針刺對腦梗死大鼠骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表達的影響

楊光至 施靜 馬磊 周以皓 劉梅芳 黃麗君

摘要：目的 探討針刺對腦梗死大鼠骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表達的影響。方法 SD大鼠隨機分為空白組、模型組、頭部穴位組、軀體穴位組、頭部+軀體穴位組，每組15只。采用線栓法建立腦梗死大鼠模型。取穴“百會”、“風府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等，行平補平瀉手法。采用Bederson法評估大鼠的行為學變化，采用Western Blotting法檢測24h時各組大鼠腓腸肌、前肢肌中Nestin、Cytochrome C蛋白的相對表達量。qRT-PCR法檢測0、24、48h時基因的相對表達量。結(jié)果 與模型組相比，頭部+軀體穴位組行為學評分在0、24、48h時均有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組、頭部穴位組在24、48h時均有顯著性差異（P<0.05）;與模型組比較，頭部+軀體穴位組、軀體穴位組腓腸肌Nestin基因在0、24、48h時的表達量均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在24、48h有顯著性差異（P<0.05）;頭部+軀體穴位組、軀體穴位組腓腸肌Cytochrome C基因表達在0、24、48h時的表達均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在0、24h有顯著性差異（P<0.05）;與模型組比較，頭部+軀體穴位組前肢肌Nestin基因表達在48h有顯著性差異，軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在24h有顯著性差異（P<0.05）;頭部+軀體穴位組、頭部穴位組前肢肌Cytochrome C基因在0、24h時的有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05）;各組腓腸肌、前肢肌中Nestin、Cytochrome C蛋白在24h時的表達差異與基因均相一致。結(jié)論 針刺可不同程度的上調(diào)腓腸肌、前肢肌Nestin蛋白及基因表達，下調(diào)Cytochrome C蛋白及基因表達，促進神經(jīng)功能的修復，改善腦梗死大鼠骨骼肌的功能。

關(guān)鍵詞：Nestin;細胞色素C;腦梗死;骨骼肌;針刺

中圖分類號：R246 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）11-0071-05

腦梗死是由腦組織局部血液供應障礙，引起缺血、缺氧進而病變壞死的疾病，為臨床常見病、多發(fā)病，具有起病急、進展快的特點，已成為威脅我國中老年人群身體健康和生命的主要疾病[1]。研究顯示，腦梗死可引起不同程度的上運動神經(jīng)元損害，60%以上的患者會出現(xiàn)偏癱、失語等后遺癥，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[2]，而肌群功能減弱及廢用性萎縮是造成偏癱、失語發(fā)生的主要原因，因此，探索有效的防治方法已成為目前腦梗死患者康復亟需解決的關(guān)鍵問題。巢蛋白（Nestin）是一種神經(jīng)肌肉接頭相關(guān)蛋白，研究顯示，在缺血性損傷神經(jīng)修復過程中，Nestin陽性細胞增加，并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，從而有利于神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能恢復[3]。細胞色素C是線粒體中一種可溶性促凋亡蛋白，在組織缺血時，釋放到胞漿后激活線粒體凋亡程序，是多種細胞凋亡的共同途徑，研究顯示，抑制細胞色素C的表達可對缺血性損傷后神經(jīng)元凋亡發(fā)揮抑制作用[4-5];針刺療法在治療腦梗死后遺癥方面有著顯著療效，然而既往針刺相關(guān)的基礎(chǔ)研究多側(cè)重于神經(jīng)可塑性及恢復神經(jīng)細胞功能方面[6]，而忽略了對骨骼肌細胞增殖及凋亡及功能研究，尤其對針刺干預的具體機制闡述不足;本研究通過觀察針刺對腦梗死大鼠骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表達水平的影響，旨在揭示針刺在恢復肌肉功能及神經(jīng)修復中的作用機制，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級健康雄性SD大鼠，體重240g，共100只，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（浙）2014-0008。實驗前在實驗中心適應性喂養(yǎng)1周，環(huán)境條件通風、隔音、自然光照，溫度18～26℃、相對濕度50%～60%，自由飲食。對實驗動物的各項處理均嚴格按照2006版《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》中規(guī)定執(zhí)行。

