài)方面也具有重要的作用[60]。目前，果蠅中已鑒定獲得8個與變態(tài)相關的miRNA（miR-100、miR-125、let-7、miR-34、miR-14，miR-8，miR-965，miR-252），其中miR-100、miR-125和let-7的表達受20E和Br的促進，而miR-34受20E和Br的負調(diào)控。JH則正好具有與20E相反的作用[61]。研究發(fā)現(xiàn)miR-100、miR-125和let-7缺失的果蠅突變體在變態(tài)時出現(xiàn)翅發(fā)育缺陷，且成蟲的神經(jīng)肌肉具有典型的幼蟲特征[62-63]。同樣，miR-252的表達也受20E的促進，其在果蠅蛹和成體發(fā)育階段也有著重要的作用。在果蠅幼蟲脂肪體中過量表達miR-252導致脂肪體細胞的大小和數(shù)量降低，從而導致幼蟲及成蟲蟲體變小。此外，miR-252的過表達也會引起幼蟲到蛹轉變的延遲[64]。家蠶中，Ling等[65]利用miRNA海綿（miRNA sponge）技術以及UAS/Gal4系統(tǒng)超表達let-7 sponge降低let-7的表達量，導致家蠶Bombyx mori在幼蟲蛻皮以及幼蟲至蛹轉變過程中出現(xiàn)發(fā)育停滯，并且20E信號通路中的FTZ-F1（ftz transcription factor 1）和E74的表達量在let-7 sponge轉基因家蠶中顯著上升，表明let-7可能通過作用于FTZ-F1和E74調(diào)控家蠶的蛻皮和變態(tài)。此外，miRNA可調(diào)控EcR（ecdysone response）的表達而反向調(diào)控蛻皮激素的信號傳導形成正反饋調(diào)節(jié)。如家蠶中鑒定發(fā)現(xiàn)miR-281通過抑制20E受體EcR-B的表達而參與調(diào)控家蠶的變態(tài)發(fā)育。在家蠶四齡幼蟲至蛹的發(fā)育階段，馬氏管中miR-281與EcR-B的表達模式正好相反，且miR-281的表達又受20E的抑制，這就導致在變態(tài)過程中，由于20E的抑制，miR-281的表達顯著降低，使得EcR-B達到較高的表達水平，最終促進幼蟲至蛹的轉變[66]。在不完全變態(tài)昆蟲德國小蠊Blattella germanica和飛蝗Locusta migratoria中的研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾miRNA合成途徑中的核糖核酸酶Dicer-1的表達，可抑制末齡若蟲正常羽化成成蟲，導致末齡若蟲蛻皮后形成超齡若蟲或若蟲-成蟲中間體，說明miRNA在不完全變態(tài)昆蟲的變態(tài)發(fā)育中也發(fā)揮重要的作用[67-68]。高通量測序鑒定發(fā)現(xiàn)在德國小蠊倒數(shù)第二齡期和末齡若蟲期存在61個典型的miRNA，其中miR-253在倒數(shù)第二齡若蟲期高表達而在末齡若蟲期表達量顯著降低，而let-7、miR-100以及miR-125的表達模式正好相反[69]。降低let-7和miR-100的表達可導致成蟲翅明顯變小、翅脈畸形，類似于Br缺失的表型[70]。Lozano等[71]研究發(fā)現(xiàn)Dicer-1的缺失導致Kr-h1的表達升高，而若在Dicer-1表達降低的同時也干擾Kr-h1的表達則可使德國小蠊正常變態(tài)。進一步研究表明Kr-h1的3′UTR中含有miR-2的結合位點，對Dicer-1缺失的蟲體添加miR-2類似物可保證幼蟲至成蟲的正常變態(tài)，說明miR-2通過降解Kr-h1的mRNA參與JH信號通路而調(diào)控德國小蠊的變態(tài)發(fā)育。近期，Song等[72]在飛蝗中的研究發(fā)現(xiàn)let-7和miR-278可通過與Kr-h1的CDS區(qū)域結合而降低Kr-h1的表達，導致飛蝗若蟲提前變態(tài)以及成蟲卵巢的發(fā)育和卵母細胞的成熟受阻。miRNA除了通過作用激素信號通路分子調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育，最新家蠶中的研究發(fā)現(xiàn)miR-14可通過同時靶向20E上游合成途徑中的相關重要分子，快速降低蛻皮后蟲體20E的滴度，實現(xiàn)對家蠶蛻皮發(fā)育的調(diào)控[73]。

