細(xì)胞核G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展

柯璇，洪浩

(中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥理系，江蘇 南京 210009)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)是哺乳動(dòng)物基因組中最大的膜蛋白家族，有800多名成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管、視網(wǎng)膜等器官和組織，參與機(jī)體的發(fā)育和正常的功能行使。GPCR也是目前成藥性最高的藥物靶標(biāo)，當(dāng)今治療性藥物市場(chǎng)中約有30%的藥物以GPCR為作用靶標(biāo)[1]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，GPCR通過與光、氣味、離子、脂類、多肽以及蛋白等形式的配體結(jié)合而激活，繼而觸發(fā)其下游信號(hào)事件[2]。過去認(rèn)為GPCR僅在質(zhì)膜上發(fā)揮作用，但迄今為止還發(fā)現(xiàn)了超過30種不同的GPCR定位于細(xì)胞核[3]，其中一些細(xì)胞核GPCR(nuclear GPCR，nGPCR)已顯示出與其相應(yīng)細(xì)胞質(zhì)膜GPCR(plasma membrane GPCR，mGPCR)不同的生物特性和生理或病理功能。本文就目前對(duì)nGPCR的相關(guān)研究進(jìn)展做簡(jiǎn)要綜述，并比較其與mGPCR間的異同，最后討論其在疾病發(fā)展及藥物治療中可能的作用。

1 nGPCR的來源及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

1.1 細(xì)胞表面來源nGPCR的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制 許多GPCR首先被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，經(jīng)過激活、內(nèi)化后再轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。在其中一些GPCR中包含經(jīng)典的核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)，即一段或兩段富含堿性氨基酸殘基的序列，該信號(hào)隨后被核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(karyopherin)超家族的特定成員識(shí)別為核內(nèi)蛋白，而后通過小GTP酶和(或)importin機(jī)制經(jīng)核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核。例如凝血因子Ⅱ受體1(又稱蛋白酶激活受體2，coagulation factor Ⅱ receptor-like 1 或 protease activated receptor 2，F(xiàn)2RL1或PAR2)在被配體激活并內(nèi)化后，其中含有的兩段NLS被importin β1識(shí)別，從而允許其在分選蛋白nexin11和動(dòng)力蛋白dynein的協(xié)助下沿著微管從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[4]。與F2RL1相似，激動(dòng)劑激活催產(chǎn)素受體(oxytocin receptor，OTR)導(dǎo)致β-arrestin介導(dǎo)其發(fā)生內(nèi)化，隨后核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白transportin-1與受體C端的NLS結(jié)合，將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核[5]。通常，NLS序列中任意氨基酸殘基的突變都會(huì)阻礙核蛋白的識(shí)別，從而阻止這些GPCR的核定位。

此外，還有一些nGPCR包含特殊的NLS序列，例如代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGlu5)中新確認(rèn)的靶向序列[6]，該序列對(duì)于mGlu5的核定位是充分必要條件，但其結(jié)構(gòu)并不符合NLS序列的一般規(guī)律。有趣的是，mGlu5 C端的這段靶向序列還包含幾個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，包括蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)[7]?？梢酝茰y(cè)，這段靶向序列的磷酸化可能影響受體與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合。

1.2 非細(xì)胞表面來源nGPCR的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制 這部分nGPCR并非由細(xì)胞膜內(nèi)化而來，而是在合成后被直接運(yùn)送到細(xì)胞核?；谕夂四づc內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連接，推測(cè)這類nGPCR可能通過側(cè)向擴(kuò)散機(jī)制到達(dá)細(xì)胞核，即由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成或逆向運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)可以先沿著外核膜快速擴(kuò)散至核孔復(fù)合體，而后穿過核孔復(fù)合物與核膜之間的外周通道[8]，最終通過與核纖層蛋白或染色質(zhì)的相互作用而被固定于內(nèi)核膜[9]。神經(jīng)元中有超過90%的mGlu5受體在高爾基體中轉(zhuǎn)運(yùn)加工，其中60%～85%的受體逆向運(yùn)輸返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并經(jīng)由外周通道側(cè)向擴(kuò)散至細(xì)胞核[10]，其余15%～40%則直抵細(xì)胞表面接收外部信號(hào)，這部分受體內(nèi)化后不再前往細(xì)胞核，而是返回細(xì)胞表面重新利用[11]。此外，近來發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)也存在蛋白質(zhì)的翻譯過程[12]，這提示nGPCR存在于細(xì)胞核內(nèi)直接合成的可能性。

