骨髓間充質(zhì)干細胞治療脊髓損傷應(yīng)用方法的多樣性

劉明昊，于才勇，劉玲，王曦

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，a.學(xué)員一大隊，b.神經(jīng)生物學(xué)教研室暨腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 710032)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一類因創(chuàng)傷、腫瘤、缺氧、炎癥等因素造成的脊髓完整性和連續(xù)性被破壞的疾病。近年來，SCI患者呈逐年增多趨勢，且以青壯年居多。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷后難以再生，造成SCI患者肢體和內(nèi)臟功能恢復(fù)困難，給患者造成極大痛苦，同時也給患者的家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。自骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)被發(fā)現(xiàn)以來，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用一直是學(xué)者們研究的熱點。移植BMSCs對于SCI患者具有顯著的治療作用，可改善SCI患者的預(yù)后，其內(nèi)在機制可能由于BMSCs具有顯著的神經(jīng)營養(yǎng)、調(diào)節(jié)免疫平衡、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用；在體外培養(yǎng)條件下BMSCs還具有跨胚層分化的能力，可提高突觸傳遞功能，促進神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，改善后肢運動功能；此外，BMSCs可自身獲得，因此可以有效避免免疫排斥反應(yīng)[1-2]。這些特性使BMSCs成為治療SCI的理想候選細胞。BMSCs治療SCI有多種不同的應(yīng)用方法，通過不同的機制發(fā)揮作用，產(chǎn)生不同的治療效果?，F(xiàn)就BMSCs治療SCI的應(yīng)用方法的多樣性予以綜述。

1 BMSCs概述

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類源于中胚層且具有自我更新和多項分化潛能的多能干細胞，其中BMSCs最早被發(fā)現(xiàn)，而骨髓也被認為是MSCs臨床應(yīng)用的主要來源之一[3]。1970年，F(xiàn)riedenstein等[4]首次發(fā)現(xiàn)來自骨髓的某種細胞可以在塑膠培養(yǎng)基上形成集落；1991年，Caplan[5]將這種細胞命名為BMSCs，同時發(fā)現(xiàn)BMSCs具有分化形成骨、軟骨和脂肪的潛能。目前，國際細胞治療協(xié)會建議通過以下標(biāo)準(zhǔn)識別BMSCs：可以黏附在塑膠上；在標(biāo)準(zhǔn)的體外分化條件下可分化為軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞；可表達細胞表面標(biāo)志物CD105、CD73和CD90，且不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19以及人類白細胞抗原DR等[6]。

2 BMSCs治療SCI的多種應(yīng)用方法及其作用機制

BMSCs可以跨胚層分化為屬于外胚層來源的神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞[7]，并具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用，因此在減輕SCI后的繼發(fā)性損傷方面具有廣闊的應(yīng)用前景，是一種被廣泛研究的成體干細胞[8]。目前BMSCs治療SCI具有多種應(yīng)用方法，主要包括：直接移植體外培養(yǎng)擴增的BMSCs、僅應(yīng)用BMSCs分泌的活性物質(zhì)治療SCI、體外誘導(dǎo)分化BMSCs為神經(jīng)干細胞或前體細胞后再移植、用特定基因干預(yù)BMSCs后再移植以及BMSCs移植聯(lián)合其他方法治療SCI等。

2.1直接移植體外培養(yǎng)擴增的BMSCs 目前可以通過多種途徑直接移植BMSCs治療SCI，主要包括將BMSCs直接注射到損傷脊髓局部、鞘內(nèi)注射、靜脈注射或腹腔注射[9-10]。BMSCs具有“歸巢”的特性，移植后會向損傷位點遷移[1]。移植體外培養(yǎng)擴增的BMSCs后，脊髓局部的表現(xiàn)和功能會顯著改善，炎癥反應(yīng)緩解，細胞凋亡減輕[11]；出血反應(yīng)與瘢痕纖維化減輕[12]；血脊髓屏障的完整性得到鞏固[13]；軸突再生和再髓鞘形成能力提高，神經(jīng)通路的重新構(gòu)建增強[14]。在這種情況下，BMSCs發(fā)揮治療作用主要通過神經(jīng)營養(yǎng)、調(diào)控免疫平衡以及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡等機制。BMSCs可以通過分泌生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)起到神經(jīng)營養(yǎng)的作用，促進神經(jīng)元再生[15-18]。SCI后，過度的炎癥反應(yīng)是引起繼發(fā)性SCI的重要原因之一，調(diào)控免疫平衡、抑制過度的促炎癥反應(yīng)以及增強有利于愈合和再生的因子的合成和釋放，是治療SCI的重要策略之一，而移植BMSCs能夠發(fā)揮這種作用[19-20]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起SCI后繼發(fā)性損傷的另一重要因素，如何抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)也是治療SCI的重要策略之一，而BMSCs可以通過抑制氧化應(yīng)激，減輕繼發(fā)性損傷，達到治療的目的[21]。SCI后，一系列引起繼發(fā)性損傷的因素均會導(dǎo)致殘存的神經(jīng)元凋亡，進一步加重損傷，而移植的BMSCs可以通過多種途徑抑制神經(jīng)元凋亡[22-24]，促進SCI大鼠的功能恢復(fù)。學(xué)者們陸續(xù)開展了多項臨床試驗，初步結(jié)果顯示移植BMSCs后患者的運動、感覺以及膀胱功能改善，表明移植BMSCs安全可行，且能提高SCI患者的生活質(zhì)量[1-2,9,25]。