1.2 主要儀器與試劑 水浴鍋（XMTD-6000，上海宜昌儀器紗篩廠）;低溫離心機（湘儀實驗儀器廠）;實時熒光定量（realtime-PCR）儀（美國ThermoFisher儀器有限公司）;漩渦振蕩儀（XH-C，金壇市醫(yī)療儀器廠）;針灸針（0.25 mm×13 mm，天和醫(yī)治器械有限公司）。Anti-Nestin抗體（Thermo Fisher Scientific）、Anti-Cytochrome C抗體（Thermo Fisher Scientific）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（北京碧云天公司）、Trizol柱純化總RNA試劑盒（simgen）;Fast 1st strand cDNA Synthesis Kit（with gDNase）（simgen）、2×SYBR Green PCR Mix（simgen）、50×ROX Reference Dye（simgen）。

1.3 模型制備 腦梗死模型大鼠采用孟宜良的線拴法標準步驟進行制備，在成功結(jié)扎頸外動脈遠心端和頸總動脈近心端后，大腦中動脈局灶性腦缺血模型即成功[7]，大鼠在自然蘇醒后，依照Zea-Longa的5級評分標準評估神經(jīng)障礙情況[8]，篩選合格模型用于下一步實驗。

1.4 動物分組 選取未造模大鼠作為空白對照組，將造模成功的模型大鼠隨機分為模型組、頭部穴位組、軀體穴位組、頭部+軀體穴位組，每組15只。再將各組中模型大鼠2次分組，分為3個亞組用于不同時間點的檢測（0、24、48h），每組5只。均給予正常飲食喂養(yǎng)。

1.5 針刺方法 取穴和針刺手法參照華興邦等研制的《大鼠穴位圖譜》，在動物清醒狀態(tài)下，選用動物一側(cè)“百會”、“風府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等穴，給予針刺捻轉(zhuǎn)1 min，頻率（80±5）次/min，平補平瀉：“百會”后斜刺2 mm，“風府”下斜刺2 mm，“后三里”直刺7 mm，“前三里”直刺5 mm，“環(huán)跳”直刺7 mm，“后會”斜刺2 mm，“陽陵泉”直刺5 mm。針刺1次，留針30 min。所有針刺操作由同一人進行?？瞻捉M與模型組不予針刺。

1.6 行為學評分 在針刺治療后0、24、48h時參照Bederson等[9]改良方法對大鼠行為學變化進行評估。分值為0～4分，0分：未見行為缺陷;1分：前肢屈曲，不能完全伸展;2分：前肢屈曲伴側(cè)推抵抗力下降，無轉(zhuǎn)圈行;3分：前肢屈曲伴側(cè)推抵抗力下降，伴有自發(fā)性旋轉(zhuǎn);4分：意識障礙，不能自主行走。

1.7 標準取材及檢測 針刺干預完成后，在對應時間點采用脊椎脫臼法快速處死大鼠，分離前肢肌、腓腸肌針刺局部的骨骼肌，裝于凍存管置于液氮中備測。采用Western Blotting法檢測針刺治療后24h時前肢肌、腓腸肌組織中Nestin、Cytochrome C蛋白的表達：按蛋白提取試劑盒說明提取Nestin、Cytochrome C和β-actin的總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進行濃度測定。分別加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗孵育1 h，TBST洗滌，再加入ECL化學發(fā)光試劑進行顯影。采用qRT-PCR法檢測組織中Nestin、Cytochrome C基因的表達：（1）RNA提?。喝〖〗M織稱重后加入裂解液，充分研磨勻漿后，用嚴格按照Trizol試劑盒提取RNA，具體步驟參照說明書。（2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：取2 μg上述提取的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，稀釋10倍后分裝備用。（3）PCR擴增：按照實時熒光定量試劑盒操作步驟，上機進行擴增實驗，擴增條件為如下：95℃ 1 min，預變性;95℃ 5s，60℃ 33s，進行40個循環(huán)，再95℃ 15s，60℃ 20s，95℃ 15s解離。（4）引物：Cytochrome C：正向引物5-CACTCACCTGCTGCTACTCATTCACGT-3反向引物5-CTCTGTCATACTGGTCACTTCTAC-3;Nestin：正向引物5TTCTCCAAAGTGGGATCTGG-3，反向引物5-CCCCACTTTCTTCCTCATCA-3;內(nèi)參β-actin：正向引物5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-35-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3。（5）讀數(shù)：PCR儀自動讀取樣品閾值（Ct），重復3次，取平均值，采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步兩兩比較采用LSD法進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學評分的比較 與模型組比較，3組在給藥前的行為學評分差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05），頭部+軀體穴位組在0h、24h、48h時均有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組、頭部穴位組在24h、48h時均有顯著性差異（P<0.05），見表1。