2 nGPCR的激活途徑

在核膜上發(fā)現(xiàn)的nGPCR被牢牢地錨定于內(nèi)核膜或外核膜上；在核質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的nGPCR可能位于向核質(zhì)內(nèi)凹陷的核膜上，也可能與磷脂分子嵌合從而以膠束的形式分散在核質(zhì)中。目前已知nGPCR可以通過以下4條途徑被激活：

2.1 在細(xì)胞表面與配體結(jié)合后激活并內(nèi)化 細(xì)胞表面的GPCR首先在質(zhì)膜上大量表達(dá)，與配體結(jié)合后被激活并發(fā)生內(nèi)化。多數(shù)情況下，內(nèi)化后的配體-受體復(fù)合物或從其中分離出來的配體在早期胞內(nèi)體中被降解，而未被降解的受體則返回到細(xì)胞表面重新敏化，這種可與配體結(jié)合的受體數(shù)量暫時(shí)或長(zhǎng)時(shí)間減少的現(xiàn)象也被稱為受體脫敏。但在少數(shù)情況下，內(nèi)化的配體-受體復(fù)合物或從其中分離出來的受體隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核成為nGPCR，這也是上文所述細(xì)胞表面來源的nGPCR的主要類型。例如，在乳腺癌細(xì)胞和原代成纖維細(xì)胞中，熒光標(biāo)記的催產(chǎn)素受體和碘化催產(chǎn)素相結(jié)合并與之內(nèi)化至核膜[5,13]。細(xì)胞表面的F2RL1和PtAFR也以配體-受體復(fù)合物的形式轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核[4,14]。到達(dá)細(xì)胞核的nGPCR隨后通過不同的方式啟動(dòng)其相應(yīng)的下游信號(hào)通路。

2.2 與細(xì)胞外配體結(jié)合后激活 細(xì)胞外配體若要直接激活位于細(xì)胞核的nGPCR，必須穿過質(zhì)膜甚至是核膜。滲透性高的配體(例如內(nèi)源性大麻素[15])可通過自由擴(kuò)散穿過此類膜，而大分子或帶電荷的配體則需要借助選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如去甲腎上腺素[16])、交換泵(例如谷氨酸[17])等膜蛋白通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程或借助胞飲過程(例如尿素-Ⅱ[18])進(jìn)入細(xì)胞到達(dá)nGPCR。例如mGlu5受體的激活至少需要借助兩個(gè)攝取系統(tǒng)負(fù)責(zé)將谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元中：Na+依賴性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[17]。

2.3 與細(xì)胞內(nèi)配體結(jié)合后激活 除了攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外配體，細(xì)胞還能以“自分泌”的模式，在受體附近自身合成配體來激活nGPCR。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)在質(zhì)膜及核膜均有分布，在核PLA2的作用下，核膜水解最終生成血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)和溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)，從而激活其位于細(xì)胞核的同源受體[19]。其他類似的細(xì)胞內(nèi)合成配體還包括前列腺素E2等脂配體[20]及apelin、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)和緩激肽等肽配體[21]。與mGPCR作為啟動(dòng)者不同，細(xì)胞內(nèi)配體的合成往往由上游事件觸發(fā)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中屬于級(jí)聯(lián)放大的中間環(huán)節(jié)。有人認(rèn)為，細(xì)胞外的PAF和LPA似乎引發(fā)了其自身在細(xì)胞內(nèi)的生成，局部產(chǎn)生的核PAF和LPA激活附近的同源核受體，進(jìn)而誘導(dǎo)促炎基因的表達(dá)[22]。