2.2應(yīng)用BMSCs分泌的活性物質(zhì)治療SCI SCI后，損傷區(qū)的微環(huán)境不利于移植細胞的存活，且移植細胞在體內(nèi)的存活和分化方向難以控制，阻礙了移植細胞作用的發(fā)揮。直接利用BMSCs分泌的活性物質(zhì)治療SCI，可避免這些不利因素。BMSCs可以分泌眾多有利于組織修復(fù)和再生的物質(zhì)，包括多種營養(yǎng)因子、免疫調(diào)節(jié)因子、含有生物活性分子的外泌體等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠注射BMSCs的條件性培養(yǎng)液，可以顯著減輕SCI，促進SCI后的功能恢復(fù)[26-29]，說明BMSCs條件性培養(yǎng)液中含有BMSCs分泌的促進脊髓再生和修復(fù)的物質(zhì)。實驗證實，條件性培養(yǎng)液可以減輕凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)[30]。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，條件性培養(yǎng)液中至少含有120種蛋白質(zhì)分子，包括表皮細胞生長因子、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血管內(nèi)皮生長因子、血管緊張素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、睫狀生長因子、白細胞介素-10以及白細胞介素受體拮抗劑等眾多促進神經(jīng)再生和組織修復(fù)的分子[31]。蛋白質(zhì)組學(xué)證實，條件性培養(yǎng)液中含有豐富的神經(jīng)營養(yǎng)、血管生成和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白分子[32]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，靜脈注射BMSCs分泌的外泌體也可以促進SCI后的功能修復(fù)[33]。BMSCs來源的外泌體可以通過抑制A1型星形膠質(zhì)細胞活化[34]或作用于M2型巨噬細胞發(fā)揮作用[35]，促進損傷脊髓環(huán)境中星形膠質(zhì)細胞和巨噬細胞向有利于再生和修復(fù)的表型轉(zhuǎn)化。

2.3體外誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)前體細胞后再移植 雖然神經(jīng)干/前體細胞是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種良好的候選細胞，但倫理、法律和來源的制約限制了神經(jīng)干/前體細胞的應(yīng)用。而BMSCs可以由自身獲得，避免了免疫排斥反應(yīng)和倫理、法規(guī)的制約，因此很多研究通過BMSCs跨胚層分化來獲取神經(jīng)干/前體細胞，然后再移植治療不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

多種因素可以促進BMSCs向神經(jīng)干/前體細胞的跨胚層分化。BDNF、神經(jīng)生長因子、GDNF、FGF-2等多種生長因子可以促進BMSCs向神經(jīng)元或神經(jīng)前體細胞分化[36-37]。聲波、電刺激、抗氧化劑等多種方法也可以誘導(dǎo)BMSCs的跨胚層分化[38-40]。不同類型的RNA[如長鏈非編碼RNA[41]和微RNA(microRNA，miRNA)[42]]也被證實在BMSCs向神經(jīng)元分化過程中發(fā)揮重要作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，SCI患者和多發(fā)性硬化患者血液中的自身反應(yīng)性T細胞均可在體外誘導(dǎo)BMSCs跨胚層分化[43]。

