人腦影像表型的基因組與暴露組廣度關聯(lián)研究

于春水

以MRI 為代表的腦影像技術可以準確評估人腦結(jié)構(gòu)與功能，其個體變異決定了人類認知功能及神經(jīng)精神疾病易感性的個體差異[1]。人腦結(jié)構(gòu)和功能的個體差異與遺傳變異、環(huán)境暴露、遺傳-遺傳交互作用、環(huán)境-環(huán)境交互作用及遺傳-環(huán)境交互作用有關。研究人腦結(jié)構(gòu)與功能個體差異的原因不僅有助于理解正常及異常腦功能的生物學機制，也有助于開發(fā)改善認知功能及防治神經(jīng)精神疾病的新技術。

由于單個遺傳變異或單個環(huán)境暴露對人腦結(jié)構(gòu)與功能的影響效應微弱，常需要較大的樣本才能識別更多的影響人腦結(jié)構(gòu)與功能的遺傳或環(huán)境因素。隨著大樣本綜合性數(shù)據(jù)的積累，有可能從整個基因組和整個暴露組中篩查影響人腦結(jié)構(gòu)與功能的遺傳因素、環(huán)境因素及其交互作用。本文將重點討論基因組廣度關聯(lián)研究（genome-wide association study, GWAS）、暴露組廣度關聯(lián)研究（exposomewide association study,ExWAS）、基因組廣度遺傳-遺傳交互作用研究、暴露組廣度環(huán)境-環(huán)境交互作用研究及基因組-暴露組廣度遺傳-環(huán)境交互作用研究在揭示人腦結(jié)構(gòu)與功能個體差異成因中的潛在價值及其面臨的挑戰(zhàn)。

1 人腦影像表型

近幾十年來，以MRI 為代表的腦影像技術快速發(fā)展，可以活體定量評估人腦結(jié)構(gòu)、功能、連接與網(wǎng)絡特性，進而得到一系列腦影像表型。例如，基于高分辨率結(jié)構(gòu)MRI 可以提取全腦體積、灰質(zhì)體積、白質(zhì)體積、皮質(zhì)下核團體積以及各個皮質(zhì)腦區(qū)的體積、厚度與表面積；基于任務態(tài)功能MRI 可以檢測各種任務或刺激誘發(fā)的腦激活及其激活腦區(qū)之間的效應連接；基于靜息態(tài)功能MRI 可以測量每個腦區(qū)的自發(fā)腦活動、腦區(qū)間功能連接及腦功能網(wǎng)絡拓撲屬性；基于擴散張量成像可以度量腦白質(zhì)完整性、腦區(qū)間解剖連接及腦結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡拓撲屬性；基于磁共振波譜成像可以檢測腦內(nèi)谷氨酸等代謝產(chǎn)物含量；基于動脈自旋標記成像可以定量測量每個腦區(qū)的腦血流量。這些腦影像表型已經(jīng)被廣泛用于評估神經(jīng)精神疾病病人的腦結(jié)構(gòu)、功能、連接與網(wǎng)絡異常[2-4]。腦影像表型在不同個體間存在差異，這種差異不僅與健康人認知功能的個體差異有關[5]，也與神經(jīng)精神疾病的臨床癥狀、治療反應、臨床預后的個體差異有關[6]。然而，腦影像表型個體差異的成因尚不清楚，值得深入研究。

