Tfh、Tfr及N-末端腦鈉肽前體在不完全川崎病診治中的表達(dá)

紀(jì)小琳，沈偉鋒，湯冬梅，施佳卿

(嘉興學(xué)院附屬第一醫(yī)院/嘉興市第一醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.兒科，浙江 嘉興 314000)

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種急性、自限性和以全身性血管炎性病變?yōu)橹饕卣鞯募膊?，近年?lái)該病發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。KD可以累及小動(dòng)脈等全身血管，最常見(jiàn)的是冠狀動(dòng)脈受累。冠狀動(dòng)脈損傷(coronary artery lesion，CAL)，甚至淀粉樣腦血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)的發(fā)生，已成為發(fā)達(dá)國(guó)家兒童后天獲得性心臟病的重要原因，也是成年后易患冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素[1]。KD大多為完全川崎病(complete Kawasaki disease，CKD)，而不完全川崎病(incomplete Kawasaki disease，IKD)占13%～30%。IKD臨床特征不明顯，目前尚未找到具有明顯特異性的指標(biāo)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，濾泡輔助T(follicular helper T，Tfh)細(xì)胞在多種自身免疫性疾病及血管炎性疾病中呈高表達(dá)[3]，濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(follicular regulatory T cell，Tfr)降低導(dǎo)致炎性因子的釋放及自身免疫抗體的激活[4]。阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療KD是一種安全有效的方法[5]。那么，Tfh及Tfr的表達(dá)是否與阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療CKD、IKD及并發(fā)CAL的治療效果存在關(guān)聯(lián)值得研究。本研究通過(guò)分析IKD、CKD患兒經(jīng)阿司匹林及丙種球蛋白治療后臨床療效、實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)及Tfh、Tfr表達(dá)變化，以期為臨床有效區(qū)分診斷IKD、CKD以及預(yù)測(cè)藥物治療效果提供研究方向和依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年1月至2019年12月于嘉興市第一醫(yī)院接受治療的272例川崎病患兒為研究對(duì)象，其中男152例，女120例，年齡6個(gè)月至7歲。收集患兒發(fā)熱病程、住院期間首次完成超聲心動(dòng)圖的冠脈損傷的時(shí)間等一般資料以及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，包含血常規(guī)、尿常規(guī)、血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、心肌酶譜、N-末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)，心臟彩超測(cè)量冠脈內(nèi)徑。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為完全川崎病組(CKD組，n=184)和不完全川崎病組(IKD組，n=88)。兩組研究對(duì)象在年齡、性別方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，數(shù)據(jù)具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①猩紅熱、風(fēng)濕熱等結(jié)締組織疾病和不明原因發(fā)熱；②臨床資料不全；③有冠狀動(dòng)脈瘤、血栓形成、藥物過(guò)敏等。所有研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人均知情同意自愿參與研究。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，持續(xù)發(fā)熱時(shí)間大于5天(應(yīng)用抗生素?zé)o效)，同時(shí)以下5項(xiàng)臨床表現(xiàn)具有4項(xiàng)及以上者，排除其他疾病后，即可以診斷：①四肢變化：急性期手足掌跖出現(xiàn)紅斑，手足硬性水腫，而恢復(fù)期指趾端膜狀脫皮；②出現(xiàn)雙側(cè)眼球結(jié)合膜充血；③出現(xiàn)多形性皮疹；④頸部淋巴結(jié)腫大，以單側(cè)淋巴結(jié)腫大較為多見(jiàn)；⑤口腔黏膜彌漫性出血，口唇充血皴裂，舌乳頭突出呈現(xiàn)草莓狀；如不足4項(xiàng)，但出現(xiàn)心臟受累表現(xiàn)，亦診斷為CKD。IKD診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，發(fā)熱≥5天，具備KD癥狀中2～3項(xiàng)特征，C-反應(yīng)蛋白>30mg/L且同時(shí)伴有以下項(xiàng)目中3項(xiàng)方可確診為IKD：①白蛋白≤30g/L；②肝功能異常；③貧血；④發(fā)病超過(guò)7天后血小板增多，血小板>450×109；⑤尿常規(guī)檢查白細(xì)胞>10個(gè)/HP。冠狀動(dòng)脈損害：①冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑：6個(gè)月～3歲小于2.5mm，3～9歲在3.0mm及以上；②冠脈內(nèi)膜回聲增強(qiáng)。

