Tfh、Tfr及N-末端腦鈉肽前體在不完全川崎病診治中的表達

紀小琳，沈偉鋒，湯冬梅，施佳卿

(嘉興學院附屬第一醫(yī)院/嘉興市第一醫(yī)院 1.檢驗科;2.兒科，浙江 嘉興 314000)

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種急性、自限性和以全身性血管炎性病變?yōu)橹饕卣鞯募膊。陙碓摬“l(fā)生率呈上升趨勢。KD可以累及小動脈等全身血管，最常見的是冠狀動脈受累。冠狀動脈損傷(coronary artery lesion，CAL)，甚至淀粉樣腦血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)的發(fā)生，已成為發(fā)達國家兒童后天獲得性心臟病的重要原因，也是成年后易患冠狀動脈粥樣硬化的危險因素[1]。KD大多為完全川崎病(complete Kawasaki disease，CKD)，而不完全川崎病(incomplete Kawasaki disease，IKD)占13%～30%。IKD臨床特征不明顯，目前尚未找到具有明顯特異性的指標[2]。研究發(fā)現(xiàn)，濾泡輔助T(follicular helper T，Tfh)細胞在多種自身免疫性疾病及血管炎性疾病中呈高表達[3]，濾泡調(diào)節(jié)性T細胞(follicular regulatory T cell，Tfr)降低導致炎性因子的釋放及自身免疫抗體的激活[4]。阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療KD是一種安全有效的方法[5]。那么，Tfh及Tfr的表達是否與阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療CKD、IKD及并發(fā)CAL的治療效果存在關(guān)聯(lián)值得研究。本研究通過分析IKD、CKD患兒經(jīng)阿司匹林及丙種球蛋白治療后臨床療效、實驗室生化指標及Tfh、Tfr表達變化，以期為臨床有效區(qū)分診斷IKD、CKD以及預測藥物治療效果提供研究方向和依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年1月至2019年12月于嘉興市第一醫(yī)院接受治療的272例川崎病患兒為研究對象，其中男152例，女120例，年齡6個月至7歲。收集患兒發(fā)熱病程、住院期間首次完成超聲心動圖的冠脈損傷的時間等一般資料以及實驗室檢查指標，包含血常規(guī)、尿常規(guī)、血小板計數(shù)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、心肌酶譜、N-末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)，心臟彩超測量冠脈內(nèi)徑。根據(jù)診斷標準分為完全川崎病組(CKD組，n=184)和不完全川崎病組(IKD組，n=88)。兩組研究對象在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，數(shù)據(jù)具有可比性。排除標準：①猩紅熱、風濕熱等結(jié)締組織疾病和不明原因發(fā)熱；②臨床資料不全；③有冠狀動脈瘤、血栓形成、藥物過敏等。所有研究對象的監(jiān)護人均知情同意自愿參與研究。

1.2診斷標準

CKD診斷標準：根據(jù)美國心臟病學會診斷標準[6]，持續(xù)發(fā)熱時間大于5天(應用抗生素無效)，同時以下5項臨床表現(xiàn)具有4項及以上者，排除其他疾病后，即可以診斷：①四肢變化：急性期手足掌跖出現(xiàn)紅斑，手足硬性水腫，而恢復期指趾端膜狀脫皮；②出現(xiàn)雙側(cè)眼球結(jié)合膜充血；③出現(xiàn)多形性皮疹；④頸部淋巴結(jié)腫大，以單側(cè)淋巴結(jié)腫大較為多見；⑤口腔黏膜彌漫性出血，口唇充血皴裂，舌乳頭突出呈現(xiàn)草莓狀；如不足4項，但出現(xiàn)心臟受累表現(xiàn)，亦診斷為CKD。IKD診斷標準：參照美國心臟病學會診斷標準[6]，發(fā)熱≥5天，具備KD癥狀中2～3項特征，C-反應蛋白>30mg/L且同時伴有以下項目中3項方可確診為IKD：①白蛋白≤30g/L；②肝功能異常；③貧血；④發(fā)病超過7天后血小板增多，血小板>450×109；⑤尿常規(guī)檢查白細胞>10個/HP。冠狀動脈損害：①冠狀動脈內(nèi)徑：6個月～3歲小于2.5mm，3～9歲在3.0mm及以上；②冠脈內(nèi)膜回聲增強。

1.3治療方法

所有患兒急性期口服阿司匹林泡騰片(國藥準字H32029199)，50mg·kg-1·d-1，分為3次口服，至發(fā)熱消退后根據(jù)患者的病情酌情減至3～5mg·kg-1·d-1，分為3次口服；靜脈滴注丙種球蛋白(深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司，批號：140822)1.0g·kg-1·d-1，持續(xù)靜脈滴注8～12h，同時在8～12h內(nèi)再次給予一次沖擊治療，連續(xù)應用2d。

