雌激素在椎間盤退變中的抗細(xì)胞凋亡作用

張池 宋凱 丁凡

椎間盤作為人體最大的無血管組織，由連接椎體的纖維軟骨組成。這種纖維軟骨組織可分為纖維環(huán)軟骨(AF)、髓核(NP)和軟骨終板(EP)。作為類固醇激素，雌激素主要在卵巢中產(chǎn)生，小部分由腎上腺、雄性睪丸和脂肪組織產(chǎn)生。婦女體內(nèi)有3種雌激素，即雌酮(E1)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)。E2是女性體內(nèi)主要有效的雌激素[1]。雌激素的生理作用主要通過雌激素受體(ER)來實(shí)現(xiàn)。ER家族中有2種經(jīng)典的亞型，即ERα和ERβ[2]。近期有研究檢測(cè)到G蛋白偶聯(lián)跨膜受體30(GPR30)也在人脊柱中表達(dá)[3]。退化椎間盤細(xì)胞的行為改變、數(shù)量減少和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降低與椎間盤退變(IVDD)啟動(dòng)高度相關(guān)，椎間盤細(xì)胞過度凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞密度降低和ECM分解代謝[4]均在IVDD中起關(guān)鍵作用。IVDD中發(fā)生最重要的生化變化是蛋白聚糖損失[5]。在IVDD中，大量椎間盤細(xì)胞經(jīng)歷了程序性細(xì)胞死亡。目前認(rèn)為NP細(xì)胞異常凋亡和加速衰老是與IVDD相關(guān)的主要細(xì)胞過程[6]，這意味著NP細(xì)胞凋亡可能是治療IVDD的重要靶標(biāo)。而雌激素可以通過抑制椎間盤細(xì)胞的異常凋亡來有效緩解IVDD進(jìn)展。

1 抑制炎癥因子

椎間盤發(fā)生炎癥時(shí)，白細(xì)胞介素 (IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-6等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生加劇，可促進(jìn)ECM降解，引起椎間盤細(xì)胞衰老和死亡，從而導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)功能受損[7-8]。炎癥介質(zhì)被認(rèn)為是IVDD發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素，目前由IL-1β和TNF-α引起的炎癥事件一直被認(rèn)為在IVDD發(fā)生發(fā)展過程起著關(guān)鍵作用[8]，且IL-1β和TNF-α及其受體在人椎間盤組織中表達(dá)，IL-1β和TNF-α水平隨著體內(nèi)IVDD程度的加劇而增加[9-10]。研究證實(shí)，IL-1β和TNF-α可引起椎間盤細(xì)胞凋亡，是誘導(dǎo)ECM變性的原因[11]。同時(shí)，椎間盤中膠原蛋白和聚集蛋白聚糖生成也可受TNF-α抑制[12]。Liu等[13]報(bào)道，雌激素可減輕TNF-α誘導(dǎo)的人NP細(xì)胞凋亡。Wang等[14]研究證實(shí)，17β-E2通過刺激磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶b(Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路保護(hù)人NP細(xì)胞免受TNF-α誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可刺激大鼠NP細(xì)胞p53和p16表達(dá)，下調(diào)ECM含量，并產(chǎn)生活性氧(ROS)；補(bǔ)充雌激素可增強(qiáng)NP細(xì)胞增殖活性，增加聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。Wang等[15]研究雌激素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的AF細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)雌激素可減弱IL-1β誘導(dǎo)的AF細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)炎癥刺激下AF細(xì)胞存活和增殖，這表明雌激素能下調(diào)IL-1β活性。Yang等[16]通過給予IL-1β確定雌激素在體外對(duì)NP細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示IL-1β可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3和MMP-13高表達(dá)，并抑制金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)表達(dá)，不僅加重ECM變性，而且下調(diào)Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖表達(dá)，并抑制NP細(xì)胞活力和黏附能力，而雌激素通過調(diào)節(jié)MMP與TIMP之間的平衡，并逆轉(zhuǎn)Ⅱ型膠原蛋白合成的降解，對(duì)NP細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用。 TIMP通過抑制MMP活性在維持ECM穩(wěn)態(tài)中起重要作用。IL-1β破壞MMP與TIMP之間的平衡可能是IVDD進(jìn)展的潛在機(jī)制。Yang等[16]研究顯示，給予IL-1β不僅加重ECM變性，而且下調(diào)Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖表達(dá)，并抑制NP細(xì)胞活力和黏附能力，而雌激素能逆轉(zhuǎn)這一過程。通常炎癥在體內(nèi)外對(duì)椎間盤都是有害的，而雌激素可能有助于減輕IVDD炎癥發(fā)展。越來越多的研究表明，雌激素可能在體外炎癥條件下通過ERβ促進(jìn)大鼠椎間盤細(xì)胞活化和增殖。然而，目前尚未見雌激素如何發(fā)揮抗炎作用來保護(hù)體內(nèi)椎間盤的報(bào)道。