2 腦影像表型的基因組廣度關聯(lián)研究

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）是指由單個核苷酸的改變而引起的DNA 序列改變，是最常見的遺傳變異。神經(jīng)影像遺傳學是研究遺傳變異與人腦影像表型之間關聯(lián)的一門科學。最初多是研究單個SNP 與單個腦影像表型的關系，而后演變?yōu)檠芯慷鄠€SNP 與單個腦影像表型或單個SNP 與多個腦影像表型的關系，目前人們多關注多個SNP 與多個腦影像表型的關系。以往多數(shù)研究的樣本量很小，由于統(tǒng)計效能不足，無法全面識別遺傳變異對腦影像表型的影響。近年來，隨著全基因組檢測技術的普及和大樣本神經(jīng)影像遺傳學數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，GWAS 被用來研究整個基因組所有SNP與多個腦影像表型之間的關聯(lián)。代表性的大樣本神經(jīng)影像遺傳學數(shù)據(jù)集包括：中國人影像遺傳學研究（Chinese imaging genetics, CHIMGEN）[7]、英國的 UK Biobank[8]、歐盟的IMAGEN[9]、美國的青少年腦與認知發(fā)育（adolescent brain and cognitive development,ABCD）[10]及由全球數(shù)十個項目組成的ENIGMA[11]。第一項大樣本腦影像表型GWAS 研究是由ENIGMA 聯(lián)盟完成的，發(fā)現(xiàn)rs7294919 與海馬體積有關，rs10784502 與顱內(nèi)體積有關[12]。隨后，該研究組[13-14]又發(fā)現(xiàn)了5 個影響殼核和尾狀核體積的遺傳位點以及199 個影響人腦皮質(zhì)厚度及表面積的遺傳位點。迄今為止，涉及人腦影像表型最全的GWAS 研究是基于UK Biobank 數(shù)據(jù)進行的，總計研究了3 144 個腦影像表型，發(fā)現(xiàn)了148 個顯著的遺傳-影像關聯(lián)[15]。然而，這些研究同時發(fā)現(xiàn)單個SNP只能解釋不足1%的腦影像表型變異，為此有人使用多基因風險分數(shù)來綜合性評估遺傳風險，再研究其與腦影像表型的關聯(lián)，結(jié)果也僅能解釋一部分表型變異，這也間接提示研究環(huán)境因素對腦表型變異影響的重要性。此外，所有GWAS 研究都是基于高加索人進行的，由于不同種族人群在等位基因頻率、連鎖不平衡結(jié)構(gòu)等方面存在異質(zhì)性，其結(jié)果能否應用到其他人群尚不清楚。雖然最近有研究者[16]提出了跨種族GWAS 的概念并成功應用到血細胞遺傳關聯(lián)研究中，但尚未應用到研究人腦影像表型。因此，開展非高加索人腦影像表型的GWAS 研究以及跨種族GWAS 研究是今后重要的方向。

3 腦影像表型的暴露組廣度關聯(lián)研究

環(huán)境暴露無處不在，也會影響人腦結(jié)構(gòu)與功能。暴露組學是指生命全周期中所有環(huán)境暴露的總和[17-18]，個體生命周期中每個時間點的某個腦影像表型都可以被看作是懷孕期間及出生后整個發(fā)育過程中所有環(huán)境暴露長時間共同作用的結(jié)果。神經(jīng)影像暴露組學可以系統(tǒng)研究整個生命周期中環(huán)境暴露與腦影像表型之間的關聯(lián)。暴露組可分為一般外在暴露、特殊外在暴露和內(nèi)在暴露。一般外在暴露多是對區(qū)域進行評價，包括溫度、濕度、綠色空間、空氣污染等物理環(huán)境因素以及人口密度、經(jīng)濟、交通、醫(yī)療及教育資源等社會經(jīng)濟因素；特殊外在暴露多是對個體進行評價，包括飲食、吸煙、飲酒、體育鍛煉等生活方式，以及心理創(chuàng)傷、欺凌、貧窮、吸毒等心理社會因素；內(nèi)在暴露是指人體內(nèi)在的環(huán)境或過程，包括代謝、激素、腸道菌群、氧化應激等，這些因素可以通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組及表觀遺傳組等組學技術進行評價。

神經(jīng)影像遺傳學研究已經(jīng)發(fā)展到大樣本無偏見的神經(jīng)影像基因組學研究，與之相比，神經(jīng)影像暴露組學研究尚處于起步階段。目前的研究一般多采用靶向的假設驅(qū)動的方法分析環(huán)境暴露與人腦影像表型的關系。例如，研究發(fā)現(xiàn)空氣污染與局部腦區(qū)的皮質(zhì)厚度有關[19]；鉛暴露與皮質(zhì)表面積有關[20]；綠色空間暴露與前額葉皮質(zhì)活動有關[21]；社會經(jīng)濟狀態(tài)與腦表面積有關[22]；城市生活與城市成長與局部腦激活有關[23]；心理社會壓力與腦發(fā)育有關[24]。

