長鏈非編碼RNA在抗肝纖維化中作用的研究進展

梁仁久，梁堯，李建明，黃貴華

(1.廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530200； 2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脾胃肝病科，南寧 530023)

肝纖維化是病理學概念，其是指相關(guān)的細胞因子激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)，使之趨化增殖，同時細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ持續(xù)不斷堆積，肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，肝膠原構(gòu)成比發(fā)生改變，導致瘢痕形成進而發(fā)展為纖維化[1]。若肝纖維化控制不佳，可發(fā)展為肝硬化、肝衰竭、肝性腦病、肝細胞癌[2]。近年來隨著基因組RNA測序的發(fā)展，非編碼RNA的豐富性、多樣性得以展現(xiàn)，其中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)成為研究熱點；lncRNA與細胞活化、增殖、凋亡、細胞周期、細胞分化等密切相關(guān)[3],參與肝臟發(fā)育、生理過程、纖維化和惡性腫瘤的進程，調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]。lncRNA能調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯，此外與微RNA(microRNA,miRNA)之間還存在競爭作用，共同調(diào)控肝纖維化進程，但對于lncRNA的研究尚不成熟[5-6]?？蒲泄ぷ髡咦⑨屃舜罅康膌ncRNA，收錄在多個數(shù)據(jù)庫中，如RNA-central、NONCODE、GENCODE、LNCipedia、lncRNAdb、GeneCards、Ensembl、OMIM[7-10]等。目前，lncRNA在肝纖維化中的生物學功能和分子機制尚未完全清楚。現(xiàn)就lncRNA在抗肝纖維化中的作用研究進展予以綜述，以為肝纖維化的診療、預后提供新思路。

1 lncRNA概述

lncRNA的長度>200個核苷酸，無啟動子保守區(qū)、啟動密碼子、開放閱讀框、終止密碼子，所以lncRNA是一種不能編碼蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄本。lncRNA幾乎均是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄后，再經(jīng)過多聚腺苷酸化生成[11]，其是較短的轉(zhuǎn)錄物，包含的外顯子較少[12]。lncRNA是根據(jù)它們相對于帶注釋的蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄位點進行分類[13]，人類基因組基因約有90 000個，其中含lncRNA的基因約60 000個，并注釋了超過15 000個lncRNA[14-15]。目前對lncRNA的功能可總結(jié)為4類：信號、誘餌、引導物和支架，同時它還可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性或定位，誘導染色質(zhì)重塑，產(chǎn)生選擇性剪接等[16-17]。lncRNA是基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)方式主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄前后，轉(zhuǎn)錄前包括核結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的染色質(zhì)修飾、對轉(zhuǎn)錄機制的干擾、轉(zhuǎn)錄增強子的激活；轉(zhuǎn)錄后包括針對剪接的調(diào)節(jié)、miRNA的衰變以及蛋白質(zhì)的翻譯[18]。lncRNA通過在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等層面的介入，實現(xiàn)在各個層面對基因和蛋白表達的調(diào)控。近年來，關(guān)于肝纖維化的諸多研究趨向lncRNA在肝纖維化某些信號通路上的調(diào)控機制。

2 lncRNA在抗肝纖維化中的作用

HSC是肝纖維化研究中的基點，是導致肝纖維化的中心細胞類型[19]。HSC的活化增殖、凋亡、自噬是肝纖維化發(fā)展進程中的幾個重要途徑，lncRNA能調(diào)控這些環(huán)節(jié)的發(fā)展，從而影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

2.1調(diào)控HSC的活化、增殖 HSC的激活是肝纖維化發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。而lncRNA實現(xiàn)抗肝纖維化的途徑主要是調(diào)控信號通路目的基因的轉(zhuǎn)錄和目的蛋白的表達，影響HSC的活化、增殖、凋亡。其主要表現(xiàn)形式為通過與其他分子結(jié)合形成復合物、競爭性地搶占結(jié)合位點、串聯(lián)不同的信號通路等，最終達到對HSC的調(diào)控，實現(xiàn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

