CTCs監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及在結(jié)直腸癌診療中的應(yīng)用

程煌榮，鄭勇斌

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科，武漢 430060)

近年來(lái)，隨著國(guó)民健康體檢意識(shí)的提高以及臨床診療技術(shù)的發(fā)展，許多早期腫瘤患者得到有效診治。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球惡性腫瘤的致死病例高達(dá)2.335億，其中結(jié)直腸癌899.6萬(wàn)例，位居第二[1]。腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是晚期腫瘤患者致死的主要原因，約90%的患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，因此明確腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制是改善腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵[2]。學(xué)者們不斷嘗試著對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制提出猜想并予以驗(yàn)證，如最初的種子-土壤學(xué)說(shuō)以及隨后陸續(xù)提出的轉(zhuǎn)移瀑布學(xué)說(shuō)、腫瘤干細(xì)胞理論、細(xì)胞擠出假說(shuō)等，但目前仍無(wú)公認(rèn)統(tǒng)一的解釋。隨著細(xì)胞分離、采集和基因測(cè)序等技術(shù)的成熟，液體活檢在腫瘤領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，作為液體活檢主要檢測(cè)對(duì)象之一的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤臨床應(yīng)用中顯示出巨大價(jià)值，因此CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在聯(lián)系成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)通過(guò)分析腫瘤轉(zhuǎn)移的一系列過(guò)程、CTCs的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)、血小板和腫瘤微環(huán)境對(duì)CTCs形成、存活、轉(zhuǎn)移的調(diào)控，對(duì)CTCs在腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制研究進(jìn)展予以綜述，探討CTCs在腫瘤血行轉(zhuǎn)移中可能的作用機(jī)制以及對(duì)結(jié)直腸癌的臨床指導(dǎo)作用，以期為腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)一步研究和結(jié)直腸癌診療提供參考依據(jù)。

1 CTCs和腫瘤血行轉(zhuǎn)移

CTCs指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶自發(fā)或被動(dòng)地脫落后侵襲血管并進(jìn)入血液循環(huán)，逃離宿主免疫殺傷后在遠(yuǎn)處部位形成病變的腫瘤細(xì)胞[3]。CTCs在外周血中非常稀有，每10億個(gè)正常血細(xì)胞才可能發(fā)現(xiàn)1個(gè)CTCs，稀有性限制了CTCs在臨床上的應(yīng)用[4]。近年來(lái)，由于細(xì)胞富集技術(shù)敏感性的提升，CTCs在腫瘤領(lǐng)域的相關(guān)研究不斷涌現(xiàn)，Cristofanilli等[5]通過(guò)研究乳腺癌患者外周血CTCs水平，首次提出CTCs可能是惡性腫瘤患者無(wú)進(jìn)展生存期與總生存期的有效標(biāo)志物。Sastre等[6]對(duì)127例試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行CTCs檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，入組結(jié)直腸癌患者的CTCs陽(yáng)性率為36.2%，與腫瘤的臨床分期顯著相關(guān)(Ⅱ期為20.7%、Ⅲ期為24.1%、Ⅳ期為60.7%，P<0.005)。隨后研究表明，CTCs檢測(cè)可以評(píng)估腫瘤患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[7]，美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)將CTCs納入新型腫瘤標(biāo)志物，美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)也將其納入乳腺癌TNM分期系統(tǒng)中。CTCs在腫瘤早期診斷、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估方面的潛在價(jià)值，促使研究者更加關(guān)注CTCs導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

CTCs以血液為“載體”，并以血行轉(zhuǎn)移方式向遠(yuǎn)處播散，大致過(guò)程如下：①局部浸潤(rùn)與血管內(nèi)滲：腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫落，突破腫瘤周圍組織、降解基質(zhì)、穿過(guò)血管基膜，進(jìn)入血管；②遷移：腫瘤細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)后逃避免疫監(jiān)視，以CTCs的形式運(yùn)輸至全身；③播散腫瘤細(xì)胞形成：停留在毛細(xì)血管床的CTCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞相黏附，穿過(guò)血管壁進(jìn)入組織或器官，成為播散腫瘤細(xì)胞；④定植、增殖形成轉(zhuǎn)移灶：播散腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位增殖形成轉(zhuǎn)移灶；⑤轉(zhuǎn)移灶的二次轉(zhuǎn)移：“遷移”是腫瘤在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，CTCs通過(guò)細(xì)胞黏附分子黏附于血管內(nèi)皮是遷移機(jī)制的基礎(chǔ)。然而，目前CTCs參與腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未完全闡明。