5 miRNA在昆蟲生殖過程中的作用

目前有關miRNA調(diào)節(jié)昆蟲生殖的報道還比較少，研究成果主要是通過RNA干擾Dicer1、Ago1等與miRNA生物合成及功能執(zhí)行有關的基因，以及利用高通量測序鑒定與生殖相關的miRNA，然后通過預測其靶基因進而分析miRNA的功能，構建miRNA與mRNA的相互作用網(wǎng)絡。在果蠅中對Dicer1進行缺失突變，阻斷miRNA生物合成途徑，能夠顯著抑制果蠅卵母細胞的成熟，說明miRNA在果蠅卵母細胞成熟過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[74]。Ago1在果蠅卵母細胞及卵泡細胞中表達水平較高，Ago1缺陷型和缺失突變個體的卵小管僅含8個滋養(yǎng)細胞而沒有卵母細胞，這與Dicer1突變體的表型相似，表明Ago1以及依賴于Ago1的miRNA是果蠅卵母細胞形成所必需的[75]。果蠅中dFmr1蛋白能抑制卵巢中GSCs的分化從而維持其干細胞特性，bantam能夠與dFmr1蛋白相互作用抑制GSCs分化，這對卵巢中GSCs的維持起著重要的作用[76]。近年來，對其他昆蟲的研究也表明miRNA在昆蟲生殖過程中發(fā)揮重要作用。埃及伊蚊Aedes aegypti中的研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪體的離體培養(yǎng)基中同時添加20E和氨基酸能促進miR-275的表達，而單獨使用20E或氨基酸并不能達到類似的效果。利用miRNA抑制劑干擾miR-275的表達，可導致蚊子出現(xiàn)對血液的消化障礙，進而影響卵的成熟[77]。同樣，伊蚊中特異性的miRNA-1890可通過作用于JH調(diào)控的絲氨酸蛋白酶JHA15而調(diào)控卵巢發(fā)育和卵黃沉積[78]。與miRNA在昆蟲變態(tài)發(fā)育中的研究相比，昆蟲生殖階段miRNA的功能研究仍處于起步階段。目前依然是以模式昆蟲果蠅為主，在非模式昆蟲中也是以miRNA的大規(guī)模測序、生物信息學分析和靶基因預測為主。這表明對昆蟲生殖相關的miRNA研究有待進一步的深入，包括研究昆蟲種類的廣度，miRNA靶基因的鑒定，miRNA功能的研究，miRNA的調(diào)控機制等。

6 小結與展望

有關昆蟲miRNA的研究受到了越來越多的重視，在不同種類昆蟲中發(fā)現(xiàn)了一系列的miRNA。從miRNA的生物合成，miRNA對靶基因的調(diào)控機制，miRNA及其靶基因預測以及miRNA在昆蟲變態(tài)發(fā)育和生殖過程中的作用等方面的研究進行綜述。目前，miRbase數(shù)據(jù)庫收錄了來自不同物種的28 645條miRNA[79]，與其他物種相比，昆蟲miRNA的報道還比較少，已闡明功能的昆蟲miRNA更少。此外，有關昆蟲miRNA的研究目前主要集中于少數(shù)幾個昆蟲，如果蠅、家蠶、埃及伊蚊、德國小蠊、飛蝗等，這可能是因為許多非模式昆蟲缺乏基因組信息，遺傳學手段受限，以及miRNA自身功能的特點與研究的技術局限等原因。相信隨著昆蟲miRNA測序技術的發(fā)展和昆蟲基因組信息的不斷豐富，更多的miRNA將會被鑒定，miRNA在昆蟲發(fā)育過程中的作用也將被進一步揭示。近幾年，研究人員已通過構建miRNA轉基因動物來研究相關基因的功能，取得了一些重要的進展[80-81]。有許多研究表明昆蟲miRNA的序列結構保守性較強。如bantam，在果蠅的翼盤和眼部發(fā)育中具有促進細胞增殖的作用[82]，后來在許多其他昆蟲中也被發(fā)現(xiàn)，它的成熟序列在不同昆蟲中的同源性高達90%，僅僅會在第10～12位核苷酸會產(chǎn)生差異。因此許多昆蟲中發(fā)現(xiàn)的高度特異性miRNA可以作為重要的靶標，一方面可為農(nóng)業(yè)害蟲的防治和病毒攜帶媒介昆蟲的預防提供全新的策略；另一方面，也為益蟲抗逆新品種提供有益的參考。此外，昆蟲中保守家族miRNA功能的研究將為哺乳動物及人類相關miRNA功能的研究提供重要的依據(jù)，對人類疾病有關miRNA方面研究有著十分重要的作用。所以說miRNA有著十分光明的前景。希望可以為之后的昆蟲miRNA的研究提供借鑒和參考。