低能量激光照射療法調節(jié)間充質干細胞生物學效應研究進展

思黛偉 王新濤

間充質干細胞(MSC)在組織工程和再生醫(yī)學中有重要作用，低能量激光照射療法(LLLT)可以促進MSC的增殖及成骨分化，被認為是組織工程中很重要的影響因素[1-2]。LLLT是指細胞或組織暴露于弱光后，通過特殊的光電子效應調節(jié)其生物學功能[3]。LLLT對MSC生物學效應的調節(jié)作用受到許多因素影響，可表現(xiàn)為正向或負向調節(jié)。隨著研究的深入，LLLT對細胞的正向調節(jié)作用得到越來越多的重視。然而，許多研究中所選擇的LLLT參數(shù)存在差異，導致研究結論不一致[4-5]，使得現(xiàn)有的LLLT對MSC的生物學效應的研究數(shù)據難以令人信服，并阻礙了LLLT應用的標準化。

1 對MSC生物學效應的影響

1.1 細胞增殖

實驗研究結果顯示LLLT能促進MSC增殖。Min等[4]用LLLT處理體外培養(yǎng)的MSC,隨后將其移植入大鼠體內，發(fā)現(xiàn)LLLT不僅可以促進MSC在體外增殖，也可以促進其在體內增殖。Cavalcanti等[6]認為，LLLT促進MSC增殖與細胞周期改變相關。LLLT能促進MSC向G2/M期轉變，從而導致細胞快速增殖，且轉變程度隨LLLT能量密度的增加而增加。然而也有一些研究顯示，不適當?shù)腖LLT對MSC具有不良效應，表現(xiàn)為抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡等，這些不良效應可能與MSC內活性氧(ROS)生成增加和DNA損傷相關[5]?？偠灾琇LLT對MSC增殖的效應受多種因素影響。

1.2 成骨分化及礦化

MSC分化為成骨細胞是發(fā)揮成骨作用促進骨再生的重要保障，該分化過程可分為2個階段：第一階段在1～2周內，此時細胞緩慢增殖，表達堿性磷酸酶(ALP)活性和骨特異性基因，并產生膠原基質；第二階段在2周后，此時基質礦化形成結節(jié)，礦化結節(jié)是MSC成骨分化后期的重要生物學標志。Zhang等[7]的研究結果表明，在成骨誘導基上LLLT可促進MSC向成骨分化，并產生礦化結節(jié)；茜素紅染色結果顯示，LLLT組MSC產生的礦化結節(jié)數(shù)量明顯多于單純成骨誘導劑組。眾所周知，由去卵巢大鼠骨髓獲得的MSC(OVX-BMSC)成骨能力受損。而Fallahnezhad等[8]報道，LLLT也能促進OVX-BMSC在成骨誘導過程中形成礦化結節(jié)。

2 基本參數(shù)

LLLT對MSC的生物學效應受多個基本參數(shù)的影響。

2.1 波長

LLLT對MSC的生物學效應受波長影響。LLLT的主要應用波長為420～1 064 nm，最常應用的波長段為420～540 nm(藍綠光)和660～810 nm(紅光及近紅外光)，兩者均可促進MSC的成骨分化，后者還可促進MSC的增殖。Zhu等[9]使用波長為420～480 nm的LLLT來調節(jié)MSC，發(fā)現(xiàn)LLLT使MSC的細胞增殖降低，但可顯著促進Ⅰ型膠原蛋白、RUNT相關轉錄因子2(Runx2)、骨鈣素等成骨基因的表達，提高成骨分化標志物ALP的活性，增加礦化結節(jié)數(shù)量。Merigo等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，波長為532 nm的LLLT可促進MSC的成骨分化及其細胞外基質的礦化，但對MSC的增殖影響較小。Fekrazad等[11]研究不同波長LLLT對MSC的影響，發(fā)現(xiàn)波長為810 nm的LLLT促進MSC增殖和成骨分化的效果最強，其次為660 nm波長的LLLT，而532 nm波長的LLLT抑制細胞增殖的作用最強。同樣，Wang等[12]對比研究4種不同波長LLLT(420 nm、540 nm、660 nm、810 nm)對MSC增殖及成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)660 nm和810 nm波長的LLLT能促進MSC的增殖和成骨分化，與之相比，420 nm和540 nm波長的LLLT在促進MSC向成骨細胞分化方面雖然更有效，但卻抑制MSC的增殖。

