基因藥物肺部遞送系統(tǒng)的研究進展

李月，孫景鑫，金光玉，金勇，孫丹丹，全姬善

(1.延邊大學藥學院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學附屬醫(yī)院放射科，吉林 延吉 133000)

哮喘、肺氣腫、囊性纖維化、肺部病毒感染、肺癌等肺部疾病嚴重影響人類健康，治療方法在不斷探索。基因藥物針對遺傳性疾病和非遺傳性疾病的治療中，體內外研究均顯示出顯著的治療效果，被認為是當前最有前途的生物藥物之一[1]。目前，基因治療在肺部疾病的研究工作展開較多，這與肺部疾病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢且治療難度日益增大，對人類健康產生了嚴重的威脅有關[2]。本文將對肺部常見疾病、肺部給藥障礙以及給藥方式進行詳細綜述。

1 肺部疾病

1.1 囊性纖維化 囊性纖維化是一種常染色體隱性遺傳疾病[3]，該疾病會導致多種器官功能障礙，但是絕大多數(shù)患者死于肺部疾病[4]。囊性纖維化治療中，腺相關病毒在多項臨床實驗中被證明是安全的、轉染效率高的載體。現(xiàn)在面臨的問題有：具有功能性囊性纖維化跨膜電導調節(jié)劑的氣道表面細胞壽命有限，需要重復進行給藥；囊性纖維化患者的氣管和肺部環(huán)境在非靈長類動物模型無法建立；基因治療時選擇短期免疫抑制劑未在囊性纖維化患者進行測試，因此無法證明其可行性[5]。

1.2 哮喘 哮喘是常見的呼吸道疾病，兒童中最常見的非傳染性疾病。近年來，隨著社會環(huán)境和生活方式的改變，發(fā)病率有逐年升高的趨勢[6]。隨著對哮喘發(fā)病機制的進一步認識，哮喘已被確定為一種由多種炎性細胞所介導的慢性呼吸道炎癥性疾病[7]。當前治療哮喘最有效的方法為糖皮質激素類抗炎藥物，如 β2受體激動劑聯(lián)合茶堿類藥物治療、重組抗IgE人源化單克隆抗體。Norbert等[8]對一種新型mRNA進行臨床實驗評估，結果顯示生物標志物樣本中炎癥反應減弱，過敏性哮喘患者在過敏原激發(fā)后的哮喘反應顯著減弱?；蛑委煻嗖捎肈NA 重組技術，修復細胞中的缺陷基因，達到治療目的，雖然在治療哮喘領域的應用剛剛起步，但其革命性的治療理念為患者帶來新的希望而成為當前研究的熱點。

1.3 病毒感染 由病毒感染所引起的各種疾病嚴重威脅人類健康。肺部作為易受感染的部位之一，經常出現(xiàn)由上呼吸道感染引起的病毒性炎癥。特定序列的 siRNA能降解目標病毒RNA 或抑制宿主細胞目的基因的表達而影響病毒的復制，已被用作抗病毒劑在抵抗SARS 病毒、流感病毒等肺部感染方面取得了初步進展[9]。裸siRNA在給藥方面有很多阻礙[10]，經大量實驗證實[11]，安全有效的納米載體可有效遞送siRNA，這為進一步開發(fā)預防和治療人和動物流感病毒感染的siRNA提供了依據(jù)[12]。

1.4 肺癌 肺癌是我國首位的致死性惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展和轉移是一個極其復雜的多基因調控異常的過程[13]。在過去的20年中，治療重心已經從以細胞毒性治療轉變?yōu)橐苑蜗侔┖头切〖毎伟┲刑囟ǚ肿觼喰蜑榘悬c如EGFR、KRAS等[14]，通過核酸遞送來達到治愈疾病的目的[15]。當前，腺病毒載體和非病毒基因遞送載體在臨床試驗中均顯示出良好的成效[16-19]。