2 調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化水平

Jin等[17]研究更年期婦女椎間盤氧化還原平衡，發(fā)現(xiàn)抗氧化劑能力因雌激素減少而降低。這些抗氧化劑紊亂會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而可能導(dǎo)致椎間盤受損。而雌激素可以增強(qiáng)抗氧化劑能力，血清中的雌激素水平與氧化還原平衡呈負(fù)相關(guān)。近期有體外研究表明，高糖培養(yǎng)的NP細(xì)胞通過氧化損傷對(duì)自身生物學(xué)產(chǎn)生不利影響，如降低細(xì)胞活力和促進(jìn)ECM降解[18-19]。Yang等[20]研究顯示，在高糖模型下補(bǔ)充雌激素可減輕NP細(xì)胞凋亡，并上調(diào)NP基質(zhì)產(chǎn)生；雌激素可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的NP細(xì)胞內(nèi)ROS異常產(chǎn)生。寧勝華[21]研究認(rèn)為，17β-E2可以劑量依賴性方式有效保護(hù)大鼠NP細(xì)胞免受過氧化物誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡，這表明17β-E2具有預(yù)防IVDD發(fā)展的潛力或可減慢其進(jìn)程。

3 通過p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)ECM合成

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白[22]。有研究表明，p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在椎間盤NP區(qū)域內(nèi)的ECM合成和細(xì)胞活性中起著重要作用[23-24]。此外，多項(xiàng)研究表明E2可激活p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[25-26]，且ERβ參與此通路的激活[27]。因此，ERβ與p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是相互聯(lián)系的。Li等[28]采用免疫染色法和糖胺聚糖(GAG)含量分析研究NP細(xì)胞中的ECM合成，結(jié)果表明E2以濃度依賴性方式促進(jìn)NP細(xì)胞中的ECM合成，且隨著E2濃度升高，p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活也增加；進(jìn)一步分析表明，ERβ激動(dòng)劑ERβ041和ERβ拮抗劑PHTPP可分別增強(qiáng)和抑制E2對(duì)NP細(xì)胞ECM合成的影響，而抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可顯著消除E2對(duì)ECM合成的影響，證實(shí)了雌激素可通過p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)ECM合成。

4 上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Wang等[14]將NP細(xì)胞分為對(duì)照組、TNF-α組、預(yù)處理17β-E2的TNF-α組及預(yù)處理17β-E2的TNF-α和MK2206(Akt途徑抑制劑)組，結(jié)果顯示雌激素可有效保護(hù)NP細(xì)胞免受TNF-α誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡，且給予TNF-α和17β-E2后，磷酸化Akt表達(dá)通常以時(shí)間依賴性方式增加，而MK2206抑制了17β-E2的抗凋亡作用，因此認(rèn)為雌激素通過上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少NP細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)研究也表明，E2和白藜蘆醇(一種天然的多酚化合物，被稱為植物雌激素)通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)抗大鼠NP細(xì)胞中IL-1β誘導(dǎo)的凋亡；單獨(dú)使用E2和白藜蘆醇時(shí)，兩者均可降低NP細(xì)胞凋亡發(fā)生率，而E2與白藜蘆醇聯(lián)合使用可更有效地減少NP細(xì)胞凋亡[29]。但由于E2具有較高的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，而白藜蘆醇具有較低的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，兩者作用相反，因此兩者聯(lián)用的致癌性尚不清楚，需對(duì)其不良反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

5 促進(jìn)自噬

研究發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)是一種構(gòu)建饑餓細(xì)胞模型的方法，血清剝奪可減少細(xì)胞代謝的能量，不僅可上調(diào)NP細(xì)胞中MMP-3和MMP-13的表達(dá)，誘導(dǎo)NP細(xì)胞凋亡，而且可誘導(dǎo)NP細(xì)胞自噬，同時(shí)不同濃度的E2可抑制MMP表達(dá)，減少NP細(xì)胞凋亡，而此時(shí)血清剝奪下的自噬水平進(jìn)一步上調(diào)，表明雌激素可通過促進(jìn)自噬降低NP細(xì)胞凋亡[30]。

6 上調(diào)整合素表達(dá)