BMSCs可以跨胚層分化為多種神經(jīng)細胞，如多巴胺能神經(jīng)元[44]、運動神經(jīng)元樣細胞[45]、少突膠質(zhì)細胞樣細胞[46]、5-羥色胺能神經(jīng)元[47]、神經(jīng)前體細胞[37]、神經(jīng)元樣細胞與膠質(zhì)樣細胞[48]等，體現(xiàn)出通過細胞替代方法治療帕金森病、運動神經(jīng)元疾病、脫髓鞘疾病、5-羥色胺失調(diào)的精神失常性疾病、SCI等疾病的應(yīng)用前景。Ye等[49]用腦脊液誘導(dǎo)BMSCs分化為星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元樣細胞，并將其移植到大鼠損傷的脊髓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BDNF、神經(jīng)生長因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的含量均增加，功能恢復(fù)也得到顯著改善。de la Garza-Castro等[50]研究發(fā)現(xiàn)，與直接移植BMSCs相比，將BMSCs轉(zhuǎn)化為施萬細胞前體細胞后再移植治療的SCI大鼠活動能力和被移植細胞的遷移率均進一步提高。由此可見，與移植腦和脊髓來源的神經(jīng)干/前體細胞相比，BMSCs跨胚層分化獲取的神經(jīng)干/前體細胞避免了倫理、法規(guī)與來源的約束，而與直接移植BMSCs相比，移植BMSCs跨胚層分化獲取的神經(jīng)干/前體細胞對SCI患者的治療針對性更強，具有一定的臨床意義。

2.4基因干預(yù)BMSCs后再移植 將某些有利于神經(jīng)再生的基因轉(zhuǎn)染至BMSCs后再移植到SCI患者體內(nèi)，對于SCI后的功能恢復(fù)具有更好的療效。如將分別轉(zhuǎn)染了音猬因子[51]、堿性FGF[52]、血管內(nèi)皮生長因子[53]、GDNF[54]、miR-124[55]、Bcl-2[56]或miR-200a[57]基因的BMSCs移植到SCI大鼠，均有效促進了BMSCs的存活，增加神經(jīng)纖維的再生和軸突生長，促進了運動和感覺功能的恢復(fù)；此外，miR-544[58]、miR-29b[59]或miR-126[60]基因修飾的BMSCs釋放的外泌體亦更加有效地促進了SCI大鼠的軸突再生和運動功能的恢復(fù)。這些研究均提示，BMSCs經(jīng)過基因干預(yù)后再移植，在治療SCI方面具有良好的應(yīng)用前景。

2.5BMSCs移植聯(lián)合其他方法治療SCI

2.5.1BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用生長因子 生長因子是通過與特異性細胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞生長與其他功能效應(yīng)的多肽類物質(zhì)。研究證實，將生長因子與BMSCs移植聯(lián)合治療SCI是一種有效的治療方法[2]。Shin等[61]將FGF-2與BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)FGF-2對移植的BMSCs具有增殖、保護和神經(jīng)誘導(dǎo)作用，可提高BMSCs移植后的存活率，并顯著改善了SCI癥狀。黃興銳等[62]將堿性FGF與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達減少，神經(jīng)絲蛋白200的表達上調(diào)，殘余軸突受到保護，促進了修復(fù)與再生，大鼠的運動功能也得到有效改善。表明FGF-2與BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用，一方面可以促進移植的BMSCs存活，另一方面通過疊加或協(xié)同發(fā)揮治療作用，是一種有效的治療策略。

2.5.2BMSCs移植聯(lián)合電針刺激 電針療法是指在針刺入人體穴位后，在針上通以接近人體生物電的微量低頻脈沖電流進行刺激來防治疾病的一種療法，與BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用，可以促進SCI后的功能恢復(fù)。王文峰和葉紅暉[63]研究發(fā)現(xiàn)，電針聯(lián)合BMSCs移植可促進BMSCs存活以及向神經(jīng)元樣細胞分化。Ding等[64]通過移植經(jīng)酪氨酸激酶C基因修飾的BMSCs并聯(lián)合電針療法治療SCI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可通過提高脊髓NT-3水平，上調(diào)神經(jīng)源性因子層粘連蛋白和生長相關(guān)蛋白-43的表達，下調(diào)膠質(zhì)纖維酸性蛋白和硫酸軟骨素蛋白聚糖的表達，增加皮質(zhì)運動誘發(fā)電位的傳導(dǎo)，提高后肢運動功能。Liu等[65]還發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合電針療法治療可以促進移植的BMSCs分化為少突膠質(zhì)細胞樣細胞，促進軸突再髓鞘化。雖然電針本身的作用機制仍有待進一步研究，但BMSCs聯(lián)合電針治療SCI的效果肯定，電針刺激有可能改善了BMSCs發(fā)揮作用的微環(huán)境，因此也是一種應(yīng)用前景廣泛的治療策略。