由于腦表型受許多環(huán)境因素的影響，只研究一個環(huán)境因素而未考慮其他環(huán)境因素可能會導致誤導性結(jié)果，或錯過真正影響該表型的環(huán)境因素。而神經(jīng)影像暴露組研究可以系統(tǒng)評估許多環(huán)境暴露與人腦結(jié)構(gòu)與功能的關聯(lián)。例如，暴露組廣度關聯(lián)研究可以用單個模型研究很多環(huán)境暴露與某個腦影像表型的關聯(lián)；影像表型組廣度關聯(lián)研究可以用單個模型研究很多腦影像表型與某個環(huán)境暴露的關聯(lián)；典型相關分析等多變量分析方法可以用單個模型評估多個環(huán)境暴露與多個腦影像表型的關聯(lián)[25]。人們還可以利用縱向暴露組數(shù)據(jù)研究環(huán)境暴露的累積效應及其對環(huán)境暴露的易感年齡窗，這對于開發(fā)針對性干預措施以減輕環(huán)境暴露的負面作用極為重要。

神經(jīng)影像暴露組研究面臨很多挑戰(zhàn)。首先，獲得使用不同方法測量的成千上萬環(huán)境變量的完整暴露組數(shù)據(jù)十分困難。因此，研究應盡可能包含更多的環(huán)境變量，最好能夠覆蓋環(huán)境暴露組的3 個維度。不同研究最好使用相同的或等效的工具評價環(huán)境暴露，這將使得比較不同人群的神經(jīng)影像暴露關聯(lián)成為可能。準確評價環(huán)境暴露是另一個挑戰(zhàn)。測量誤差和誤分類十分常見，需要開發(fā)能夠以高時空分辨率精確評估環(huán)境暴露的新方法。例如，基于衛(wèi)星遙感技術的環(huán)境觀測，基于可穿戴設備的生態(tài)瞬時評價，以及基于電子日記的心理社會評價等。其中，基于衛(wèi)星遙感技術的環(huán)境評價是一種可以獲得既往較長時間環(huán)境暴露信息的方法，只需要獲得被試既往的居住地信息，就可以得到過去數(shù)十年的物理環(huán)境暴露信息。LandSat 系列衛(wèi)星從1972 年起不間斷獲取地球圖像，據(jù)此可以反演出植被覆蓋、夜間燈光、空氣污染、氣候等很多有價值的高時空分辨率的縱向環(huán)境指標。例如，可評價綠色空間暴露的標準化差異植被指數(shù)（normalized difference vegetation index,NDVI）的時間覆蓋達到了50 年，空間分辨率達到了30 m，時間分辨率達16 d。

個體環(huán)境暴露在整個生命周期中不斷變化，需要研究者考慮其時間變異性。最理想的方式是連續(xù)不斷地觀察整個生命周期中的環(huán)境暴露，但對多數(shù)環(huán)境變量來講，這是一個幾乎不可能完成的任務。另一種方法是收集一些關鍵時間點的暴露信息。例如，出生前、兒童期和青春期等關鍵腦發(fā)育期。在暴露組數(shù)據(jù)采集方面，CHIMGEN 項目[7]采用了一系列可行的方法，包括：①基于被試居住史，通過衛(wèi)星遙感技術獲取整個生命周期的NDVI、夜間燈光、氣候等一般外在物理環(huán)境暴露信息；②基于國家統(tǒng)計局發(fā)布的歷史數(shù)據(jù)獲得被試所在省份的人口密度、GDP、人均收入等一般外在社會經(jīng)濟環(huán)境暴露信息；③通過問卷調(diào)查獲得被試不同年齡階段吸煙、飲酒、社會經(jīng)濟狀態(tài)、心理創(chuàng)傷等特殊外在環(huán)境暴露信息；④基于血液標本獲得重金屬含量、氟化物含量、基因表達、DNA 甲基化等內(nèi)在環(huán)境暴露信息。

神經(jīng)影像暴露組學還面臨方法學挑戰(zhàn)。一是來源于大樣本數(shù)據(jù)本身的統(tǒng)計誤差。暴露組數(shù)據(jù)容易發(fā)生測量誤差和誤分類，解決辦法是使用最準確的測量工具采集小部分被試的環(huán)境暴露數(shù)據(jù)，用于識別和校正這種誤差；也可以通過識別奇異值的方式尋找測量誤差較大的被試，并進行校正。二是暴露組學研究中數(shù)據(jù)缺失很常見，會直接影響統(tǒng)計結(jié)果。建議根據(jù)數(shù)據(jù)缺失的機制（完全隨機、隨機及非隨機），選擇期望最大化、鏈等式多變量插補（multivariate imputation by chained equation,MICE）等方法插補缺失的數(shù)據(jù)[26]。三是對大樣本數(shù)據(jù)而言，有時會遇到只有一部分被試采集了某個環(huán)境指標，只對這部分被試進行分析可能會導致選擇性誤差，可以用逆概率加權等方法進行評估與校正。四是多中心數(shù)據(jù)在中心之間的差異不容忽視，建議使用ComBat 等工具進行標準化[27]。為了獲得可靠的結(jié)果，對于數(shù)據(jù)驅(qū)動的研究，獨立數(shù)據(jù)驗證也是必不可少的步驟。