氟喹諾酮類藥物已被證明具有廣泛的抗菌作用，且其毒性反應(yīng)相對(duì)較低。但由于在臨床中的廣泛應(yīng)用，它們對(duì)骨骼系統(tǒng)的毒性反應(yīng)引起了學(xué)者們的重視[31]。近期有研究表明，氟喹諾酮類藥物具有一定程度的細(xì)胞毒性，可以在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32-33]。Yang等[34]使用左氧氟沙星構(gòu)建細(xì)胞凋亡模型以研究雌激素對(duì)大鼠NP細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示左氧氟沙星不僅增加了NP細(xì)胞凋亡的百分比，而且還通過下調(diào)整合素α2β1表達(dá)，降低NP細(xì)胞與Ⅱ型膠原蛋白結(jié)合的能力。整合素α2β1是整合素β1家族的一種亞型，具有介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)成分相互作用的能力[35]，并可特異性地結(jié)合Ⅱ型膠原[36]。雌激素對(duì)左氧氟沙星誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用具有劑量和時(shí)間依賴性，可以逐漸調(diào)節(jié)整合素α2β1表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)NP細(xì)胞的黏附能力[34]。此外，Zhao等[37]也報(bào)道了E2通過整合素α1介導(dǎo)的Ⅰ型膠原黏附作用保護(hù)大鼠AF細(xì)胞凋亡。

7 抑制MMP

ECM分子包括Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖和其他基質(zhì)蛋白，這些分子可以連續(xù)合成并被局部存在的蛋白酶降解，以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。但是，當(dāng)平衡遭到破壞時(shí)，降解產(chǎn)物可能導(dǎo)致炎癥，包括MMP-3和MMP-13在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)MMP是椎間盤變性期間ECM降解的最主要酶，可特異性降解ECM成分，促進(jìn)IVDD[38-39]。Yang等[16]對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞采用TUNEL法和膜聯(lián)蛋白V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)IL-1β可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可減弱細(xì)胞活力并降低結(jié)合能力，同時(shí)E2可消除所有檢測(cè)到的IL-1β作用；使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖、TIMP-1水平，上調(diào)MMP-3和MMP-13水平，證實(shí)雌激素通過下調(diào)MMP水平減少NP細(xì)胞凋亡。隨后Liu等[40]在大鼠椎間盤穿刺模型中發(fā)現(xiàn)，17β-E2在大鼠體內(nèi)也可通過下調(diào)MMP-3和MMP-13水平及上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白水平有效緩解IVDD進(jìn)展。

8 線粒體途徑

線粒體途徑受核因子(NF)-κB和Bcl-2等蛋白的調(diào)節(jié)[41-44]。研究表明，IL-1β與血清剝奪一起對(duì)大鼠NP細(xì)胞具有毒性作用，其特征在于細(xì)胞凋亡增加和Ⅱ型膠原結(jié)合能力降低。與IL-1β相反，E2可保護(hù)大鼠NP細(xì)胞避免凋亡，其特征在于Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖合成增加及細(xì)胞活力和結(jié)合能力增強(qiáng)。同時(shí)，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)水平經(jīng)IL-1β處理后上調(diào)，而經(jīng)E2處理后明顯降低[16]。研究報(bào)道，NF-κB活化可促進(jìn)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程(包括增殖、生長和黏附)的分子表達(dá)，炎癥因子TNF-α可顯著促進(jìn)NP細(xì)胞中ROS生成，而E2可顯著降低經(jīng)TNF-α處理的NP細(xì)胞中的ROS生成[6]。Li等[6]進(jìn)一步分析了NP細(xì)胞的NF-κB活性，結(jié)果表明與對(duì)照NP細(xì)胞相比，經(jīng)TNF-α處理的NP細(xì)胞中NF-κB活性增加，而E2可抑制經(jīng)TNF-α處理的NP細(xì)胞中的NF-κB活性，此外E2對(duì)NF-κB活性的作用可受ER拮抗劑ICI 182780抑制；因此推測(cè)，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與E2對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NP細(xì)胞衰老的保護(hù)作用。眾所周知，Bcl-2和NF-κB參與線粒體凋亡的調(diào)控。因此，雌激素可能是通過線粒體凋亡來減少椎間盤細(xì)胞凋亡，其相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

9 結(jié)語

雌激素以多種方式如抑制炎癥因子、減少氧化損傷、促進(jìn)自噬、上調(diào)整合素、抑制MMP及通過p38 MAPK和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、線粒體途徑等減少椎間盤細(xì)胞凋亡。以往針對(duì)IVDD的雌激素替代療法的臨床實(shí)踐研究很少，因此需進(jìn)一步研究。