1.3治療方法

所有患兒急性期口服阿司匹林泡騰片(國(guó)藥準(zhǔn)字H32029199)，50mg·kg-1·d-1，分為3次口服，至發(fā)熱消退后根據(jù)患者的病情酌情減至3～5mg·kg-1·d-1，分為3次口服；靜脈滴注丙種球蛋白(深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司，批號(hào)：140822)1.0g·kg-1·d-1，持續(xù)靜脈滴注8～12h，同時(shí)在8～12h內(nèi)再次給予一次沖擊治療，連續(xù)應(yīng)用2d。

1.4療效觀(guān)察

比較兩組患兒的臨床療效，具體根據(jù)臨床表現(xiàn)及小兒川崎病診療標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)患兒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。判定標(biāo)準(zhǔn)：①顯效：經(jīng)治療后，患兒發(fā)熱、黏膜充血等癥狀基本消失，ESR、心肌酶譜、CRP等指標(biāo)恢復(fù)正常；②有效：經(jīng)治療后，患兒發(fā)熱、黏膜充血等臨床癥狀顯著改善，ESR、CRP等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)基本恢復(fù)正常；③無(wú)效：經(jīng)治療后患兒各項(xiàng)癥狀未明顯得到改善。總有效率=(顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)×100%。觀(guān)察各組研究對(duì)象經(jīng)治療后臨床癥狀改善情況，包括發(fā)熱、黏膜充血、手足腫脹和淋巴結(jié)腫大；記錄各組患者治療前后血小板(platelet，PLT)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myocardial band，CK-MB)、ESR、CRP及NT-proBNP；記錄IKD患者冠狀動(dòng)脈損害恢復(fù)情況。

1.5 Tfh、Tfr及檢測(cè)

采集兩組研究對(duì)象治療前后空腹時(shí)靜脈血各5mL，經(jīng)肝素抗凝，采用密度梯度離心法分離獲取外周單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞(1×106個(gè)每管)洗滌后加入含有熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，4℃避光孵育30min。PBS洗3遍后固定，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tfh和Tfr細(xì)胞比率。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組患兒治療前后臨床療效及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

CKD組患兒治療后顯效120例，有效55例，無(wú)效9例，總有效率為95.11%；IKD組患兒顯效50例，有效34例，無(wú)效4例，總有效率為95.45%；兩組患兒總有效率方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.016，P>0.05)。IKD組臨床癥狀消退時(shí)間(發(fā)熱、黏膜充血、皮疹、手足腫脹、淋巴結(jié)腫大)短于CKD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為7.037、5.421、4.117、5.824、6.126，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象性別、年齡及臨床癥狀消退時(shí)間比較Table 1 Comparison of gender,age and clinical symptoms regression time between the two

治療后，CKD組及IKD組WBC、CK-MB、NT-proBNP、CRP、ESR、Tfh比率及Tfh/Tfr均較治療前降低，Tfr比率較治療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，IKD組患兒Tfh比率高于CKD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.336，P<0.05)，其余所有指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2及表3。

表2 兩組研究對(duì)象實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)治療前后變化情況比較Table 2 Comparison of changes of laboratory biochemical indexes between the two groups before and after