2.5.3BMSCs聯(lián)合其他細胞移植 研究已經(jīng)證實，單獨移植神經(jīng)干/前體細胞、少突前體細胞或嗅鞘細胞等可以提高SCI后的功能恢復(fù)[66-68]，而與BMSCs聯(lián)合移植，將進一步提高SCI的治療效果。脊髓脫髓鞘是SCI中常見的一種病理改變，Kaka等[69]將BMSCs轉(zhuǎn)分化的少突前體細胞與未分化的BMSCs聯(lián)合移植到損傷的大鼠脊髓，結(jié)果顯示，脊髓空洞化程度降低，BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分顯著提高。Wu等[70]將嗅鞘細胞與BMSCs聯(lián)合移植到損傷的大鼠脊髓，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)修復(fù)效果與抗凋亡作用較單純的嗅鞘細胞或BMSCs移植更顯著。Stewart等[71]應(yīng)用過表達基質(zhì)細胞衍生因子-1的BMSCs與神經(jīng)干細胞聯(lián)合移植治療SCI大鼠，發(fā)現(xiàn)通過BMSCs過表達產(chǎn)生的基質(zhì)細胞衍生因子-1作用于神經(jīng)干細胞，更有利于軸突再生和運動功能恢復(fù)。這些研究提示，BMSCs與其他細胞聯(lián)合移植可通過功能互補和協(xié)同作用促進SCI后的修復(fù)。

2.5.4BMSCs聯(lián)合組織工程支架移植 在SCI的治療過程中，脊髓空洞和膠質(zhì)瘢痕形成的物理屏障限制了移植的BMSCs發(fā)揮作用，而組織工程支架可以在一定程度上克服物理屏障，為BMSCs提供良好的增殖、分化與遷移環(huán)境，使BMSCs發(fā)揮更好的效果。將BMSCs作為種子細胞，與生物性可降解支架相結(jié)合，在SCI的治療中有巨大的應(yīng)用前景。Zeng等[72]將高表達NT-3的施萬細胞與高表達NT-3受體酪氨酸激酶C的BMSCs在三維明膠海綿支架中共培養(yǎng)14 d，結(jié)果支架中產(chǎn)生了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，全細胞膜片鉗記錄到自發(fā)性突觸后電流；將支架與細胞一起移植到大鼠脊髓橫斷間隙8周后，大鼠后肢功能和皮質(zhì)運動誘發(fā)電位均得到改善。Kim等[73]將BMSCs與殼聚糖支架或體外聚乳酸-糖基乙酸支架聯(lián)合移植，結(jié)果顯示其細胞移植成功率較單純BMSCs移植高，并具有較好的神經(jīng)保護作用，運動功能改善顯著。Chen等[74]將具有微通道和H型腔的管狀支架與BMSCs共同移植治療SCI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其促進了神經(jīng)再生，抑制了神經(jīng)元凋亡。Wang等[75]將BMSCs植入無細胞脊髓支架治療SCI大鼠，結(jié)果證明其可以恢復(fù)受損脊髓的功能；且使用具有無細胞脊髓支架的BMSCs可減少損傷部位的巨噬細胞，通過早期調(diào)控炎癥細胞募集，抑制凋亡和繼發(fā)性炎癥，促進功能恢復(fù)。以上研究表明，聯(lián)合應(yīng)用生物支架有利于移植的BMSCs存活、克服物理屏障、調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境、抑制神經(jīng)元凋亡、促進SCI部位神經(jīng)元再生以及功能性突觸的形成，同時促進神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，對SCI損傷后的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建和功能恢復(fù)具有重要作用。

3 小 結(jié)

BMSCs是目前治療SCI理想的候選細胞。BMSCs治療SCI的應(yīng)用方法具有多樣性，可以直接移植使用或使用其分泌產(chǎn)物，也可以體外跨胚層分化為神經(jīng)干/前體細胞后再移植，還可以經(jīng)過基因修飾后再移植，或聯(lián)合其他方法治療SCI。目前還應(yīng)進一步研究如何在SCI后復(fù)雜的微環(huán)境中提高移植細胞的存活率以及調(diào)控移植細胞的分化命運，并對比不同應(yīng)用方法的優(yōu)勢和特點，針對不同SCI患者情況找到更加有效的應(yīng)用方式，使BMSCs發(fā)揮最佳的治療效果。相信未來BMSCs可以安全、有效地應(yīng)用到SCI的臨床治療中，為不同SCI患者的康復(fù)提供有效的個性化治療策略。