2 肺部給藥屏障

2.1 肺部生理結構 肺由大量肺泡組成，肺泡呈薄膜狀，由單層上皮細胞構成，是氣體交換的唯一場所。肺是人體毛細血管最豐富的器官。90%的肺泡面積都覆蓋毛細血管，成人毛細血管面積可達80 m2。相鄰肺泡的兩層上皮細胞膜之間分布著致密的毛細血管，而且毛細血管的上皮細胞膜與肺泡的上皮細胞膜是緊緊貼在一起，有利于藥物經肺部的吸收和轉運[20]。從右心搏出的血液幾乎全部通過肺，肺部血流量大，因此肺給藥后藥物吸收迅速；藥物經肺吸收后直接進入血液循環(huán)，避免肝首過效應，提高生物利用度；肺內的化學降解和酶降解活性低，適合生物活性大分子，如蛋白、核酸類藥物[21]。

2.2 藥物遞送肺部的障礙 由于肺部具有吸收面積大，降解酶少，肺泡通透性高，物質交換距離短等優(yōu)點，蛋白質和多肽也可通過肺泡表面被吸收[22]，將治療性藥物直接遞送到肺部病灶部位發(fā)揮治療作用將具有一定的優(yōu)越性。在臨床治療中治療效果受到多種因素的影響，包括肺部藥物遞送方面，面臨障礙如下：①氣道黏液纖毛清除系統(tǒng)：作為肺部最重要的防御機制之一，通過咳嗽等方式將傳導氣管中沉積的物質清除，健康的肺部僅需24 h即可完全清除沉積物，這對肺部藥物遞送是不利的；②病理狀態(tài)：病理狀態(tài)下，氣道黏液清除能力減弱；肺部氣道因哮喘等疾病導致狹窄，影響藥物的運輸和吸收；③化學屏障和免疫屏障：沉積藥物會在蛋白酶或表面活性劑等化學物質的作用下，被肺泡巨噬細胞吞噬清除[24]；④其他障礙：吸入劑的劑型、吸入器的選擇以及患者依從性等。

3 基因治療以及常見載體

基因治療是指將外源正?；驅氚屑毎?，以達到糾正或補償免疫缺陷和異常基因引起的疾病的目的[23]?；虔煼ㄓ?972 年被正式提出，并作為人類遺傳疾病的一種治療方式[24]。隨著分子生物學、動物模型構建、疾病靶向治療等研究領域的不斷發(fā)展，基因治療廣泛地應用于腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、基因遺傳病等疾病的治療[25]。

肺部是采用基因療法治療遺傳性疾病如囊性纖維化、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥以及其他疾病如肺癌、肺炎、肺血管疾病、哮喘的主要靶向器官[26]。疾病治療的關鍵在于將基因藥物成功遞送到肺部，所以需要安全有效的基因載體。當前基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體。在肺部基因治療中，無復制能力的重組腺病毒因具有較高的轉染效率使用最為廣泛，但其具有毒性和可引起局部或全身的免疫反應和炎癥反應限制了應用[27]。非病毒基因載體因其具有低免疫原性和無毒的特征受到了廣泛的關注，目前研究較多的非病毒肺部給藥載體主要有微球、聚合物納米粒、 脂質體、固體脂質納米粒、納米脂質載體、膠束等[28]，并且在一定程度上這些載體屬于緩控釋制劑，可以延長藥物作用時間，減少服藥頻率，提高患者依從性。

4 基因藥物肺部給藥系統(tǒng)

肺部給藥系統(tǒng)是藥物經特殊給藥裝置直接進入呼吸道發(fā)揮局部或全身治療作用的給藥系統(tǒng)[29]。肺部給藥在肺部局部疾病的治療、全身性的治療以及基因治療中極具發(fā)展前景，是蛋白質和多肽等非注射性藥物和其他治療性藥物較為方便有效的給藥途徑[30]。藥物能否被成功遞送到肺部有兩個重要的決定性因素：處方設計和給藥方式的選擇。

