血清miRNA-16和miRNA-92a在2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者中的表達(dá)及與骨代謝相關(guān)性研究

丁莉 彭健韞 張偉 陳日秋

近年來(lái)，我國(guó)2型糖尿?。═2DM）合并骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。因此，探討T2DM合并骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床診治具有重要意義。miRNA是在轉(zhuǎn)錄后參與細(xì)胞增殖、凋亡及分化等過(guò)程的一種小型非編碼RNA，存在于多種生物體內(nèi)。研究報(bào)道顯示，miRNA參與骨微環(huán)境中的骨吸收或骨生成[1-2]。本研究探討血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質(zhì)疏松癥患者中的表達(dá)及與骨代謝的相關(guān)性，以期為臨床診斷和治療T2DM合并骨質(zhì)疏松癥提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取麗水市人民醫(yī)院2019年1月至2021年1月收治的T2DM合并骨質(zhì)疏松癥患者91例作為T2DM合并骨質(zhì)疏松組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2013年版）》[3]中關(guān)于T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及《中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)》[4]中關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡40～75歲；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）1型糖尿病或其他骨科疾病者；（2）精神疾病者；（3）合并影響骨代謝疾病者。另選取本院同期收治的單純T2DM患者80例作為非骨質(zhì)疏松組，依據(jù)《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2013年版）》[3]關(guān)于T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。兩組患者基線資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均知情同意。

表1 兩組患者基線資料比較

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊系列（β-CTX）試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。主要儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀購(gòu)自瑞士羅氏公司。

1.3 血清miRNA-16和miRNA-92a表達(dá)水平檢測(cè) （1）miRNA提取、純化和定量分析：采集受試者外周靜脈血5 ml，15 000 r/min離心6 min，收集血清后于4℃12 000 r/min離心6 min，再收集血清置于-70℃保存待測(cè)。（2）血清miRNA-16和miRNA-92a相對(duì)表達(dá)量測(cè)定：取上述血清標(biāo)本，采用TRIzol試劑提取血清總RNA，取5 μl總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并檢測(cè)總RNA的純度和完整度。按照美國(guó)Biomiga公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6作為內(nèi)參基因。取cDNA進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共完成40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-16和miRNA-92a相對(duì)表達(dá)量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.4 血清骨代謝指標(biāo)測(cè)定 采集兩組患者外周靜脈血 5 ml，15 000 r/min離心 6 min，取上清液（血清）置于-70℃下保存待測(cè)。采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊系列（β-CTX）和ALP水平，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析miRNA-16和miRNA-92a對(duì)T2DM合并骨質(zhì)疏松癥的診斷效能；采用Pearson相關(guān)分析miRNA-16、miRNA-92a與骨代謝的相關(guān)性；多因素logistic回歸分析影響T2DM合并骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNA-16和miRNA-92a相對(duì)表達(dá)量比較 T2DM合并骨質(zhì)疏松組miRNA-16和miRNA-92a相對(duì)表達(dá)量均明顯高于非骨質(zhì)疏松組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 兩組miRNA-16和miRNA-92a相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 兩組β-CTX、ALP水平比較 T2DM合并骨質(zhì)疏松組β-CTX水平高于非骨質(zhì)疏松組，而ALP低于非骨質(zhì)疏松組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組β-CTX、ALP水平比較

2.3 miRNA-16和miRNA-92a對(duì)T2DM合并骨質(zhì)疏松癥的診斷效能 診斷T2DM合并骨質(zhì)疏松癥時(shí)，miRNA-16靈敏度為71.70%，特異度為55.26%；miRNA-92a靈敏度為69.35%，特異度為58.62%。見(jiàn)表5和圖1。

表5 miRNA-16和miRNA-92a對(duì)T2DM合并骨質(zhì)疏松癥的診斷價(jià)值

圖1 miRNA-16和miRNA-92a診斷2型糖尿病（T2DM）合并骨質(zhì)疏松癥的ROC曲線

2.4 miRNA-16、miRNA-92a與 β-CTX、ALP 的相關(guān)性 miRNA-16、miRNA-92a與 β-CTX均呈正相關(guān)（均 P＜0.05），而與 ALP均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.01）。見(jiàn)表6。