2.2 腓腸肌Nestin mRNA的表達 與模型組比較，3組中Nestin基因表達量均有明顯變化，頭部+軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在24、48h有顯著性差異（P<0.05），見圖1，見表2。

2.3 腓腸肌Cytochrome C mRNA的表達 與模型組比較，3組中Cytochrome C基因表達量均有明顯變化，頭針加體針組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在0、24h有顯著性差異（P<0.05）。見表3。

2.4 前肢肌Nestin mRNA的表達 與模型組比較，3組中Nestin基因表達量均有明顯變化，頭針加體針組在48h有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在24h有顯著性差異（P<0.05）。見表4。

2.5 前肢肌Cytochrome C mRNA的表達 與模型組比較，3組中Cytochrome C基因表達量均有明顯變化，頭針加體針組在0、24h有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在0、24h有顯著性差異（P<0.05）。見表5。

2.6 針刺后24h時腓腸肌Nestin 、Cytochrome C蛋白的表達 與模型組比較，3組中Nestin蛋白表達量均有明顯變化，頭部+軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在24、48h有顯著性差異（P<0.05）。與模型組比較，3組中Cytochrome C蛋白表達量均有明顯變化，頭針加體針治療組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在0、24h有顯著性差異（P<0.05）。見圖1。

2.7 針刺后24h時前肢肌Nestin 、Cytochrome C蛋白的表達 與模型組比較，3組中Nestin蛋白表達量均有明顯變化，頭針加體針治療組在48h有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在24h有顯著性差異（P<0.05）。見圖2。與模型組比較，3組中Cytochrome C蛋白表達量均有明顯變化，頭針加體針治療組在0、24h有顯著性差異（P<0.05），軀體穴位組在0、24、48h均有顯著性差異（P<0.05），頭部穴位組在0、24h有顯著性差異（P<0.05）。見圖2。

3 討論

腦梗死造成偏癱及失語的發(fā)病過程涉及上運動神經(jīng)元損傷、肌肉失神經(jīng)支配、廢用性萎縮及分解代謝等病理生理變化，研究顯示，腦梗死4h后，由于支配運動神經(jīng)元的突觸傳遞突然中斷，運動單位減少，患肢肌肉組織結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)適應性改變，如肌肉質(zhì)量下降、肌纖維向快收縮纖維轉(zhuǎn)化等[10]，而發(fā)病1周左右，健側(cè)肢體也開始出現(xiàn)肌無力現(xiàn)象[11]。目前臨床對腦梗死患者偏癱及失語的康復治療手段主要包括肢體功能訓練、針刺、艾灸、電磁刺激等療法，其中針刺療法具有操作簡便、成本低廉、副作用小的優(yōu)勢，在改善腦梗死引起的肢體偏癱及促進肢體神經(jīng)功能恢復方面發(fā)揮著重要療效，如研究顯示，給予腦卒中后偏癱肢體痙攣患者針刺治療，能有效緩解患者的痙攣癥狀，減少神經(jīng)功能缺損[12];頭針聯(lián)合體針治療卒中后偏癱患者，能明顯提高患者的總有效率，改善患者病情和生活自理能力[13]。

