外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展

陳越亞，陳衛(wèi)昌

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是世界上第四大最致命癌癥，約占全世界每年確診癌癥和癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的10%[1]。由我國(guó)國(guó)家癌癥中心公布的最新數(shù)據(jù)顯示[2]，2015年中國(guó)CRC新發(fā)病例共38.76萬(wàn) 例，占全部惡性腫瘤發(fā)病病例的9.87%；由CRC導(dǎo)致的死亡病例共18.71萬(wàn) 例，占全部惡性腫瘤死亡病例的8.01%。CRC的發(fā)生大多由腺瘤發(fā)展而來(lái)，這一般需要10～15 年的時(shí)間，早期診斷及干預(yù)可明顯降低CRC的發(fā)病率及死亡率[3]。因此，在無(wú)癥狀人群中篩查CRC是很重要的，同時(shí)在治療后對(duì)CRC患者病情進(jìn)行監(jiān)測(cè)也是至關(guān)重要的。現(xiàn)在迫切需要研究出更強(qiáng)有力的早期篩查和檢測(cè)生物標(biāo)志物，以促進(jìn)對(duì)這一常見(jiàn)惡性腫瘤的更準(zhǔn)確的早期診斷和監(jiān)測(cè)。

目前，CRC篩查方法分為侵入性及非侵入性方法兩類(lèi)。侵入性方法如結(jié)腸鏡檢查，結(jié)腸鏡檢查聯(lián)合活檢病理是診斷CRC的金標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。Brenner等[6]在2015年進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析顯示，結(jié)腸鏡檢查可將CRC的發(fā)病率降低69%，死亡率降低68%。然而，結(jié)腸鏡檢查需要徹底的腸道準(zhǔn)備，此外，操作引起的不適和隱私的侵犯導(dǎo)致患者依從性差以及較高的檢查成本也導(dǎo)致結(jié)腸鏡檢查不適合在人群中普及。非侵入方法包括糞便隱血試驗(yàn)（fecal occult blood test, FOBT）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、CA19-9等檢測(cè)等更容易被人們所接受。FOBT檢測(cè)主要包括愈創(chuàng)木脂法（guaiac fecal occult blood test, gFOBT）和免疫化學(xué)法（fecal immunochemical test, FIT）兩種檢測(cè)方式。兩種檢測(cè)方式相比，F(xiàn)IT對(duì)低濃度血紅蛋白更敏感，在CRC診斷中敏感性和特異性更高，此外，F(xiàn)IT結(jié)果不受糞便中的其他成分的影響，包括藥物及飲食因素[7]。因此，與gFOBT相比，F(xiàn)IT能夠提高受試者的依從性，并確保得到更可靠的結(jié)果。但是，F(xiàn)IT在近端結(jié)腸中的敏感性低于遠(yuǎn)端結(jié)腸及直腸[8]，而且人們對(duì)處理糞便樣本的厭惡心理一定程度上限制了糞便檢測(cè)的普及。CEA及CA19-9是目前使用的基于血液的腫瘤標(biāo)志物，可用于CRC診斷和監(jiān)測(cè)治療后反應(yīng)，但靈敏度和特異性較低，這使得它們不適合作為CRC的篩查或診斷標(biāo)志物[9]。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的關(guān)于CRC的分子生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)與研究[10]。CRC的發(fā)生是由于表觀遺傳變化的積累而來(lái)，這種遺傳表觀變化包括DNA甲基化、組蛋白修飾和通過(guò)非編碼RNA調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因，這些表觀遺傳機(jī)制的干擾可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展[11]。發(fā)現(xiàn)體液表觀遺傳改變是生物標(biāo)志物檢測(cè)的一種創(chuàng)新替代方法，具有穩(wěn)定性好，敏感性高，無(wú)創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)[12]。在所有研究的表觀遺傳生物標(biāo)志物中，DNA甲基化是各種癌癥中最常見(jiàn)的檢測(cè)方法，其中包括CRC[13]。近年來(lái)，在CRC組織、血液和糞便樣本中檢測(cè)到的甲基化DNA生物標(biāo)志物得到了越來(lái)越多的研究。其中，SEPT9基因甲基化檢測(cè)被認(rèn)為是CRC早期的一個(gè)特定的生物標(biāo)志物。因此SEPT9基因甲基化可能是在高危人群中篩查CRC的可靠指標(biāo)[14]。本文就外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 SEPT9基因在CRC中的致病機(jī)制