4.1 藥物處方設計 傳統(tǒng)的肺部給藥制劑存在藥效時間相對短、給藥次數(shù)多、患者依從性較差等缺點，開發(fā)具有緩控釋能力的新型肺部藥物傳遞系統(tǒng)從而實現(xiàn)肺部靶向性給藥，增加藥物在肺部的滯留時間，增加細胞內的藥物濃度，降低治療過程中對正常組織細胞的損傷，使難溶性藥物、蛋白質與多肽類藥物的生物利用度達到最大是當前研究的重點[31]。非病毒基因載體如陽離子脂質體、陽離子聚合物等不僅可以保護基因藥物免受破壞，還可以通過對載體進行修飾實現(xiàn)功能化的藥物遞送，所以非病毒基因載體受到了科研人員的廣泛關注。

影響藥物能否成功遞送到肺部的因素如下：肺吸入微粒的粒徑直接影響其在肺部的沉積形式和部位。粒徑>5.0 μm的顆粒會產生慣性碰擊在咽喉和上呼吸道；粒徑<5.0 μm的顆?？梢缘竭_肺泡區(qū)，以補充作用和彌散作用沉積在肺泡表面[32]；粒徑在1.0～5.0 μm的粒子主要以重力沉積形式到達呼吸道深部，沉積在氣管和肺泡表面；粒徑<0.5 μm的粒子由于布朗運動隨氣流呼出體外，通常80%被排出，基本不在呼吸道沉積。粒徑在1.0～3.0 μm的粒子在細支氣管和肺泡內沉積率最高，一般被選作肺吸入制劑的主要組成[22]。直徑小于2 μm的顆粒物進入肺泡后，可被肺巨噬細胞吞噬，轉染前清除肺巨噬細胞，轉染效率可提高90%[32]。

基因載體的修飾材料直接影響藥物的穩(wěn)定性。據(jù)報道[33]，霧化過程剪切力對基因藥物會造成破壞，陽離子脂質體和陽離子聚合物會保護基因藥物，提高對剪切力的耐受性。多種不同組分的陽離子脂質體可以增加穩(wěn)定性從而提高轉染效率。陽離子聚合物如聚乙烯亞胺和聚乙二醇可以有效地保護基因藥物免受破壞[34]，復合物的穩(wěn)定性取決于聚合物的分子量[35]。另外，在處方中加入適當氯化鈉也可提高復合物的穩(wěn)定性[36]。

4.2 肺部給藥方式

4.2.1 常規(guī)給藥途徑 靜脈注射給藥，也稱為全身遞送，是當前基因治療普遍采用的給藥方法。Hattori等[37]以基于DOTAP的脂質體作為載體通過靜脈注射的方式將siRNA遞送到MCF-7-Luc肺癌細胞轉移的異種移植小鼠中，可觀察到siRNA主要在肺中積累。然而有報道指出[38]，注射給藥遞送到的是肺部內皮細胞而不是上皮細胞，基因藥物容易被腎臟清除，肺內分布較少。

4.2.2 吸入給藥方式 目前，通過吸入給藥進行基因治療已被認為是肺部疾病最有希望的治療方法之一，特別是在肺癌治療中[39]。相較常規(guī)制劑，吸入劑的優(yōu)點在于：可以從肺部直接進入血液循環(huán)，起效快；局部給藥，提高藥物在靶器官的聚集，增加療效的同時降低毒副作用；無首過效應，生物利用度高[20]。采用吸入給藥的方式多分為以下幾種：

4.2.2.1 經鼻腔給藥 鼻內給藥是將藥物用移液槍或注射器少量滴注在小鼠鼻孔處，該方法只適用于小劑量的基因治療給藥。因鼻黏膜血管豐富，所以經鼻腔給藥具有藥物吸收快，生物利用度高的優(yōu)點；但是，經鼻腔給藥后，藥物大部分在口腔和鼻腔以及上呼吸道內，且分布不均勻易流失，無法到達下呼吸道和肺部。