環(huán)境暴露變量之間高度相關使得常用的線性統(tǒng)計模型無法區(qū)分具有因果效應的環(huán)境變量，以及與這些變量相關的環(huán)境變量。因此，需要變量選擇或數(shù)據(jù)降維來應對暴露組自身的自相關結(jié)構(gòu)。圖單元進化隨機搜索（graphical unit evolutionary stochastic search,GUESS）、刪除-替代-添加（deletionsubstitution-addition,DSA）和彈性網(wǎng)絡等變量選擇技術是預測性方法，可以選出與腦影像表型相關的環(huán)境變量[28]。但是，如果未能將因果環(huán)境變量代入模型，這些技術將無法檢出這些環(huán)境變量。主成分分析和因子分析等數(shù)據(jù)降維技術可以通過少數(shù)正交的成分或因子捕捉到許多環(huán)境暴露的方差，但這類方法所得到的結(jié)果高度依賴于被選擇的組分或因子的數(shù)目。稀疏偏最小二乘回歸（sparse partial least squares regression, SPLSR）可以同時捕捉到環(huán)境和影像指標的方差，不受多重共線性影響且不容易發(fā)生過擬合，但是其結(jié)果缺乏可解釋性[29]。目前暴露組廣度關聯(lián)研究尚無標準化流程，因此系統(tǒng)模擬不同模型的效能十分必要。值得注意的是，這些方法只能得到相關結(jié)果，不一定是因果聯(lián)系，需要生物學實驗判斷因果。暴露-時間-響應關系十分復雜，需要同時考慮線性與非線性關聯(lián)。分布滯后非線性模型（distributed lag non-linear model,DLNM）就可以同時估計非線性暴露-響應關系和滯后-響應關系[30]。

4 腦影像表型的基因組廣度遺傳-遺傳交互作用研究

一般統(tǒng)計學要求樣本量要遠遠大于研究變量的個數(shù)才能得到可靠的統(tǒng)計結(jié)果，然而人類存在超過5 000 萬SNP，SNP-SNP 組合形成的變量數(shù)目還要高出多個數(shù)量級，因此研究所有SNP 之間的交互效應面臨嚴峻的統(tǒng)計學挑戰(zhàn)。此外，SNP 之間的交互效應十分復雜，包括加性效應、顯性效應、隱性效應及上位效應，這進一步加劇了研究的難度。由于基于GWAS 結(jié)果的多基因風險分數(shù)可以反映SNP之間的加性效應，但無法反映上位效應，而且上位效應遠較顯性和隱性效應普遍，所以研究SNP 之間的上位效應至關重要。以往的腦影像表型的上位效應研究多是探討候選的二階交互作用，即2 個SNP之間的上位效應。雖然基因組廣度二階交互作用尚未用于研究腦影像表型，但在其他研究領域已經(jīng)開始應用。一般采用兩步式分析方法，即在篩選SNP的基礎上進行上位效應分析。SNP 篩選的主要方法包括：①GWAS 主效應篩選法，根據(jù)GWAS 結(jié)果設定一個顯著性閾值，篩選出具有顯著主效應的SNP進行交互作用研究；②生物學知識篩選法，基于轉(zhuǎn)錄、翻譯、信號通路等生物學知識來篩選SNP；③性狀方差篩選法，對于某個SNP 而言，GWAS 分析只是考慮該SNP 基因型之間腦影像表型均數(shù)的差異，而忽略了基因型之間表型方差的不同。基因型之間表型方差不同的原因有很多，其中SNP-SNP 交互作用是其重要原因之一。因此，可以基于基因型之間性狀方差來篩選可能存在交互作用的SNP[31]。研究二階SNP-SNP 交互作用的工具包括：①BiForce，是專門為在全基因組水平研究二階交互作用而設計的高通量分析軟件，計算效率高是其特點[32]；②多因素降維，既可以分析二值性狀，也可以分析量化性狀。然而，二階交互作用只考慮2 個SNP 的交互作用，而實際上可能存在更多SNP 的交互作用，因此開發(fā)了貝葉斯高階交互工具包[33]和量化多因素降維等研究SNP 之間高階交互作用的軟件。人類有20 000 多個基因，研究基因之間的交互作用，既可以增加統(tǒng)計效能，又可以增加結(jié)果的可解釋性。