表6 miRNA-16、miRNA-92a與β-CTX、ALP的相關(guān)性

2.5 影響T2DM合并骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 經(jīng)多因素logistic回歸分析顯示，年齡＞60歲、miRNA-16和miRNA92表達(dá)均為影響T2DM合并骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。見(jiàn)表7。

表7 多因素logistic回歸分析影響T2DM合并骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是我國(guó)中老年人常見(jiàn)的一種疾病，其特征主要為骨干質(zhì)量的改變、骨骼的退化，伴機(jī)械負(fù)荷能力減弱及骨骼硬度下降[5-6]。T2DM合并骨質(zhì)疏松癥者發(fā)生骨折概率較高，具有較高致殘率和致死率，對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[7-9]。

正常機(jī)體骨代謝處于吸收和形成相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡的一種狀態(tài)，骨代謝標(biāo)志物包括骨吸收與骨形成標(biāo)志物兩部分，因此檢測(cè)骨代謝水平可有效、及時(shí)地反映骨吸收和骨形成的速率，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的篩查和診療[9]。β-CTX是重要的一種骨吸收標(biāo)志物，能夠反應(yīng)破骨細(xì)胞的狀態(tài)，骨質(zhì)疏松癥患者骨吸收增強(qiáng)，會(huì)使破骨細(xì)胞活性上升，β-CTX水平隨之升高[10]。ALP主要源自于成骨細(xì)胞，對(duì)骨形成和骨礦化均發(fā)揮重要作用，且是骨形成和骨轉(zhuǎn)化的重要生化標(biāo)志[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并骨質(zhì)疏松組患者血清β-CTX高于非骨質(zhì)疏松組，而ALP低于非骨質(zhì)疏松組，提示T2DM合并骨質(zhì)疏松癥患者存在骨代謝異常。

miRNA具有19～22個(gè)核苷酸，主要通過(guò)降解靶mRNA調(diào)控生命過(guò)程的小分子RNA來(lái)參與增殖、分化及凋亡等生物過(guò)程。近年來(lái)，miRNA在骨質(zhì)疏松癥和退行性骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展中的影響研究成為熱點(diǎn)[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程的重要成員，其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)的代謝及骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展具有一定的影響[15]。越來(lái)越多研究強(qiáng)調(diào)了miRNA在調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的功能和分化方面的作用，且認(rèn)為miRNA通過(guò)Wnt信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及骨形態(tài)發(fā)生蛋白來(lái)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化以及骨形成，但因miRNA不能抵御核酸酶，且缺乏靶向性，故而以支架為基礎(chǔ)的miRNA載體在難治性骨質(zhì)疏松性骨折的骨修復(fù)中具有特殊的應(yīng)用前景[16]。而目前臨床上對(duì)miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質(zhì)疏松癥中研究甚少，且尚無(wú)有關(guān)miRNA-16和miRNA-92a與骨代謝相關(guān)研究，缺乏可靠的參考依據(jù)，故而還需后續(xù)增加樣本量，作多中心、多樣本深入研究，提供可靠的臨床參考價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并骨質(zhì)疏松組血清miRNA-16和miRNA-92a相對(duì)表達(dá)量高于非骨質(zhì)疏松組，由此可見(jiàn)T2DM合并骨質(zhì)疏松癥患者血清miRNA-16和miRNA-92a呈高表達(dá)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并骨質(zhì)疏松癥中，miRNA-16診斷靈敏度為71.70%，特異度為55.26%；miRNA-92a診斷靈敏度為69.35%，特異度為58.62%，由此可見(jiàn)血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質(zhì)疏松癥中具有良好診斷價(jià)值；且miRNA-16和miRNA-92a與β-CTX呈線性正相關(guān)，而與ALP呈線性負(fù)相關(guān)。

綜上所述，血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質(zhì)疏松癥中高表達(dá)，且與骨代謝明顯相關(guān)。