2.4 非配體依賴性激活 除了上述3種配體依賴性激活之外，許多GPCR存在非配體依賴性激活，這意味著nGPCR或可單獨(dú)發(fā)揮功能。例如，mGlu5受體在Homer1a蛋白的作用下無激動(dòng)劑即可激活[23]。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽1受體(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor 1，PAC1)在不存在激動(dòng)劑的情況下也能被胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)下游的Src信號(hào)反式激活[24]。

3 nGPCR與mGPCR的比較

nGPCR通常與mGPCR具有相同的七螺旋結(jié)構(gòu)，但也存在例外，如Frizzled-2受體在細(xì)胞表面時(shí)為完整的全長(zhǎng)形式，但在轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核附近時(shí)發(fā)生裂解，僅其C端進(jìn)入細(xì)胞核中，而N端被留于核外[25]。此外，在某些情況下，nGPCR和mGPCR可能會(huì)經(jīng)歷不同的翻譯后修飾[26]。例如，細(xì)胞表面的內(nèi)皮素受體B(endothelin receptor type B，ETB)經(jīng)歷了N-糖基化作用，而在細(xì)胞核中該受體無此修飾[27]。

由于nGPCR與mGPCR所處的位置不同，二者所處的微環(huán)境也不同。大多數(shù)細(xì)胞外配體受滲透性的限制不能進(jìn)入細(xì)胞，因此，相較于在細(xì)胞表面接收細(xì)胞外配體的mGPCR，nGPCR可能更易于被細(xì)胞內(nèi)配體激活，這些細(xì)胞內(nèi)配體可以由位于nGPCR附近的酶在細(xì)胞內(nèi)合成。對(duì)于某些半衰期較短的不穩(wěn)定配體，例如PAF及LPA，這樣的空間分配能最大限度地避免配體在尚未發(fā)揮作用前降解，從而也確保了核受體微環(huán)境中配體的生物利用度。

某些nGPCR與其相應(yīng)的mGPCR可以誘發(fā)相同的效應(yīng)。例如核mGlu5受體與細(xì)胞表面mGlu5受體都能誘導(dǎo)產(chǎn)生Ca2+振蕩，對(duì)于突觸可塑性和紋狀體神經(jīng)元的生長(zhǎng)和分化具有相同的影響[28]。

更重要的是，nGPCR也能介導(dǎo)與mGPCR不同、甚至是完全相反的效應(yīng)。例如，激活細(xì)胞表面F2RL1促進(jìn)血管成熟，而激活核F2RL1則誘導(dǎo)血管生成[4]。細(xì)胞核前列腺素E2受體3(prostaglandin E2receptor 3，EP3)介導(dǎo)內(nèi)皮一氧化氮合酶eNOS表達(dá)，這恰恰與細(xì)胞表面EP3受體介導(dǎo)的血管快速收縮效應(yīng)相反[29]。在某些細(xì)胞中，受體的定位與功能還可能隨著細(xì)胞狀態(tài)的改變而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在未刺激的T細(xì)胞中，絕大多數(shù)鞘氨醇-1-磷酸受體1(sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1)位于細(xì)胞膜，參與細(xì)胞遷移；而在受刺激的T細(xì)胞中，大多數(shù)S1PR1被誘導(dǎo)入核，抑制細(xì)胞增殖[30]。