2.1.1調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1/Smad信號通路 HSC的活化是肝纖維化的是始動環(huán)節(jié)，而TGF-β是激活HSC的重要因子，其通過激活TGF-β1/Smad信號通路來促進HSC的活化和增殖，阻礙肝臟的自我修復[20]。研究表明，在定義的3 692個lncRNA基因座中，被TGF-β信號誘導的lncRNA基因座有139個，被抑制的lncRNA基因座有242個[21-22]。通過TGF-β1/Smad信號通路調(diào)控肝纖維化的lncRNA主要分為被TGF-β活化的lncRNA(long non-coding RNA activated by transforming growth factor-β，lncRNA-ATB)、肝纖維化相關(guān)lncRNA1、lncRNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(lncRNA-metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA-MALAT1)、H19等。

研究表明，lncRNA-MALAT1以堿基互補配對的方式與miR-101或初級miR-101b結(jié)合形成復合物，調(diào)控相關(guān)蛋白Rac1的表達[23]。此外，MALAT1和初級miR-101b互為競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，過表達miR-101b會抑制TGF-β1的表達，所以MALAT1/初級miR-101b/Rac1軸可能是抗肝纖維化的重要途徑[24-26]。由此可見，lncRNA不僅可以與其他分子相互結(jié)合共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，還可以競爭性地搶占位點實現(xiàn)抑制性調(diào)節(jié)。在丙型肝炎病毒相關(guān)肝纖維化患者的肝組織、血清及HSC中，lncRNA-ATB的表達上調(diào)；沉默lncRNA-ATB基因，則HSC的活性減弱[27-28]。lncRNA-ATB可以通過TGF-β1/Smad信號通路和Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)信號通路抑制丙型肝炎病毒相關(guān)肝纖維化的進展；lncRNA-ATB與β-catenin競爭性結(jié)合miR-200a，影響HSC的活化[29]。lncRNA調(diào)控肝纖維化的同時也對其他疾病表型起到調(diào)控作用。因此，通過刺激目的lncRNA的表達抑制或上調(diào)關(guān)鍵分子的結(jié)合、表達，阻斷下游通路或控制其他通路的啟動，終止肝纖維化的進一步發(fā)展，甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，可能成為一種靶向治療途徑。

2.1.2調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路是近年來的研究熱點，它參與HSC的活化和肝纖維化的形成，因此抑制、阻斷Wnt/β-catenin信號通路是抗肝纖維化的重要途徑[30]。Wnt是一種配體蛋白，能激發(fā)多個下游信號靶基因，其中β-catenin介導的Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典的Wnt通路。當Wnt被激活并與細胞膜表面的卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白家族受體結(jié)合使細胞內(nèi)蓬亂蛋白Dsh及其同源物被激活，才能避免胞質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白被磷酸化，在胞質(zhì)中積累的β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子/淋巴增強因子結(jié)合，進入細胞核后激活靶基因[31]。

在Wnt/β-catenin信號通路中，lncRNA通過競爭性結(jié)合miRNA的方式來調(diào)節(jié)肝纖維化，如lncRNA小核RNA宿主基因7(long non-coding RNA small nuclear RNA host gene 7，lncRNA-SNHG7)。lncRNA-SNHG7的長度為2 157 nt，其可上調(diào)HSC的表達；有學者發(fā)現(xiàn)，miR-378a3p可通過與蓬亂蛋白Dsh同源物2結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin信號通路[32-33]。然而，lncRNA-SNHG7和miR-378a3p互為ceRNA，lncRNA-SNHG7的存在使得細胞內(nèi)游離的蓬亂蛋白Dsh同源物2增加，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)累積，進而調(diào)控肝纖維化相關(guān)基因，促進肝纖維化。同樣，lncRNA-p21也可通過ceRNA途徑競爭性結(jié)合miR-175p，從而上調(diào)HSC中糖原合成酶激酶3β的表達，加速胞內(nèi)β-catenin降解，使Wnt/β-catenin信號通路被抑制，HSC的激活受阻[34]。