表3 兩組研究對(duì)象Tfh、Tfr及其比率比較Table 3 Comparison of Tfh,Tfr and ratio

2.2治療后兩組冠狀動(dòng)脈損害與相關(guān)生化指標(biāo)的關(guān)系

治療前，CKD組CAL發(fā)生率10.33%(19/184)低于IKD組36.36%(32/88)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.936，P<0.05)；治療后CKD組CAL患兒為0，IKD組CAL患兒3例，占3.41%(3/88)，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.602，P>0.05)。以治療前后CKD組、IKD組伴CAL進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，治療后CKD組伴CAL、IKD組伴CAL患者WBC、CK-MB、NT-proBNP、CRP、ESR、Tfh比率及Tfh/Tfr均較治療前降低，Tfr比率較治療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，IKD組伴CAL患兒NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr高于CKD組伴CAL患兒，Tfr比率低于CKD組伴CAL患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為11.336、5.891、18.613、4.221，P<0.05)，見(jiàn)表4及表5。

表4 兩組患者合并CAL與實(shí)驗(yàn)室相關(guān)生化指標(biāo)的關(guān)系Table 4 Relationships of combined CAL and related laboratory biochemical indexes in the two

表5 兩組患者合并CAL與Tfh、Tfr及其比率的關(guān)系Table 5 Relationships of combined CAL and Tfh,Tfrand their ratio in the two

2.3 ROC曲線(xiàn)分析

以是否為IKD作為因變量(IKD=1，CKD=0)，以治療前的Tfh、Tfr及NT-proBNP指標(biāo)為自變量，繪制受試者工作曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，治療前Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP對(duì)IKD具有較高的診斷價(jià)值，見(jiàn)圖1及表6。

圖1 治療前Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP對(duì)IKD診斷的ROC曲線(xiàn)Fig.1 ROC curve of Tfh cells ratio,Tfh/Tfr andNT-proBNP before treatment in the diagnosis of IKD

表6 治療前Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP對(duì)IKD診斷效能分析Table 6 Analysis of the effects of Tfh cells ratio,Tfh/Tfr and NT-proBNP before treatment in the diagnosis of IKD

2.4 COX模型分析

以IKD合并CAL為因變量，以治療后CKD組與IKD組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量為自變量行COX回歸模型分析。結(jié)果顯示，Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP是IKD合并CAL的影響因素，其OR值及95%CI分別為1.792(1.204～7.552)、2.334(1.745～6.032)、2.072(1.690～8.444)，均P<0.05。

3討論

3.1研究背景

KD近年來(lái)已成為兒童時(shí)期獲得性心血管疾病的重要原因之一。臨床相當(dāng)一部分KD患兒為典型特征，但仍有一部分患兒體征出現(xiàn)較晚或不出現(xiàn)，臨床表現(xiàn)在達(dá)不到CKD 6條標(biāo)準(zhǔn)中的4條時(shí)即稱(chēng)之為IKD。IKD因其早期臨床診斷困難，已成為目前兒科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的KD患兒約有30%出現(xiàn)CAL，在我國(guó)KD病死率在1%左右[7]。由于KD發(fā)病機(jī)制不明確，尚缺少針對(duì)病因的特異性治療手段，普遍認(rèn)同的治療方法是在阿司匹林治療的基礎(chǔ)上靜脈注射人丙種免疫球蛋白。阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療KD均能取得較為理想的治療效果，且治療IKD患兒的效果優(yōu)于CKD患兒[8]。

3.2治療前后臨床癥狀及生化指標(biāo)變化情況

本研究發(fā)現(xiàn)，IKD患兒經(jīng)治療后臨床癥狀消退時(shí)間明顯快于CKD組。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IKD組患兒除發(fā)熱以外，在淋巴結(jié)腫大、口腔黏膜充血、皮疹、手足腫脹方面較CKD組發(fā)生率低，因此筆者認(rèn)為，IKD組患兒經(jīng)阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療效果優(yōu)于CKD組患兒。美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)在制定KD的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，提出了有關(guān)IKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮IKD與CKD存在一致性的病理性改變，提出將WBC、CRP、ESR等指標(biāo)納入到IKD的臨床診斷指南中，但是這些指標(biāo)靈敏度及特異性并不是很高，因此該指南未能受到較為普遍的認(rèn)同和應(yīng)用[6]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，CKD組與IKD組在治療前后WBC、CRP、ESR之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此課題組研究認(rèn)為，AHA將WBC、CRP、ESR納入IKD診斷尚缺少足夠的證據(jù)，但本研究樣本量較少，仍有待于臨床大數(shù)據(jù)研究進(jìn)行佐證。