4 nGPCR與疾病治療

越來越多的證據(jù)表明，nGPCR參與了多種疾病的發(fā)生及發(fā)展，這些疾病包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及肝臟和腎臟的相關(guān)疾病。例如，脊髓背角神經(jīng)元中約有80%的mGlu5受體位于細(xì)胞內(nèi)，其中大部分(約60%)位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核中的mGlu5受體具有功能活性，并且與神經(jīng)性疼痛相關(guān)[31]。在許多疾病中，nGPCR呈現(xiàn)出相應(yīng)的病理變化，主要表現(xiàn)為分布密度的改變。例如，在腫瘤和心力衰竭等疾病中觀察到nGPCR水平上調(diào)，而在高血壓中其水平下調(diào)。半胱氨酰白三烯1受體(cysteinyl leukotrienes receptor 1，CysLT1R)在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，并且細(xì)胞核中CysLT1R的水平也顯著升高[32]；此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中也發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞核中血管活性腸肽受體1(vasoactive intestinal peptide receptor 1，VPAC1)的密度升高[33]。腫瘤細(xì)胞中nGPCR的水平上調(diào)可能是腫瘤產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一。在心力衰竭模型中，成纖維細(xì)胞核血管緊張素Ⅱ受體1(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1)的密度顯著增加，并參與膠原蛋白的表達(dá)和分泌以及細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[34]。相反，在大鼠高血壓模型中，腎臟細(xì)胞核AT1的表達(dá)減少，這可能是由于Ang Ⅱ水平升高引起的一種補(bǔ)償機(jī)制[35]。盡管已有以上研究基礎(chǔ)，但nGPCR在病理?xiàng)l件下的表現(xiàn)及其作用仍有待于進(jìn)一步的研究加以闡明，以評(píng)估其作為治療靶標(biāo)的可行性。

nGPCR的發(fā)現(xiàn)也為其靶向藥物的研發(fā)帶來了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。目前臨床上使用的藥物中約有30%靶向GPCR，其中超過80%作用于單胺能受體(包括腎上腺素能受體、膽堿能受體、組胺受體、多巴胺能受體和5-羥色胺受體)和阿片類受體，主要通過G蛋白的Gαi/o亞基(約38%)、Gαq/11亞基(約29%)和Gαs亞基(約24%)向下轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)[36]。盡管暫未獲得充分的證據(jù)支持，但可以推測(cè)這些藥物的部分療效可能是通過作用于nGPCR而實(shí)現(xiàn)的。例如，用于治療哮喘的CysLT1R選擇性拮抗劑(如孟魯司特)以及用于治療高血壓和心力衰竭的AT1受體拮抗劑(如氯沙坦)，這些藥物對(duì)nGPCR的作用很可能也是其臨床療效的潛在機(jī)制之一。除了直接作用于nGPCR外，藥物也可能通過改變nGPCR周圍微環(huán)境中配體的濃度，從而影響nGPCR對(duì)配體的利用，間接影響受體與配體的結(jié)合。

5 小結(jié)與展望

長(zhǎng)久以來，人們普遍認(rèn)為GPCR只作用于細(xì)胞表面，將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答。然而，隨著研究的不斷深入，GPCR在細(xì)胞核中的分布得到了證實(shí)，這刷新了人們對(duì)GPCR的傳統(tǒng)認(rèn)知，并大大增加了GPCR信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。nGPCR可能在其相應(yīng)mGPCR激活后被繼發(fā)激活，也可能獨(dú)立于mGPCR在其特異配體的調(diào)控下被單獨(dú)激活。因此，GPCR的最終下游效應(yīng)可能決定于細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路的疊加和整合。

現(xiàn)有的研究使人們對(duì)nGPCR及其特異信號(hào)在重要生理和病理過程中的參與有了更深的認(rèn)識(shí)。某些nGPCR在病理?xiàng)l件下密度發(fā)生改變，提示它們可能是藥物治療的潛在靶點(diǎn)。目前迫切需要對(duì)nGPCR開展更全面的藥理研究，以優(yōu)化GPCR靶向藥物的選擇性，從而獲得更精準(zhǔn)的治療效果。此外，還有必要重新審視臨床上現(xiàn)有GPCR靶向藥物的作用機(jī)制。總之，對(duì)nGPCR的新認(rèn)識(shí)突出了GPCR藥理學(xué)的復(fù)雜多樣性，強(qiáng)調(diào)不同亞細(xì)胞定位的GPCR在生理和(或)病理狀態(tài)下具有不同的功能，GPCR靶向藥物研究將因此迎來新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。