此外，lncRNA-SNHG7還可與miR-29b結(jié)合影響miR-29b下游靶基因DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A的表達，控制HSC的活化、增殖，以達到抗肝纖維化的目的[35]。可見，lncRNA-SNHG7能調(diào)控HSC的激活、增殖，可作為抗肝纖維化的靶點。lncRNA對肝纖維化的調(diào)控不僅是單一的作用于某條信號通路上的分子，而是形成了一張相互交織的網(wǎng)，可以利用這種相互作用關(guān)系去規(guī)避一些難以突破的環(huán)節(jié)，以達到抗肝纖維化的目的。

2.2介導HSC凋亡 被激活的HSC呈現(xiàn)兩種狀態(tài)：一是回歸靜止狀態(tài)，二是通過凋亡途徑程序性死亡；其中靜態(tài)HSC可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞樣對應物，從而增強細胞增殖和遷移能力以及α平滑肌肌動蛋白的表達，然后誘導細胞外基質(zhì)沉積并導致肝纖維化[36]。細胞凋亡是一種重要的肝損傷機制，lncRNA通過調(diào)控HSC的凋亡影響肝纖維化的發(fā)展；目前，研究較為普遍的凋亡因子和信號通路有血清促凋亡Fas蛋白及其配體、腫瘤壞死因子-α、抗凋亡肝細胞生長因子、胱天蛋白酶等。

Yang等[37]發(fā)現(xiàn)，胸腺素β4通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)-核因子κB通路抑制lncRNA-p21介導的肝纖維化、肝細胞凋亡；lncRNA-p21高表達能促進HSC凋亡加速肝病理性損傷、纖維化，而抑制lncRNA-p21表達能阻斷這一途徑，減輕肝纖維化。在此調(diào)控途徑中，lncRNA-p21的過表達升高纖維化相關(guān)蛋白(Ⅰ型膠原、α平滑肌肌動蛋白和金屬蛋白酶組織抑制物)水平，并誘導丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、羥脯氨酸的產(chǎn)生。Yu等[38]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-p21通過miR-181b和人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因調(diào)節(jié)肝纖維化；Tu等[39]研究表明，lncRNA-p21過表達會加重肝纖維化。Zheng等[40]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-p21也參與HSC的激活過程，提示lncRNA-p21可以誘導肝纖維化?？梢?，lncRNA-p21不僅可以通過凋亡途徑調(diào)控肝纖維化，還可與miRNA競爭性結(jié)合位點來控制HSC的活化，進而影響肝纖維化進展。細胞的活化和凋亡不是處于一個絕對、單一的發(fā)展模式，活化后的HSC會靜息或進入凋亡形成一個代謝周期，所以過度凋亡也會啟動負反饋調(diào)節(jié)，刺激HSC活化，促進細胞外基質(zhì)沉積，加重纖維化。

lncRNA-母系表達基因3(lncRNA-maternally expressed gene 3，lncRNA-MEG3)是一種lncRNA，主要功能為抑制腫瘤細胞生長、上調(diào)抑癌基因p53蛋白表達、選擇性激活p53靶基因[41]。p53參與凋亡途徑是通過干預凋亡小體形成的固有線粒體，最終激活胱天蛋白酶；胱天蛋白酶與真核細胞凋亡密切相關(guān)，并參與細胞的生長、分化與凋亡，是細胞凋亡的經(jīng)典途徑[42]。He等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MEG3過表達能促進細胞凋亡抑制細胞增殖，減少α平滑肌肌動蛋白和Col1A1基因的表達；部分lncRNA-MEG3可通過增加線粒體細胞色素C的釋放導致胱天蛋白酶活化來實現(xiàn)。此外，p53的線粒體凋亡途徑參與lncRNA-MEG3誘導的人肝星形細胞LX-2凋亡。lncRNA的調(diào)控作用不僅局限于凋亡或活化的單一途徑，還可作為一個工具性分子調(diào)整目的基因、蛋白、細胞的表達來影響某個疾病的發(fā)展，從而達到診療的目的。