Septins是一類(lèi)具有GTPas活性的保守基因家族[15]，目前已發(fā)現(xiàn)14 個(gè)Septin基因，分別命名為SEPT1-SEPT14。SEPT9基因?qū)儆谄浼易逯械囊粏T，位于染色體17q25.3，參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞自噬等生物學(xué)過(guò)程[16-17]。SEPT9蛋白是第四細(xì)胞骨架的組成部分，在活性細(xì)胞分裂過(guò)程中可聚集形成纖維微絲和其他復(fù)合物。此外，它還招募目標(biāo)蛋白并穩(wěn)定胞質(zhì)分裂[18]。SEPT9基因的5'端具有胞嘧啶-硫酸鹽-鳥(niǎo)嘌呤位點(diǎn)（cytosinephosphate-guanine, CpG），它是DNA甲基化的主要位點(diǎn)[14]。當(dāng)SEPT9基因甲基化后，其編碼的蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，使細(xì)胞分裂過(guò)程紊亂，細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致組織癌變[19]。

DNA甲基化水平主要表現(xiàn)為非啟動(dòng)子區(qū)域的低DNA甲基化水平和基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化水平[20]。低DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，導(dǎo)致致癌基因表達(dá)增加，基因印跡喪失，染色體不穩(wěn)定性增加。相比之下，高DNA甲基化與基因表達(dá)沉默和基因組不穩(wěn)定性有關(guān)；減少了腫瘤抑制基因和DNA修復(fù)基因的表達(dá)；以及影響了正常細(xì)胞功能，如凋亡、DNA修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[18]。SEPT9是一種腫瘤抑制基因，已被證明在各種腫瘤中甲基化。在檢測(cè)不同類(lèi)型結(jié)腸病變及其鄰近位點(diǎn)的SEPT9基因甲基化狀態(tài)時(shí)，Wasserkort等[21]證明了SEPT9基因的主要高甲基化發(fā)生在CRC和腺瘤上皮細(xì)胞中的V2轉(zhuǎn)錄本的CpG島3中。SEPT9基因的CpG位點(diǎn)高度甲基化會(huì)阻斷其基因表達(dá)并導(dǎo)致其抗癌功能的喪失。這種DNA甲基化以?xún)煞N方式抑制基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。一方面，DNA甲基化改變了其構(gòu)象，使其不被轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，最終抑制基因的表達(dá)[21]，另一方面，甲基化DNA分子招募和結(jié)合甲基化的CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白。由于這些甲基化的CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白繼續(xù)結(jié)合其他蛋白（如組蛋白去乙?；福?，最終形成致密而不活躍的異常染色質(zhì)，從而抑制基因表達(dá)[18]。自噬是一種調(diào)節(jié)性的細(xì)胞機(jī)制，其通過(guò)減少氧化應(yīng)激，消除癌基因蛋白，維持基因組穩(wěn)定性來(lái)阻止細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮其抑癌作用[22]。研究[23]表明，細(xì)胞自噬抑制CRC的發(fā)生。SEPT蛋白復(fù)合物參與細(xì)胞自噬[17,23-24]。甲基化SEPT9基因可抑制SEPT9蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞自噬功能，從而促進(jìn)CRC的發(fā)生和發(fā)展。