2 CTCs在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的機(jī)制

2.1EMT的促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用 EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的必要條件。第一，EMT過(guò)程是腫瘤細(xì)胞表型變化和轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)所必需的。多種生長(zhǎng)因子(如表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子(如鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子、鋅指E-box結(jié)合同源框1和2、轉(zhuǎn)錄因子4、叉頭框蛋白C2)的活性在腫瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中失調(diào)，腫瘤細(xì)胞表型從上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型，表現(xiàn)為上皮蛋白(閉合蛋白、細(xì)胞角蛋白、上皮鈣黏素等)下調(diào)、間充質(zhì)蛋白(纖維連接蛋白、波形蛋白、神經(jīng)鈣黏素等)上調(diào)、apico-基底極性以及細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重塑等，這些變化使得緊密的細(xì)胞間連接(黏著連接、橋粒連接)被點(diǎn)連接代替甚至失去連接，丟失細(xì)胞間的黏附作用和上皮極性。在賦予腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性同時(shí)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞穿過(guò)組織間質(zhì)向血管內(nèi)滲成為CTCs，增加腫瘤細(xì)胞活動(dòng)遷移的能力[8]。第二，EMT促進(jìn)循環(huán)系統(tǒng)中CTCs的存活。誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子(如鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子)一方面可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生侵襲性偽足，通過(guò)局部蛋白酶的蓄積以侵入細(xì)胞外基質(zhì)，另一方面可以通過(guò)干擾正常的凋亡聯(lián)級(jí)抵抗衰老，保護(hù)CTCs免于失巢凋亡[9]。此外，還可以使CTCs對(duì)放療和化療產(chǎn)生耐藥性，從而有助于腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散、進(jìn)一步提高CTCs的存活能力并在遠(yuǎn)處形成增殖灶[10]。第三，EMT過(guò)程可逆。EMT發(fā)揮作用的信號(hào)通路大多數(shù)最終作用于上皮鈣黏素的表達(dá)調(diào)控[8]。當(dāng)鈣黏素重新激活時(shí)可觸發(fā)EMT的逆過(guò)程：間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)上皮表型，有助于腫瘤細(xì)胞在新的宿主微環(huán)境中存活，并獲得增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移的能力[8]。

2.2血小板的促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用 血小板是活躍的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、外滲和轉(zhuǎn)移過(guò)程的參與者。血小板是骨髓造血組織成熟的巨核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)碎片，激活后釋放堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、基質(zhì)金屬蛋白酶等。

血小板是最早與血管內(nèi)腫瘤細(xì)胞相互作用的細(xì)胞[11]，其促腫瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)表現(xiàn)為：①血小板衍生的外泌體信使RNA和微RNA可以介導(dǎo)血小板與其他細(xì)胞類型之間基于基因的交流，從而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)[12]。②血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等具有促有絲分裂原活性，可促進(jìn)腫瘤新生血管形成；基質(zhì)金屬蛋白酶、5-羥色胺、組胺等可收縮血管內(nèi)皮細(xì)胞、降解血管基質(zhì)、增加新生血管的通透性；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β作為EMT重要誘導(dǎo)因素，通過(guò)腫瘤細(xì)胞中的核因子κB信號(hào)通路傳導(dǎo)，誘導(dǎo)、維持CTCs的EMT狀態(tài)，參與CTCs的形成[13]。

CTCs向遠(yuǎn)處遷移時(shí)受到血流的剪切損傷以及免疫殺傷，而血小板對(duì)CTCs具有保護(hù)作用：①血小板與纖維蛋白原結(jié)合，并在整合蛋白、選擇素、黏附分子、腺苷三磷酸的作用下在CTCs表面包裹形成“血小板-纖維蛋白原-CTCs”復(fù)合物，發(fā)揮屏障保護(hù)作用[14]，并且CTCs通過(guò)分泌活化血小板的腺苷二磷酸、表達(dá)組織因子或釋放血栓形成和促凝微粒來(lái)增強(qiáng)復(fù)合物形成[15]。②血小板表面的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ分子被動(dòng)轉(zhuǎn)移到CTCs表面，CTCs通過(guò)模擬宿主細(xì)胞逃避免疫清除[16]。③血小板通過(guò)細(xì)胞因子(如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)介導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞活化型受體NKG2D(natural-killer group 2,member D)下調(diào)抑制自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤活性，減輕對(duì)CTCs的免疫損傷[11]。