5 腦影像表型的暴露組廣度環(huán)境-環(huán)境交互作用研究

環(huán)境因素對人腦表型的影響也存在復雜的交互作用，可以是協(xié)同效應也可以是拮抗效應。協(xié)同效應是指2 個環(huán)境因素對腦影像表型的聯(lián)合效應大于這2 個因素的獨立效應之和；而拮抗效應是指2 個環(huán)境因素對影像表型的聯(lián)合效應小于這2 個因素的獨立效應之和。除了暴露組廣度關聯(lián)研究所面臨的問題以外，暴露組廣度環(huán)境-環(huán)境交互作用研究還將面臨更高的維度。雖然少數(shù)研究探討了2 個環(huán)境因素對腦影像表型的交互作用，但目前尚無關于腦影像表型的暴露組廣度環(huán)境-環(huán)境交互作用研究的報道。一種潛在的研究思路是在采用聚類技術將環(huán)境變量分為不同的類別的基礎上，對每類環(huán)境變量進行主成分分析或因子分析，將其轉(zhuǎn)化數(shù)個代表性變量（隱變量）。通過這種變換可以明顯減少被分析環(huán)境變量的個數(shù)，而且能夠保證環(huán)境變量之間的獨立性，進而滿足線性回歸分析的應用前提。由于環(huán)境暴露具有時間變異性，環(huán)境-環(huán)境交互作用也可能存在敏感年齡窗，如何識別交互作用的敏感年齡窗是一個需要解決的問題。

6 腦影像表型的基因組-暴露組廣度遺傳-環(huán)境交互作用研究

與上述4 類研究相比較，基因組-暴露組廣度遺傳-環(huán)境交互作用研究涉及的變量數(shù)目最多，多重比較校正的壓力最大，需要的樣本量也最大。因此，合理降低遺傳和環(huán)境數(shù)據(jù)的維度是關鍵。前面提到的遺傳數(shù)據(jù)和環(huán)境數(shù)據(jù)降維的方法也都適用于基因組-暴露組廣度遺傳-環(huán)境交互作用研究。即便如此，篩選出的遺傳變量和環(huán)境變量仍然數(shù)量很大，需采用特定方法來識別遺傳-環(huán)境交互作用。例如，迭代獨立性篩查（iteration sure independence screening,ISIS）[34]、基于距離相關的交互作用篩查（interaction pursuit via distance correlation, IPDC）[35]、結(jié)構(gòu)線性混合模型（structured linear mixed model，StructLMM）[36]等。IPDC 具有運算效率高、可同時考慮多個腦影像表型以及能夠同時篩選具有主效應和交互效應的變量等優(yōu)勢。StructLMM 可以通過一個模型研究單個遺傳變異與多個環(huán)境暴露的交互作用。

7 小結(jié)

從基因組和暴露組廣度研究人腦結(jié)構(gòu)與功能個體差異形成的原因，對理解人類高級腦功能及神經(jīng)精神疾病易感性具有重要意義。雖然基因組廣度遺傳-影像關聯(lián)分析的方法學體系已經(jīng)建立并取得了突破性進展，然而暴露組廣度環(huán)境-影像關聯(lián)研究、基因組廣度遺傳-遺傳交互作用研究、暴露組廣度環(huán)境-環(huán)境交互作用研究及基因組-暴露組廣度遺傳-環(huán)境交互作用研究仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。這需要全球合作收集高質(zhì)量更大樣本的數(shù)據(jù)并制定適宜的統(tǒng)計分析策略。這些研究不僅有助于發(fā)現(xiàn)更多的影響人腦結(jié)構(gòu)與功能的關鍵因素，也有助于更好地理解這些因素與認知及神經(jīng)精神疾病的關聯(lián)。