大黃酸對腦缺血再灌注損傷的影響及潛在機制研究

田慶鑫 張明曉 劉建龍

缺血性腦卒中是世界范圍內嚴重致殘和導致死亡的主要原因[1]。腦血流量下降會導致腦缺氧和葡萄糖供應不足，從而導致腦缺血。血液供應恢復會產生過多的活性氧和炎癥反應，可能會誘發(fā)腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI），加重腦損傷[2-3]。CIRI包含興奮毒性、氧化應激、炎癥和凋亡等病理過程[4]。有效的抗炎和抗凋亡藥物，可以抑制促炎性細胞因子的產生和炎癥誘導的細胞凋亡，改善CIRI[5]。大黃酸是一種天然的蒽醌化合物，其從大黃中分離，參與許多生物學活動，包括抑制活性氧、下調細胞內鈣濃度、促進微循環(huán)功能、抑制中性粒細胞遷移和抗炎作用[6-7]。CIRI期間血腦屏障被破壞，既往研究表明大黃酸能夠穿過被破壞的血腦屏障，抑制腦梗死并改善神經功能評分[8]。大黃酸可能在抗CIRI中發(fā)揮有益作用。然而，大黃酸對CIRI保護作用的信號傳導機制尚未明確。本研究通過大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）及體外細胞氧-葡萄糖剝奪與恢復（oxygen-glucose deprivation and recovery,OGD/R）模型探討大黃酸對CIRI的影響及潛在機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和細胞培養(yǎng) 選擇SPF雄性SD大鼠60只，8～10周齡，250～280 g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。大鼠飼養(yǎng)于22～24℃恒溫，12 h光照/12 h暗循環(huán)環(huán)境，自由獲取標準水和飼料。本研究方案經本院實驗動物倫理委員會批準，動物喂養(yǎng)及實驗操作均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。人神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞購于中國科學院細胞庫。將SH-SY5Y細胞置于完全培養(yǎng)基（含10%FBS、100 IU/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素的 DMEM/F12）中，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 大黃酸（純度≥96%）、氯吡格雷、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose,CMCNa）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）購自國藥集團化學試劑有限公司。IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA檢測試驗盒購自南京凱基生物技術公司。磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phospho-phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,p-PI3K）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B or phospho-AKT kinase,p-AKT）、蛋白激酶B（protein kinase B or AKT kinase,AKT）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phospho-mammalian target of rapamycin,p-mTOR）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體購自細胞信號技術公司。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）和四甲基偶氮唑藍（methlthiazoletrazolium,MTT）購自美國Sigma公司。放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CIRI模型構建 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為CIRI組、CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組、假手術組（Sham組）5組，每組12只。其中CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組分別給予氯吡格雷7.5 mg·kg-1·d-1、大黃酸 10 mg·kg-1·d-1或 20 mg·kg-1·d-1灌胃，兩種藥物均溶于0.5%CMC-Na溶液。Sham組和CIRI組給予0.5%CMC-Na溶液灌胃給藥。給藥頻率均為1次/d，連續(xù)7 d。除Sham組外，其他組大鼠采用線栓法通過MCAO構建大鼠CIRI模型：麻醉大鼠并手術暴露頸內動脈、右側頸總動脈和頸外動脈，結扎頸總動脈和頸外動脈，在頸總動脈近分叉處剪口將尼龍線栓插入，直至遇到輕微阻力停止插線，線栓插入深度為18 mm，閉塞右側大腦中動脈腔內致局灶性腦缺血2 h后，緩慢拔除尼龍線栓，恢復大腦中動脈血供，使血流再灌注24 h。Sham組大鼠采用相同的手術步驟，但不閉塞大腦中動脈。

1.3.2 神經功能缺損評分的比較 缺血再灌注24 h后，采用盲法五分制評分法檢測5組大鼠神經功能缺損情況，系統(tǒng)評分如下：無缺損為0分；未能充分伸展手術對側（左側）軀干和前肢為1分；被提起尾巴時軀干轉向左側為2分；行走困難，向左側癱倒為3分；意識不清，不能自發(fā)行走為4分。

1.3.3 大鼠的血清和腦組織中促炎性細胞因子水平測定 所有大鼠采用異氟烷麻醉后摘除一側眼球取血，血液離心15 min，獲得上清液；大鼠腦組織制成10%的勻漿，離心后取上清液待測。采用ELISA法檢測大鼠的血清和腦組織中促炎性細胞因子的水平，包括IL-6、IL-1β和TNF-α。操作按ELISA試劑盒說明，在450 nm處測定各反應孔樣品的吸光度（optical density，OD）值，IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平與 OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線求出標本中各促炎性細胞因子水平。