中醫(yī)學認為，偏癱肌群屬督脈和膀胱經(jīng)脈所主，經(jīng)絡(luò)所過，主治所及，故選取兩經(jīng)穴位，可達升陽通督、改善骨骼肌肌力的功效，如風府、百會等，又因“治痿獨取陽明”，故選“前三里”和“后三里”等穴，共同作為本研究中的穴位。近年來，為了闡明針刺治療的相關(guān)內(nèi)在機制，針刺基礎(chǔ)研究從能量代謝、線粒體活性、細胞離子濃度改變的角度驗證了針刺對骨骼肌的作用，也揭示了針刺促進骨骼肌功能恢復的相應機制;研究顯示，神經(jīng)肌肉接頭（Neuromuscular junction，NMJ）是運動神經(jīng)支配骨骼肌的重要功能單位，對有效支配骨骼肌具有重要意義，ACh可通過Nestin來抑制NMJ處ACh受體的簇集，沉默Nestin后細胞膜上的Ach受體表達顯著上調(diào)[14]，通過電針聯(lián)合康復訓練能通過上調(diào)Nestin蛋白表達，促進神經(jīng)肌肉接頭的修復，從而改善骨骼肌的功能[15]。另有研究顯示，由線粒體介導的細胞凋亡是腦卒中后神經(jīng)元凋亡的主要途徑，CytC是線粒體內(nèi)的一種可溶性促凋亡蛋白，生理情況下穩(wěn)定存在于線粒體中，不能通過細胞外膜進入胞漿，病理狀態(tài)下，由于線粒體膜功能障礙，CytC可進入細胞質(zhì)，在ATP/dATP的參與下，促進神經(jīng)元凋亡，因此可將CytC 作為細胞中線粒體介導的細胞凋亡途徑的標志物[16-17]。

然而目前尚未有針刺治療卒中而對于肢體骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表達的相關(guān)研究，本研究結(jié)果顯示，3組中的大鼠行為學評分均較模型組有不同程度的改善，從Nestin、Cytochrome C蛋白及基因的角度進行研究后發(fā)現(xiàn)，針刺對大鼠腓腸肌、前肢肌中Nestin蛋白及基因的表達均有不同程度上調(diào)作用，對Cytochrome C蛋白及基因的表達均有不同程度下調(diào)作用，如三個針刺組中在0h時腓腸肌中Nestin基因的表達均明顯高于模型組，表明針刺在腦梗死早期干預能有效上調(diào)骨骼肌中Nestin的表達，進而有利于骨骼肌的功能的修復。在前肢肌中，軀體穴位組在0、24、48h時的Nestin基因表達及24h時的蛋白表達水平均顯著高于其他針刺組和模型組，表明在神經(jīng)肌肉接頭的修復及骨骼肌功能恢復方面，針刺軀體穴位具有顯著的療效，并較其他針刺方式更為明顯。三個針刺組中在0、24h時，腓腸肌中Cytochrome C基因的表達及24h時的蛋白表達均明顯低于模型組，表明針刺在腦梗死早期干預能有效下調(diào)骨骼肌中Cytochrome C的表達，進而減少骨骼肌細胞及神經(jīng)元的凋亡，從而減輕腦梗死引起的偏癱癥狀。在前肢肌中，頭部穴位組中Cytochrome C基因在0、24h時的表達及在24h時的蛋白表達顯著降低，表明早期針刺頭部督脈經(jīng)穴，可有效減少上肢骨骼肌細胞及神經(jīng)元的凋亡，對降低腦梗死造成的上肢骨骼肌損傷有積極作用。

綜上所述，本研究證實了針刺療法能通過不同程度的上調(diào)Nestin蛋白及基因表達，下調(diào)Cytochrome C蛋白及基因表達，促進神經(jīng)肌肉接頭功能的修復，減少骨骼肌細胞及神經(jīng)元的凋亡，改善腦梗死大鼠骨骼肌的功能，表明針刺療法對急性腦梗死引起的偏癱、失語等運動功能障礙是一種有效的干預手段。

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（收稿日期：2021-07-27）