4.2.2.2 氣管內給藥 氣管插管給藥是將實驗動物麻醉后，剝離氣管，將導管切口插入氣管，在動物吸氣時用注射器將藥物噴入氣管中。氣管插管給藥是在動物模型實驗中評價藥物肺部給藥最常見的一種方法[9]。該方法可對藥物進行定量評價，但是具有如下缺點：動物麻醉劑量難以掌握；術后動物無法存活，不能重復給藥。

氣管噴入或滴注給藥，是將給藥針插入氣管中，使藥物噴射或滴注到氣管中的一種給藥方法。氣管內滴注給藥時，動物仰臥姿勢、滴注裝置和滴注速度對藥物在肺部的分布有重要的影響：Hasegawa-Baba等[40]證實大鼠在仰臥45°時可避免藥物在氣管中堵塞，藥物分布良好，動物存活率高；與灌胃針等相比較，使用干粉噴霧肺部給藥裝置MicroSprayer Aerosolizer進行滴注時，藥物能更好地分布在肺部；滴注速度為慢速時，藥物懸浮液不能均勻的分散到肺中，而高速滴注具有良好的藥物分布。氣管噴入或滴注給藥可以多次重復給藥，可對藥物進行定量。氣管滴注不能成為測定藥物分布的實驗方法，原因如下：需要用到小動物喉鏡，MicroSprayer設備停產；大量滴注時藥物進入胃中；氣管滴注可導致肺部巨噬細胞數(shù)量增多，引起炎癥反應[41]。最近，Oiso等[42]提出采用負壓法將藥物遞送到肺部，并對該方法進行評估，發(fā)現(xiàn)對肺組織無傷害，該方法中藥物遞送量是由小鼠呼吸控制；此外，在彈性蛋白酶誘導的肺氣腫小鼠模型中使用可再生塌陷肺泡的藥物實驗結果表明，負壓方法對肺組織學具有顯著的治療作用。

4.2.2.3 霧化吸入給藥 霧化吸入給藥，是將動物置于密閉裝置中，使其被動吸入藥物，是模擬人吸入藥物的一種實驗方法。人可以進行主動呼吸將藥物吸收到肺，但是動物實驗中無法控制其吸入的藥物量。動物吸入藥物時，不僅會有藥物分散到動物的鼻腔、皮毛和裝置內部表面上，造成藥物的浪費，而且在吸入藥物前沒有將肺部氣體呼出，吸入后沒有足夠的時間停頓屏氣[24]，導致藥物也無法到達肺深部[23]。另外，藥物能否到達動物肺部依賴于霧化設備[38]，常見的霧化設備有靜電噴射式霧化機、機械振蕩霧化機、超聲霧化機及噴射式霧化機[42-44]。噴射霧化器的負載劑量與霧化劑量之間存在一定的差異，藥物在肺部的沉積少，造成了藥物的浪費；超聲霧化器可以調節(jié)霧化速度和霧滴大小，但是霧化時間長；機械振蕩霧化機為新一代霧化機，使用尚未普及，且價格昂貴，使用振動網(wǎng)篩霧化器Aerogen Ultra時，肺部劑量僅為負載劑量的34%，造成了大部分藥物的浪費；靜電噴射式霧化機例如AERx，可成功地將基因遞送到肺部，但目前AERx尚處于實驗室研發(fā)階段。

5 總結

通過基因治療的方式來治療肺部疾病是一種有前景的治療方法，目前肺部吸入給藥在干粉吸入劑、給藥裝置等方面取得可喜的成果，但肺部給藥的臨床治療效果易受藥物性質、劑型因素、給藥裝置和使用方法等眾多因素的影響。當前我們需要研發(fā)出更有利于基因轉染和產生更小顆粒的霧化器，實現(xiàn)藥物的大規(guī)模精準遞送，以及具有深層組織滲透能力的基因載體[30]。非病毒基因載體脂質聚合物作為一種新型藥物遞送系統(tǒng)，因制備簡單、毒性低而備受關注[45]，當前缺乏大量的動物實驗和體內數(shù)據(jù)的支撐，并且在安全性和穩(wěn)定性方面還需要繼續(xù)考察，這將成為今后科研工作者的研究重點。