1.4療效觀察

比較兩組患兒的臨床療效，具體根據(jù)臨床表現(xiàn)及小兒川崎病診療標準，對患兒進行綜合評價。判定標準：①顯效：經(jīng)治療后，患兒發(fā)熱、黏膜充血等癥狀基本消失，ESR、心肌酶譜、CRP等指標恢復正常；②有效：經(jīng)治療后，患兒發(fā)熱、黏膜充血等臨床癥狀顯著改善，ESR、CRP等實驗室指標基本恢復正常；③無效：經(jīng)治療后患兒各項癥狀未明顯得到改善。總有效率=(顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)×100%。觀察各組研究對象經(jīng)治療后臨床癥狀改善情況，包括發(fā)熱、黏膜充血、手足腫脹和淋巴結(jié)腫大；記錄各組患者治療前后血小板(platelet，PLT)、白細胞計數(shù)(white blood cell，WBC)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myocardial band，CK-MB)、ESR、CRP及NT-proBNP；記錄IKD患者冠狀動脈損害恢復情況。

1.5 Tfh、Tfr及檢測

采集兩組研究對象治療前后空腹時靜脈血各5mL，經(jīng)肝素抗凝，采用密度梯度離心法分離獲取外周單個核細胞，將單個核細胞(1×106個每管)洗滌后加入含有熒光素標記的單克隆抗體，4℃避光孵育30min。PBS洗3遍后固定，采用流式細胞術(shù)檢測Tfh和Tfr細胞比率。

1.6統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1兩組患兒治療前后臨床療效及實驗室指標比較

CKD組患兒治療后顯效120例，有效55例，無效9例，總有效率為95.11%；IKD組患兒顯效50例，有效34例，無效4例，總有效率為95.45%；兩組患兒總有效率方面差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.016，P>0.05)。IKD組臨床癥狀消退時間(發(fā)熱、黏膜充血、皮疹、手足腫脹、淋巴結(jié)腫大)短于CKD組，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為7.037、5.421、4.117、5.824、6.126，P<0.05)，見表1。

表1 兩組研究對象性別、年齡及臨床癥狀消退時間比較Table 1 Comparison of gender,age and clinical symptoms regression time between the two

治療后，CKD組及IKD組WBC、CK-MB、NT-proBNP、CRP、ESR、Tfh比率及Tfh/Tfr均較治療前降低，Tfr比率較治療前升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后，IKD組患兒Tfh比率高于CKD組，差異均有統(tǒng)計學意義(t=10.336，P<0.05)，其余所有指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2及表3。

表2 兩組研究對象實驗室生化指標治療前后變化情況比較Table 2 Comparison of changes of laboratory biochemical indexes between the two groups before and after

表3 兩組研究對象Tfh、Tfr及其比率比較Table 3 Comparison of Tfh,Tfr and ratio

2.2治療后兩組冠狀動脈損害與相關(guān)生化指標的關(guān)系

治療前，CKD組CAL發(fā)生率10.33%(19/184)低于IKD組36.36%(32/88)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.936，P<0.05)；治療后CKD組CAL患兒為0，IKD組CAL患兒3例，占3.41%(3/88)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.602，P>0.05)。以治療前后CKD組、IKD組伴CAL進行研究，結(jié)果顯示，治療后CKD組伴CAL、IKD組伴CAL患者WBC、CK-MB、NT-proBNP、CRP、ESR、Tfh比率及Tfh/Tfr均較治療前降低，Tfr比率較治療前升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后，IKD組伴CAL患兒NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr高于CKD組伴CAL患兒，Tfr比率低于CKD組伴CAL患兒，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為11.336、5.891、18.613、4.221，P<0.05)，見表4及表5。

表4 兩組患者合并CAL與實驗室相關(guān)生化指標的關(guān)系Table 4 Relationships of combined CAL and related laboratory biochemical indexes in the two

表5 兩組患者合并CAL與Tfh、Tfr及其比率的關(guān)系Table 5 Relationships of combined CAL and Tfh,Tfrand their ratio in the two

2.3 ROC曲線分析

以是否為IKD作為因變量(IKD=1，CKD=0)，以治療前的Tfh、Tfr及NT-proBNP指標為自變量，繪制受試者工作曲線。結(jié)果顯示，治療前Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP對IKD具有較高的診斷價值，見圖1及表6。

圖1 治療前Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP對IKD診斷的ROC曲線Fig.1 ROC curve of Tfh cells ratio,Tfh/Tfr andNT-proBNP before treatment in the diagnosis of IKD

表6 治療前Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP對IKD診斷效能分析Table 6 Analysis of the effects of Tfh cells ratio,Tfh/Tfr and NT-proBNP before treatment in the diagnosis of IKD

2.4 COX模型分析

以IKD合并CAL為因變量，以治療后CKD組與IKD組差異有統(tǒng)計學意義的變量為自變量行COX回歸模型分析。結(jié)果顯示，Tfh比率、Tfh/Tfr及NT-proBNP是IKD合并CAL的影響因素，其OR值及95%CI分別為1.792(1.204～7.552)、2.334(1.745～6.032)、2.072(1.690～8.444)，均P<0.05。