綜上所述，420～540 nm波長的LLLT雖然可以促進MSC向成骨分化，但抑制MSC的增殖；660～810 nm波長的LLLT既可促進MSC增殖，又能促進成骨分化，是LLLT調節(jié)MSC生物學效應較為理想的波長。此外，聯(lián)合不同波長的LLLT對MSC的生物學效應也有影響。Zare等[13]的實驗研究發(fā)現(xiàn)，雙波長(630 nm和810 nm)LLLT能顯著促進MSC增殖。近年有學者報道，使用多波鎖定系統(tǒng)同步發(fā)射2種波長(808 nm和905 nm)的LLLT可明顯促進MSC的增殖[14]。

2.2 能量密度

能量密度是LLLT中重要的基本參數(shù)，其可影響LLLT對MSC的生物學效應，并使LLLT遵循“Arndt-Schultz定律”，即太弱的刺激不會引起任何生物學反應，而太強的刺激則具有抑制作用[15]。文獻報道，能量密度為0.3～12 J/cm2時有利于LLLT調節(jié)MSC的生物學效應。Mccolloch等[3]進行研究采用能量密度為1～12 J/cm2的LLLT連續(xù)3 d照射MSC，結果顯示能量密度與MSC的增殖效應呈正相關，LLLT可誘導G0/G1期細胞向G2/M期轉變，從而促進MSC的增殖。Wang等[16]使用能量密度分別為2、4、8、16 J/cm2的LLLT對正常或炎性環(huán)境下的MSC進行間隔1 d照射1次，7 d后檢測細胞的增殖及成骨分化情況。他們發(fā)現(xiàn)，能量密度為4 J/cm2的LLLT能顯著促進MSC的增殖和成骨分化；但在炎性微環(huán)境中，需要能量密度為8 J/cm2的LLLT才能顯著促進MSC的增殖和成骨分化。而LLLT能量密度較高(16 J/cm2)時，對正常和炎性環(huán)境下MSC的增殖和成骨分化均有顯著抑制。此外，Károly等[17]報道，能量密度為1.9 J/cm2和3.8 J/cm2的LLLT均可促進MSC的增殖，且在24 h內3.8 J/cm2照射1次與1.9 J/cm2照射2次，其促進MSC增殖的生物學效應是一致的。實際上，LLLT調節(jié)MSC生物學效應的最佳能量密度還與其他實驗條件相關。Wang等[18]的研究顯示，波長為980 nm的LLLT刺激MSC增殖的最佳能量密度為0.3 J/cm2，而波長為810 nm時則為3 J/cm2。

2.3 類型

LLLT類型的多樣性有時可造成互相矛盾的實驗結果。研究中通常采用的LLLT類型有氦氖激光器、半導體激光器和發(fā)光二極管(LED)，其中常用的半導體激光器包括砷化鎵、摻釹釔鋁石榴石、砷化鎵鋁(GaAlAs)、銦鎵鋁磷化鋁(In-Ga-Al-P)激光器等[19]。目前有爭議的是LLLT相干性是否影響MSC的生物學效應。因為LED為非相干、發(fā)散的LLLT，因此LED的能量不集中，可能需要特殊光學裝置將能量集中到目標區(qū)域。Tani等[20]比較不同類型LLLT對MSC生物學效應的影響，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LED類型的LLLT對MSC的生物學效應并無影響，而使用同樣能量密度的GaAlAs類型的LLLT則能促進MSC的增殖和成骨分化。另一項研究表明，LED類型的LLLT對MSC的增殖雖無明顯影響，但可通過Wnt/β-catenin信號轉導通路促進MSC的成骨分化和礦化[21]。雖然有研究結果支持LLLT不依賴于激光的相干性[22]，但關于LED與相干激光是否等價仍然是光生物學效應領域有爭議的問題。

3 照射情況

3.1 照射頻次

LLLT照射頻次對MSC的生物學效應有較大影響。Li等[23]比較多次與單次應用LLLT對MSC的影響，在13 d內對培養(yǎng)的MSC進行多次(每隔1 d 1次)或單次LLLT照射，發(fā)現(xiàn)單次LLLT照射時MSC數(shù)量僅在照射后2 d內高于對照組,而多次LLLT照射時MSC數(shù)量一直高于對照組。他們[24]進一步研究發(fā)現(xiàn)，多次LLLT照射可進一步提高MSC的成骨分化能力。Almeida-Junior等[25]對比單次與多次LLLT照射對MSC的影響，多次LLLT照射的間隔時間為6 h，結果表明同等條件下3次LLLT照射較單次照射促進MSC增殖的效果更強；考慮到LLLT照射頻次不同可造成MSC接受能量不同，他們還對比應用1次LLLT照射與同等能量分3次應用LLLT照射對MSC的影響，結果表明分3次進行LLLT照射能更好地促進MSC增殖。