2.3調(diào)控HSC自噬 自噬是細胞為維持穩(wěn)態(tài)而發(fā)生的自我降解，是一種細胞分解代謝機制，主要通過溶酶體降解大分子和受損的細胞器[43]。在HSC的活化過程中，自噬也參與其中，但潛在的分子機制較復雜，尚未闡述清晰。研究表明，自噬釋放的脂質(zhì)可通過激活HSC促進纖維化；抑制自噬可以逆轉(zhuǎn)HSC的活化[44-45]。

Xie等[35]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-SNHG7在肝纖維化模型小鼠HSC中的表達明顯增加，通過沉默lncRNA-SNHG7可以抑制HSC的活化和自噬相關(guān)因子以及HSC的增殖；敲除lncRNA-SNHG7可抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A和HSC活化因子(SMA、Coll1)以及自噬相關(guān)因子(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin1)的表達，進而實現(xiàn)抗肝纖維化。而miR-29b與SNHG7互為ceRNA，可逆轉(zhuǎn)這種效應，影響HSC的自噬、激活、增殖。

lncRNA-H19是最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，lncRNA-H19在正常肝臟中的表達被抑制，但在肝纖維化時表達顯著增加；lncRNA-H19參與自噬調(diào)節(jié)，其促進自噬并與PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路相關(guān)[46-49]。PI3K/Akt/mTOR信號通路是細胞暴露于饑餓、感染等特定條件下自噬的典型負調(diào)控通路[50]。TGF-β1可促進HSC自噬和活化，其中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1可能與TGF-β1相互作用影響HSC的活化和自噬效應，加重肝纖維化[51]；Huang等[52]發(fā)現(xiàn)，H19與PI3K/Akt/mTOR信號通路相互調(diào)節(jié)促進自噬，從而參與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1誘導的HSC活化。

lncRNA X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本(X inactive specific transcript，XIST)可能含有miR-29b結(jié)合位點；研究表明，miR-29b-3p靶向并抑制高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)的表達[53]；而HMGB1可誘導自噬，從而促進HSC活化和肝纖維化。研究表明，lncRNA-XIST作為海綿狀miR-29b的ceRNA促進HMGB1的表達，從而誘導自噬同時也促進HSC的活化[54]。所以，lncRNA-XIST通過miR-29b/HMGB1軸增強乙醇誘導的HSC活化和自噬。HSC激活后自噬增加，這是因為自噬產(chǎn)生的能量底物驅(qū)動了HSC的激活[46，55]，所以自噬效應被抑制可減輕HSC的激活強度，甚至減輕肝損傷。

lncRNA通過自噬途徑調(diào)控HSC的自噬和活化不是單純的細胞器或蛋白質(zhì)的消耗清除，而是多個途徑介導并有miRNA參與。如TGF-β1既參與HSC的活化又參與自噬；但自噬又是活化所必需的一個環(huán)節(jié)，自噬的產(chǎn)物為HSC的激活提供能量底物。因此，HSC的活化增殖、凋亡、自噬形成了一個相互影響的反饋鏈，而lncRNA在其中扮演重要角色。

3 小 結(jié)

HSC是肝纖維化的中心細胞，lncRNA通過介導諸多信號通路來調(diào)控HSC的活化增殖、凋亡、自噬；HSC的活化、自噬、凋亡之間相互影響可能與lncRNA的調(diào)控網(wǎng)絡相關(guān)，且miRNA也參與調(diào)控形成一個復雜的網(wǎng)絡體系。在這個網(wǎng)絡體系中，lncRNA除直接調(diào)控信號通路上相關(guān)基因、蛋白的表達外，還可以作為ceRNA發(fā)揮作用。這類作為ceRNA的lncRNA具有miRNA“種子序列”，與miRNA樣海綿結(jié)合，從而阻止miRNA與靶信使RNA結(jié)合，這種海綿結(jié)合是最普遍的[56]。lncRNA作為一種ceRNA，與miRNA、通路、特定結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)等分子相互作用；在轉(zhuǎn)錄組中形成了一個大規(guī)模ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡，如傳統(tǒng)的ceRNA/信使RNA/miRNA。目前，對lncRNA的研究尚處于初級探索階段，ceRNA網(wǎng)絡調(diào)控體系規(guī)模龐大，lncRNA在肝纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中的作用還需深入研究。