2 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC診斷中的應(yīng)用

2.1 SEPT9基因甲基化檢測(cè)方法 以血液為基礎(chǔ)的SEPT9基因甲基化檢測(cè)旨在檢測(cè)SEPT9基因V2轉(zhuǎn)錄本啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化[25]。該方法的發(fā)展是基于甲基化的SEPT9基因從壞死和凋亡的CRC細(xì)胞釋放到外周血液循環(huán)中，并能應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）將其在外周血中檢出，在CRC輔助診斷方面展示了較高的靈敏度和特異度[26]?；谘獫{中SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化引起的表觀遺傳沉默，Epigenomics AG公司[27]在2008年首先利用歐洲可用的SEPT9生物標(biāo)志物對(duì)SEPT9甲基化進(jìn)行了研究，并推出了第一代有CE標(biāo)示的Epi proColon實(shí)時(shí)PCR試劑盒。2016年4月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Epi proColon作為50～75 歲平均風(fēng)險(xiǎn)人群的首個(gè)基于血液的CRC篩查試驗(yàn)[28]。此外，隨著后續(xù)研究中的不斷改進(jìn)，特別是在應(yīng)用第二代Epi proColon 2.0實(shí)時(shí)PCR試劑盒后，SEPT9基因甲基化檢測(cè)靈敏度從48.2%～73.3%[28-31]提高到71.0%～95.6%[32-35]，特異度從80.0%～91.5%提高到84.8%～98.9%?，F(xiàn)在，外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)因其特異性高、敏感性高、患者依從性高等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)CRC篩查、診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[18]。

2.2 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC篩查中的作用 在一種疾病的早期診斷中應(yīng)用一種檢測(cè)方法通常意味著這種檢測(cè)方法可作為該疾病的驗(yàn)證性診斷或“金標(biāo)準(zhǔn)”診斷的補(bǔ)充或輔助方法，并可用于提高該疾病早期診斷率或陽(yáng)性檢出率。檢測(cè)方法在篩查中的應(yīng)用是指該檢測(cè)可以獨(dú)立地在基于人群的篩查活動(dòng)中識(shí)別某些疾病的高危個(gè)體，而在篩查后通常需要進(jìn)行確認(rèn)性診斷[25]。SEPT9基因甲基化不僅可以發(fā)生在CRC中，還發(fā)生在其他惡性腫瘤中。Grützmann等[36]比較了SEPT9基因在各種惡性腫瘤患者外周血中的甲基化狀態(tài)。研究顯示，CRC患者的SEPT9甲基化陽(yáng)性率為72%（90/125），而非CRC患者的陽(yáng)性率僅為11.5%（11/96），這證實(shí)了SEPT9基因甲基化可作為CRC一個(gè)高特異性診斷標(biāo)志物[36]。在CRC篩查過(guò)程中，篩查方法的高特異性有利于排除非癌樣本，避免不必要的結(jié)腸鏡檢查。