2.3腫瘤微環(huán)境的促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用 腫瘤細(xì)胞與其周圍環(huán)境(如間充質(zhì)細(xì)胞及纖維組織)一起構(gòu)成了具有腫瘤特異性、適于腫瘤生長(zhǎng)的腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境在促進(jìn)腫瘤發(fā)生和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的重要性已得到越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)。

快速分裂的突變細(xì)胞增殖速度超過(guò)了氧氣的供給速度，形成了腫瘤微環(huán)境的特征之一——低氧。在低氧環(huán)境下，一方面缺氧誘導(dǎo)因子-1α亞基降解受到抑制而大量聚集在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)；在共激活因子作用下，與缺氧誘導(dǎo)因子-1β亞基形成穩(wěn)定的二極體復(fù)合物，激活下游基因表達(dá)、改變細(xì)胞能量代謝方式，并誘導(dǎo)毛細(xì)血管生成、加速腫瘤細(xì)胞分裂增殖、CTCs形成[17]；另一方面，缺氧不僅可抑制自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤作用和T淋巴細(xì)胞的毒性作用[18]，還招募免疫抑制細(xì)胞降低適應(yīng)性免疫的抗腫瘤活性，在CTCs血行轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮免疫逃逸作用[19]。

腫瘤微環(huán)境的另一特征是低pH。糖酵解代謝增高是腫瘤微環(huán)境中酸性增加的直接原因[20]。微環(huán)境酸中毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)與組織重塑有重要的調(diào)控作用：①酸性微環(huán)境可以釋放和激活蛋白水解酶(半胱氨酸、天冬氨酰等)，使細(xì)胞外基質(zhì)降解促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[21]；②與細(xì)胞外環(huán)境相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)堿性環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用[22]；③酸性微環(huán)境增加細(xì)胞毒性，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，而腫瘤細(xì)胞由于獲得性適應(yīng)得以存活甚至增殖[23]。隨著正常細(xì)胞死亡和細(xì)胞基質(zhì)降解，腫瘤細(xì)胞可繼續(xù)擴(kuò)散并侵入至正常細(xì)胞死亡以及基質(zhì)降解后的空間，這種酸性微環(huán)境介導(dǎo)的腫瘤浸潤(rùn)策略可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

3 CTCs在結(jié)直腸癌診療中的應(yīng)用

3.1CTCs用于結(jié)直腸癌早期診斷及臨床分期 惡性腫瘤被認(rèn)為是全球主要的死亡原因，其中結(jié)直腸癌發(fā)病率(6.1%)位居第四、死亡率(9.2%)位居第二[24]。因其發(fā)病初始癥狀隱匿，患者確診時(shí)多發(fā)展為中晚期，治療效果欠佳，因而結(jié)直腸癌早期篩查方法與良好的預(yù)后相關(guān)。CTCs作為一種新型前瞻性的腫瘤標(biāo)志物，在患者出現(xiàn)相關(guān)癥狀或具有明顯影像學(xué)表現(xiàn)前，其異常升高具有警示作用。一項(xiàng)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)735例Ⅱ期和Ⅲ期結(jié)直腸癌患者進(jìn)行的大規(guī)模研究顯示，181例外周血檢測(cè)到CTCs異常增高[25]。此外，結(jié)直腸癌患者CTC陽(yáng)性率TNM分期、原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，故可結(jié)合CTCs檢測(cè)和TNM分期評(píng)估患者預(yù)后[26-27]。由此可見，CTCs檢測(cè)有利于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞、評(píng)估臨床分期，從而有助于提供早期抗腫瘤治療。

3.2CTCs用于結(jié)直腸癌療效評(píng)價(jià)與預(yù)后判斷 接受化療的結(jié)直腸癌患者，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)CTCs評(píng)價(jià)患者的治療效果。Tan等[28]監(jiān)測(cè)9例結(jié)直腸癌伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者化療期間CTCs的研究表明，CTCs水平可反映癌胚抗原無(wú)法顯示的患者化療反應(yīng)和疾病進(jìn)展情況。Cohen等[29]通過(guò)檢測(cè)430例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者在化療前和化療期間不同時(shí)間點(diǎn)的CTCs水平發(fā)現(xiàn)，化療3～4周后CTCs陽(yáng)性患者的疾病進(jìn)展率更高、治療前和治療中CTCs的數(shù)量是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。一項(xiàng)納入3 129例結(jié)直腸癌患者的Meta分析證明，CTCs的檢出表明結(jié)直腸癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期較差，與檢測(cè)方法無(wú)關(guān)，CTCs的存在是患者生存預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[30]。在治療過(guò)程中，動(dòng)態(tài)性檢測(cè)外周血中CTCs可以初步評(píng)價(jià)患者的治療效果及預(yù)后，有助于對(duì)腫瘤進(jìn)行個(gè)體化治療。