1.3.4 大鼠腦梗死區(qū)和腦水腫比例的測定 取血后立即采用隨機數(shù)字表法從5組大鼠中各抽取5只，采用頸椎脫臼法處死，剝離大鼠大腦顱骨，分離出腦組織，放在腦切片模具上，將大鼠大腦冠狀面切成2 mm厚切片（除去前端嗅球和后端小腦，每只大鼠大腦缺血再灌注部分可切為5片），以2%TTC在37℃條件下孵育30 min。正常的腦組織被染成紅色，而梗死區(qū)域的腦組織未被染色，觀察染色的腦切片。采用圖像處理軟件image-pro Plus 6.0標定和計算梗死面積比例，腦梗死面積比例=[左側大腦半球面積-（右側大腦半球面積 -梗死灶面積）]/左側大腦半球面積×100%。采用相同方法從5組大鼠中各再抽取5只并處死，迅速切除大腦并置于冰上，立即稱取腦組織濕重（ww），60℃干燥48 h得到干重（dw）。計算腦水腫比例，腦水腫比例（%）=[（ww-dw）/（ww）]×100%。

1.3.5 體外OGD/R模型的建立 將SH-SY5Y細胞分為8組，分別為：OGD/R組、大黃酸給藥組（10、20、40、80、160、320 μM 大黃酸組）、對照組（Con組）。將細胞以5×103/孔的密度接種到96孔板中24 h，然后將OGD/R組、大黃酸給藥組生長良好的SH-SY5Y細胞置于無血清和無葡萄糖培養(yǎng)基，于37℃、94%N2、5%CO2和1%O2厭氧室中培養(yǎng)6 h。氧糖剝奪處理后，更換完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2中氧糖恢復培養(yǎng)6 h，其中大黃酸給藥組分別加入上述不同濃度的大黃酸溶液孵育。結合文獻，造模后細胞存活率在30%～60%，即造模成功[9]。同時，Con組細胞置于完全培養(yǎng)基中，于含有37℃、5%CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.6 SH-SY5Y細胞活力測定 使用MTT試驗測定SH-SY5Y細胞活力。體外OGD/R模型的建立后，96孔板中每孔細胞添加20 μl MTT（5 mg/ml）工作溶液，然后在37℃下再孵育4 h。除去介質，并將染料晶體溶于150 μl DMSO中。用微孔板分光光度計在490 nm處檢測每孔細胞的吸光度值。按以下公式計算細胞活力：細胞活力（%）=A/A0×100%（A為實驗組吸光度值、A0為Con組吸光度值）。

1.3.7 SH-SY5Y細胞促炎性細胞因子水平測定 收集SH-SY5Y細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明，采用與上述大鼠的血清和腦組織中促炎性細胞因子水平測定相同步驟，使用ELISA試劑盒檢測SHSY5Y細胞中促炎性細胞因子（包括IL-6、IL-1β和TNF-α）的水平。

1.3.8 大鼠腦組織中和SH-SY5Y細胞中PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白水平檢測 采用Western blot方法，將大鼠腦組織和SH-SY5Y細胞置于含0.1%苯基甲基磺酰氟的冰冷RIPA裂解液中勻漿提取總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。用10%含十二烷基硫酸鈉的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜，室溫下在5%脫脂牛奶中封閉2 h。然后將PVDF膜與一抗 p-PI3K（1∶500稀釋）、PI3K（1∶500稀釋）、p-AKT（1∶1 000 稀釋）、AKT（1∶1 000 稀釋）、p-mTOR（1∶5 000 稀釋）、mTOR（1∶5 000 稀釋）和 GAPDH（1∶2 000稀釋）在4℃下孵育過夜。用含有 0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液 [Tris-buffered saline（TBS）containing 0.1%Tween-20，TBST]洗滌 3次后，將 PVDF膜與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（1∶1 000稀釋）在室溫下孵育1 h。免疫反應條帶與增強的化學發(fā)光試劑盒相互作用，并在凝膠成像系統(tǒng)上可視化。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey事后檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 5組大鼠神經功能缺損評分比較 CIRI組大鼠神經功能缺損評分為（3.42±0.51）分，高于Sham組（0.00分），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組和CIRI+20 mg/kg大黃酸組神經功能缺損評分分別為 （1.50±0.52）、（1.92±0.67）、（1.58±0.51）分，均低于 CIRI組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.01）。

2.2 5組大鼠血清和腦組織中的促炎性細胞因子水平比較 見表1。

由表 1可見，CIRI組血清和大腦中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于Sham組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組血清和大腦中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均低于CIRI組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05）。

表1 5組大鼠血清和腦組織中的促炎性細胞因子水平比較

2.3 5組大鼠腦梗死區(qū)面積和腦水腫比例比較 見表2。

由表2可見，CIRI組大鼠的腦梗死區(qū)面積百分比和腦水腫比例均高于Sham組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組腦梗死面積和腦水腫比例低于CIRI組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。5組大鼠腦梗死切片比較見圖1。

圖1 5組大鼠腦梗死切片比較（CIRI為腦缺血再灌注損傷；Sham為假手術）

表2 5組大鼠腦梗死區(qū)面積和腦水腫比例比較（%）

由圖1可見，Sham組大鼠腦組織被染為均勻紅色，未見明顯梗死區(qū)域；其他各組均出現(xiàn)不同程度的梗死區(qū)域，其中CIRI組大鼠的腦組織梗死區(qū)域最大。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組腦梗死區(qū)域均小于CIRI組。