3討論

3.1研究背景

KD近年來已成為兒童時期獲得性心血管疾病的重要原因之一。臨床相當一部分KD患兒為典型特征，但仍有一部分患兒體征出現(xiàn)較晚或不出現(xiàn)，臨床表現(xiàn)在達不到CKD 6條標準中的4條時即稱之為IKD。IKD因其早期臨床診斷困難，已成為目前兒科領(lǐng)域的研究熱點。臨床研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的KD患兒約有30%出現(xiàn)CAL，在我國KD病死率在1%左右[7]。由于KD發(fā)病機制不明確，尚缺少針對病因的特異性治療手段，普遍認同的治療方法是在阿司匹林治療的基礎(chǔ)上靜脈注射人丙種免疫球蛋白。阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療KD均能取得較為理想的治療效果，且治療IKD患兒的效果優(yōu)于CKD患兒[8]。

3.2治療前后臨床癥狀及生化指標變化情況

本研究發(fā)現(xiàn)，IKD患兒經(jīng)治療后臨床癥狀消退時間明顯快于CKD組。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IKD組患兒除發(fā)熱以外，在淋巴結(jié)腫大、口腔黏膜充血、皮疹、手足腫脹方面較CKD組發(fā)生率低，因此筆者認為，IKD組患兒經(jīng)阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療效果優(yōu)于CKD組患兒。美國心臟病學會在制定KD的標準時，提出了有關(guān)IKD的診斷標準，綜合考慮IKD與CKD存在一致性的病理性改變，提出將WBC、CRP、ESR等指標納入到IKD的臨床診斷指南中，但是這些指標靈敏度及特異性并不是很高，因此該指南未能受到較為普遍的認同和應用[6]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，CKD組與IKD組在治療前后WBC、CRP、ESR之間差異無統(tǒng)計學意義，因此課題組研究認為，AHA將WBC、CRP、ESR納入IKD診斷尚缺少足夠的證據(jù)，但本研究樣本量較少，仍有待于臨床大數(shù)據(jù)研究進行佐證。

3.3相關(guān)生化指標對IKD的診斷價值

近年來，國內(nèi)外均有研究顯示，NT-proBNP對IKD具有較高的診斷價值。本研究也發(fā)現(xiàn)，治療前NT-proBNP對IKD具有較高的診斷價值，治療后的NT-proBNP與CKD組比較也仍然存在一定差異，且為IKD患者預后的影響因素，提示NT-proBNP可能是區(qū)分IKD、CKD的參考指標。KD與多種病原微生物感染及炎癥因子大量釋放有關(guān)。Tfh是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，正常生理條件下，Tfh可輔助B細胞產(chǎn)生抗體從而抵抗病原微生物，而其過表達將導致免疫性疾病的發(fā)生[9]。另外，Tfh具有分泌白介素-21(interleukin-21，IL-21)的功能，而IL-21是一種多效細胞因子，對血管內(nèi)皮細胞功能具有直接作用。已有研究顯示，IL-21可促進Th17和Th1細胞并抑制Treg表達，導致血管內(nèi)皮細胞功能損傷[10]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者中Tfh分泌的IL-21與IL-17A、IFN-γ增加有關(guān)[11]。Tfr是一類特化的調(diào)節(jié)性T細胞，其低表達導致體液免疫活化及自身抗體的產(chǎn)生[12]。本研究顯示治療前Tfh比率、Tfh/Tfr對IKD也有較高的診斷價值，治療后Tfh比率、Tfh/Tfr水平在IKD、CKD患兒中也存在表達差異，提示Tfh比率、Tfh/Tfr對于IKD的診斷也存在一定價值，可能為阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療判斷預后的生物學指標。

3.4冠狀動脈損害與相關(guān)生化指標的關(guān)系

以往研究表明，IKD并發(fā)CAL的發(fā)生率顯著高于CKD伴CAL患者[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)IKD患兒在治療前后CAL的發(fā)生率顯著高于CKD組。為了探討阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療KD患兒伴有CAL的機制，本研究進一步分析了Tfh比率、Tfr比率、Tfh/Tfr等指標與藥物治療后的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，伴CAL的基礎(chǔ)上治療前CKD組與IKD組之間Tfh比率、Tfr比率、Tfh/Tfr表達存在差異，而治療后仍存在差異。課題組認為，IKD組并發(fā)CAL發(fā)生率高的原因可能與Tfh比率增高，而Tfr比率降低有關(guān)。通過COX模型分析顯示，NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr為IKD合并CAL的影響因素，提示NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr與阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療IKD合并CAL預后有關(guān)。

3.5本研究局限性

需要提出的是，本研究初步闡明了治療前NT-proBNP、Tfh/TfrTfh比率及Tfh/Tfr對IKD的診斷作用，而治療后NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr對IKD合并CAL有一定的預測作用，但是入選的樣本量較小，未進行大數(shù)據(jù)的隨訪研究，后續(xù)需要進一步加大臨床樣本量的收集、聯(lián)合多中心進行研究，進一步觀察藥物治療效果及作用機制。

綜上，NT-proBNP、Tfh比率及Tfh/Tfr對IKD具有較高的診斷作用，且為阿司匹林聯(lián)合丙種球蛋白治療IKD伴CAL的影響因素，建議臨床進一步深入研究。