3.3CTCs用于結(jié)直腸癌治療后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移目前仍是消化道腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[2]。相當(dāng)一部分接受根治性手術(shù)的早期患者術(shù)后5年內(nèi)仍可發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物(如癌胚抗原、糖類抗原199)相比，CTCs對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)更敏感[4]。一項(xiàng)對(duì)211例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行的前瞻性隊(duì)列研究顯示，術(shù)后CTCs陽(yáng)性是腫瘤患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)，與術(shù)前CTCs陽(yáng)性相比，術(shù)后CTCs陽(yáng)性患者術(shù)后3年內(nèi)的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高[31]。對(duì)mFOLFOX化療后行根治性手術(shù)的Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，化療后持續(xù)CTCs陽(yáng)性可能是預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和預(yù)后的潛在標(biāo)志[32]，故對(duì)于此類患者的治療應(yīng)引起重視。

4 CTCs臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)

CTCs檢測(cè)可用于結(jié)直腸癌等多種實(shí)體惡性腫瘤的非侵入性診斷，在腫瘤早期診斷、監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤患者預(yù)后評(píng)估、判斷治療效果、確定耐藥機(jī)制等方面具有重要臨床價(jià)值。它可以“實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)”監(jiān)控腫瘤的進(jìn)展和遺傳異質(zhì)性，這是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要環(huán)節(jié)。但其臨床應(yīng)用實(shí)踐尚面臨以下挑戰(zhàn)。第一，CTCs檢測(cè)技術(shù)迥異導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在差異[33]。需要標(biāo)準(zhǔn)化的CTCs檢測(cè)流程(細(xì)胞富集、血液樣品處理與儲(chǔ)存等)，以減少各項(xiàng)研究之間的差異；第二，當(dāng)前尚無(wú)法純化出全部類型的具有完整活性、高靈敏度的CTCs[34]，且現(xiàn)有富集方法也無(wú)法檢測(cè)間充質(zhì)轉(zhuǎn)換細(xì)胞，仍需要優(yōu)化富集檢測(cè)分離技術(shù)；第三，CTCs臨界值不明確。在使用CTCs計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)腫瘤患者預(yù)后時(shí)，不同腫瘤的CTCs臨界值有所不同，即使同一腫瘤也沒(méi)有統(tǒng)一明確的臨界值，因而難以通過(guò)CTCs計(jì)數(shù)驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性；第四，當(dāng)前CTCs單獨(dú)作為腫瘤的靶向標(biāo)志物存在不足。在一些非腫瘤患者(如慢性肝炎或炎癥性腸炎)外周血中亦可檢測(cè)出低水平的CTCs，且尚缺乏CTCs優(yōu)于影像學(xué)診斷的臨床證據(jù)；第五，目前CTCs檢測(cè)成本昂貴，尚無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用于臨床。

5 小 結(jié)

近年隨著CTCs檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，作為腫瘤組織的替代物，CTCs成為結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤相關(guān)研究的焦點(diǎn)。CTCs檢測(cè)作為全新的液體活檢技術(shù)，具有創(chuàng)傷小、可重復(fù)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在識(shí)別早期腫瘤患者、療效評(píng)價(jià)及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等方面發(fā)揮著重要作用，具有較高的臨床價(jià)值。尋找一種公認(rèn)、快速、低成本且敏感性和特異性高的提取CTCs完整信息的富集分離方法，對(duì)于CTCs在腫瘤診斷、療效評(píng)估及預(yù)后判斷等方面發(fā)揮更高的臨床價(jià)值，并為臨床診療提供全面且有價(jià)值的指導(dǎo)、助力腫瘤個(gè)體化治療和精細(xì)化管理具有重要意義；開展更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，并通過(guò)大規(guī)模、多中心的前瞻性臨床研究驗(yàn)證CTCs的臨床應(yīng)用價(jià)值，可為CTCs檢測(cè)的最佳臨床用途提供新的見解。