2.4 SH-SY5Y細胞的細胞活力比較 OGD/R組SHSY5Y細胞活力為（49.50±7.67）%，低于 Con組（102.90±4.59）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。10、20 和 40 μM大黃酸組SH-SY5Y細胞的細胞活力分別為（71.53±4.99）% 、（83.93±3.12）%、（83.80±5.47）%，均高于OGD/R 組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.01）。80、160和320 μM大黃酸組SH-SY5Y細胞的細胞活力分別為（64.13±3.29）%、（63.43±3.55）%及（61.74±3.61）%，與OGD/R組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。故選擇濃度為10、20、40 μM的樣品進行體外細胞實驗。

2.5 5組SH-SY5Y細胞上清液中促炎性細胞因子水平比較 見表3。

表3 5組SH-SY5Y細胞上清液中促炎性細胞因子水平比較（pg/ml）

由表3可見，OGD/R組 IL-6、TNF-α和 IL-1β水平均高于Con組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；10、20、40 μM 大黃酸組 IL-6、TNF-α 水平均低于OGD/R 組，20、40 μM 大黃酸組 IL-1β 水平均低于OGD/R組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.6 5組大鼠腦組織和SH-SY5Y細胞中PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達比較 見圖2。

由圖2可見，CIRI組大鼠p-PI3K、p-AKT和 pmTOR蛋白表達水平均較Sham組下調，CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平較CIRI組上調。OGD/R組的SH-SY5Y細胞p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平均較Con組下調。10、20、40 μM大黃酸組SHSY5Y細胞p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平較OGD/R組上調。

圖2 5組大鼠和人神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞中磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）通路相關蛋白表達比較[a：5組腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織中PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達電泳圖；b：5組SH-SY5Y細胞中的PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達電泳圖；Sham為假手術；p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶；p-AKT為磷酸化蛋白激酶B；p-mTOR為磷酸化哺乳動物雷中的霉素靶蛋白；GAPDH為內參；OGD/R為氧-葡萄糖剝奪與恢復；Con為對照]

3 討論

近年來，越來越多證據(jù)表明，腦缺血會引發(fā)炎癥反應[10]。腦缺血后，缺血損傷區(qū)存在多種細胞因子表達、炎性細胞浸潤和氧自由基反應，可加速缺血后細胞損傷[7，10]。灌注不足和局部缺血后腦循環(huán)的恢復可能導致內皮功能障礙和神經功能受損，本研究選擇MCAO模型模擬大鼠CIRI，先前研究顯示MCAO模型中神經系統(tǒng)評分和腦梗死體積增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃酸可減輕缺血大鼠的神經功能缺損，減小腦梗死面積和腦水腫比例，提示大黃酸可能可以減輕CIRI，這與先前的研究一致[12]。

大黃酸作為大黃的一種生物活性化合物，已用于治療腦損傷，但其藥理機制仍不清楚[12-13]。近期研究提示大黃酸在神經炎癥體外模型中顯著降低了炎癥因子的表達，包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 和誘生型一氧化氮合酶[13]。有研究表明，促炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6可能刺激許多下游的氧自由基、細胞因子、溶酶體酶和其他炎癥介質，并導致CIRI[11]。越來越多證據(jù)表明，促炎性細胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的含量在缺血再灌注后升高，表明炎癥在缺血再灌注損傷中起著至關重要的作用[14]。本研究證明了大黃酸可以抑制MCAO誘導的大鼠或OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞中大量產生的IL-6、IL-1β 和 TNF-α。

本研究評估了關鍵的神經炎癥相關信號通路來探討大黃酸潛在的抗神經炎癥機制。已有研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號傳導途徑是關鍵的神經保護信號通路之一，PI3K/AKT信號通路在炎癥和氧化應激等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。同時，先前已有研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路的激活對炎癥起關鍵作用[16]。PI3K/AKT可抑制NF-κB的活化，從而最終防止炎癥的發(fā)生，因為促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的合成是由NF-κB介導的[17]。PI3K/AKT通路的激活已被證實可減少炎癥基因，進而保護血管功能，其在腦缺血中的神經保護作用已被廣泛研究[18]?；罨腁KT可快速激活mTOR等多種分子功能，mTOR是一個多功能的收集點，可調節(jié)細胞營養(yǎng)、能量供應并促進蛋白質合成?？紤]到PI3K/AKT通路的神經保護作用，推測腦缺血后PI3K/AKT/mTOR通路可能失活。在本文中，大黃酸可激活MCAO大鼠或OGD/R誘導的 SH-SY5Y細胞中的 p-PI3K、p-AKT和 pmTOR，提示大黃酸對神經炎性介質產生的調節(jié)可能是通過激活PI3K/AKT/mTOR通路完成的。

綜上所述，本研究提示，大黃酸在體內和體外有效地減弱了CIRI，其潛在機制可能與PI3K/AKT/mTOR通路參與抗炎作用有關。這些結果表明，大黃酸可能可作為腦缺血再灌注損傷的潛在治療藥物。