3.3相關(guān)生化指標(biāo)對(duì)IKD的診斷價(jià)值

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有研究顯示，NT-proBNP對(duì)IKD具有較高的診斷價(jià)值。本研究也發(fā)現(xiàn)，治療前NT-proBNP對(duì)IKD具有較高的診斷價(jià)值，治療后的NT-proBNP與CKD組比較也仍然存在一定差異，且為IKD患者預(yù)后的影響因素，提示NT-proBNP可能是區(qū)分IKD、CKD的參考指標(biāo)。KD與多種病原微生物感染及炎癥因子大量釋放有關(guān)。Tfh是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，正常生理?xiàng)l件下，Tfh可輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體從而抵抗病原微生物，而其過(guò)表達(dá)將導(dǎo)致免疫性疾病的發(fā)生[9]。另外，Tfh具有分泌白介素-21(interleukin-21，IL-21)的功能，而IL-21是一種多效細(xì)胞因子，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能具有直接作用。已有研究顯示，IL-21可促進(jìn)Th17和Th1細(xì)胞并抑制Treg表達(dá)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷[10]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者中Tfh分泌的IL-21與IL-17A、IFN-γ增加有關(guān)[11]。Tfr是一類(lèi)特化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其低表達(dá)導(dǎo)致體液免疫活化及自身抗體的產(chǎn)生[12]。本研究顯示治療前Tfh比率、Tfh/Tfr對(duì)IKD也有較高的診斷價(jià)值，治療后Tfh比率、Tfh/Tfr水平在IKD、CKD患兒中也存在表達(dá)差異，提示Tfh比率、Tfh/Tfr對(duì)于IKD的診斷也存在一定價(jià)值，可能為阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療判斷預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

3.4冠狀動(dòng)脈損害與相關(guān)生化指標(biāo)的關(guān)系

以往研究表明，IKD并發(fā)CAL的發(fā)生率顯著高于CKD伴CAL患者[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)IKD患兒在治療前后CAL的發(fā)生率顯著高于CKD組。為了探討阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療KD患兒伴有CAL的機(jī)制，本研究進(jìn)一步分析了Tfh比率、Tfr比率、Tfh/Tfr等指標(biāo)與藥物治療后的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，伴CAL的基礎(chǔ)上治療前CKD組與IKD組之間Tfh比率、Tfr比率、Tfh/Tfr表達(dá)存在差異，而治療后仍存在差異。課題組認(rèn)為，IKD組并發(fā)CAL發(fā)生率高的原因可能與Tfh比率增高，而Tfr比率降低有關(guān)。通過(guò)COX模型分析顯示，NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr為IKD合并CAL的影響因素，提示NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr與阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療IKD合并CAL預(yù)后有關(guān)。

3.5本研究局限性

需要提出的是，本研究初步闡明了治療前NT-proBNP、Tfh/TfrTfh比率及Tfh/Tfr對(duì)IKD的診斷作用，而治療后NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr對(duì)IKD合并CAL有一定的預(yù)測(cè)作用，但是入選的樣本量較小，未進(jìn)行大數(shù)據(jù)的隨訪(fǎng)研究，后續(xù)需要進(jìn)一步加大臨床樣本量的收集、聯(lián)合多中心進(jìn)行研究，進(jìn)一步觀(guān)察藥物治療效果及作用機(jī)制。

綜上，NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr對(duì)IKD具有較高的診斷作用，且為阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療IKD伴CAL的影響因素，建議臨床進(jìn)一步深入研究。