3.2 照射時間

照射時間也可以影響LLLT對MSC的生物學效應，且照射時間與MSC的生物學效應并非呈正相關。Yin等[26]使用LLLT調節(jié)MSC的生物學效應，照射時間分別為1 h、2 h、3 h，結果表明LLLT通過調節(jié)細胞周期進程促進MSC增殖，且照射時間為1 h時對細胞的增殖效應最大。Amaroli等[27]使用808 nm波長LLLT對MSC分別進行連續(xù)5 d、10 d、15 d的照射，發(fā)現(xiàn)連續(xù)照射5 d成骨分化的重要早期標志物Runx2表達開始增加，連續(xù)照射10 d Runx2表達達到最大值，連續(xù)照射15 d Runx2的合成反而減少。因此，在LLLT調節(jié)MSC的生物學效應時，必須控制照射時間才能達到理想結果。

3.3 照射面積與傳輸系統(tǒng)

LLLT的照射面積與能量密度關系密切。de Villiers等[28]采用照射面積為9.1 cm2、能量密度為5 J/cm2的光斑照射MSC，該光斑可覆蓋整個培養(yǎng)孔表面，發(fā)現(xiàn)照射后3 d內LLLT組的MSC數(shù)量顯著高于對照組。de Andrade等[29]使用極小光斑(面積為0.028 cm2)照射MSC，發(fā)現(xiàn)也能促進MSC增殖，然而他們未描述極小光斑是如何照射整個培養(yǎng)孔中MSC的。通常可靠的方法是通過掃描照射培養(yǎng)孔中全部MSC[14]。但也有研究顯示，即使LLLT照射面積小于培養(yǎng)孔面積的1/10，也能對MSC產生有益的生物學效應[30]。

LLLT的光束傳輸系統(tǒng)依據光通量分布可分為2種：“標準”光束傳輸系統(tǒng)(高斯光通量分布)和“flat-top”光束傳輸系統(tǒng)(均勻光通量分布)。Hanna等[31]的研究顯示，“flat-top”光束傳輸系統(tǒng)因散發(fā)的光斑橫截面上各點能量分布均勻，更有助于提高細胞的生物學活性，從而更有益于細胞的成骨分化。相反，“標準”光束傳輸系統(tǒng)散發(fā)的光斑橫截面上呈中心高周圍低的能量分布，可能對MSC生物學效應影響較小[32]。

3.4 作用細胞

LLLT可調節(jié)許多類型MSC的生物學效應。實驗中所用MSC可取自人、鼠、馬、兔、犬等不同物種，組織來源包括骨髓、脂肪、牙、滑膜等，從細胞培養(yǎng)傳代來看，通常使用原代、3代、4代細胞[33]。脂肪組織來源的MSC也可向成骨細胞分化，由于其具有取材方便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點[34]，近年受到越來越多的關注。從細胞生理特性劃分，MSC可以是健康的也可以是病態(tài)的[35]，病態(tài)MSC(如高糖微環(huán)境下的MSC)的存活力和增殖力均明顯受損。 Zare等[36]采用波長為632.8 nm、能量密度為1 J/cm2、頻率為1～2次的LLLT照射改善了高糖微環(huán)境下MSC的增殖力。

3.5 細胞培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)基也影響LLLT對MSC的生物學效應。常用的細胞培養(yǎng)基有改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)和成骨誘導培養(yǎng)基(ODM)。Yang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，LLLT對DMEM中MSC的生物學效應并無影響，但可顯著促進ODM中MSC的增殖和成骨分化，可顯著上調MSC成骨分化的重要標志物骨橋蛋白基因的表達，促進礦化結節(jié)形成。Peng等[38]比較ODM與DMEM兩種培養(yǎng)基中LLLT對MSC的影響，結果表明不同培養(yǎng)條件下可表現(xiàn)出不同的生物學效應。在DMEM中LLLT可促進MSC的增殖，但不誘導其成骨分化，在ODM中LLLT可促進MSC成骨分化，但抑制其增殖。

4 結語

LLLT作為一種物理方法調節(jié)MSC時具有操作簡便、廉價、高效等優(yōu)點，并可以聯(lián)合其他化學物質共同調節(jié)MSC的生物學效應。合理使用LLLT可以促進MSC的增殖及成骨分化，在骨組織工程中具有重要應用價值?？紤]到實驗條件的限制和方法的異質性，設計可同時包含所有影響因素的實驗非常困難，因此需進一步探索LLLT的各項最佳參數(shù)及照射情況(波長、能量密度、照射頻次等)，以更好地發(fā)揮其調節(jié)作用。