2.3 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC診斷中的算法選擇 由于SEPT9檢測(cè)是為了在未發(fā)生甲基化的SEPT9 DNA的強(qiáng)背景下檢測(cè)微量甲基化SEPT9的基因拷貝，而可檢測(cè)到的甲基化的SEPT9 DNA拷貝數(shù)可低至7.8 pg/mL，因此大多數(shù)研究都進(jìn)行了多次PCR反應(yīng)以提高SEPT9基因甲基化檢測(cè)的靈敏度[25]。目前有關(guān)SEPT9基因甲基化檢測(cè)的研究總共包括四種算法：Septin9(1/3)算法（三個(gè)PCR重復(fù)中，至少有一個(gè)檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性）、Septin9(1/2)算法（兩個(gè)PCR重復(fù)中，至少有一個(gè)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性）、Septin9(2/3)算法（三個(gè)PCR重復(fù)中，至少有兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性）、Septin9(1/1)算法（僅有一個(gè)PCR重復(fù)，且檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性），不同算法會(huì)影響SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和特異性[38]。算法的選擇是基于檢測(cè)的具體需要。如果優(yōu)先考慮排除健康陰性人群，例如在早期檢測(cè)試驗(yàn)中用于診斷目的，則應(yīng)使用特異性最高的算法，然而，如果優(yōu)先考慮的是識(shí)別盡可能多的真實(shí)患者以提高疾病檢出率，例如在篩查試驗(yàn)中，應(yīng)使用靈敏度最高的算法。篩查試驗(yàn)中的高假陽(yáng)性率問(wèn)題可以通過(guò)進(jìn)一步的診斷檢查來(lái)解決，而診斷試驗(yàn)中的高漏診率可以通過(guò)常規(guī)的篩查方案來(lái)避免。Song等[25]比較了四種算法的敏感性和特異性，研究顯示，在CRC診斷中，SEPT9基因甲基化檢測(cè)采用Septin9(1/3)算法表現(xiàn)出最佳的靈敏度，而SEPT9基因甲基化檢測(cè)采用Septin9(2/3)算法表現(xiàn)出最佳的特異度。Septin9(1/3)算法或Septin9(2/3)算法的選擇取決于研究的目的。

2.4 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC癌前病變中的應(yīng)用 對(duì)于SEPT9基因甲基化檢測(cè)對(duì)CRC癌前病變的篩查，有研究[35]顯示，在腺瘤中的敏感性為11%～19%，特異性為85%～94%；在息肉中的敏感性為3%～8%，特異性為90%～97%。在腺瘤和息肉中的敏感性都很低，這表明SEPT9基因甲基化檢測(cè)對(duì)CRC癌前病變的診斷價(jià)值有限。但是，另有研究[37]表明，外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)在高危腺瘤和多發(fā)小息肉中敏感性分別為21.6%及20.0%。這是SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC診斷中的重要擴(kuò)展，因?yàn)闄z測(cè)CRC癌前病變可對(duì)其進(jìn)行早期干預(yù)和清除，這可以降低CRC的發(fā)生率和死亡率。

2.5 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC臨床分期中的應(yīng)用 雖然SEPT9基因甲基化檢測(cè)在診斷CRC中具有較高的敏感性和特異性，但檢測(cè)早期CRC的能力比檢測(cè)晚期CRC更為重要，因?yàn)樵谠缙谠\斷CRC后可以實(shí)施早期干預(yù)，以提高治愈率和降低死亡率。Jin等[33]研究表示，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CRC患者中，外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)采用Septin9(2/3)算法陽(yáng)性率分別為66.7%、82.6%、84.1%和100%，表明SEPT9基因甲基化檢測(cè)在早期CRC中有一定的檢出率，可為CRC早期診斷提供依據(jù)。外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)的陽(yáng)性率隨著CRC的進(jìn)展而增加，這可能與隨著原發(fā)性腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡的增加引起釋放到外周血中的SEPT9基因DNA的增加有關(guān)。

3 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC治療中的應(yīng)用

3.1 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC術(shù)后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用大多數(shù)早期CRC患者進(jìn)行了手術(shù)治療，以切除原發(fā)性病變和區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)[38]。然而，盡管根治性切除術(shù)切除徹底，仍有30%～50%的患者將面臨CRC復(fù)發(fā)并死于腫瘤轉(zhuǎn)移[39]。進(jìn)行CRC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的術(shù)后監(jiān)測(cè)，并通過(guò)及時(shí)治療可延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。定期進(jìn)行CT檢查及CEA檢測(cè)是監(jiān)測(cè)CRC復(fù)發(fā)最常見(jiàn)的兩種方法[40]。然而，CT掃描對(duì)小病變（直徑＜1 cm）的敏感性有限，并且具有較高的假陽(yáng)性率[41-42]。CEA檢測(cè)是目前唯一被推薦用于常規(guī)監(jiān)測(cè)CRC復(fù)發(fā)的基于血液檢測(cè)的方法，但其敏感性和特異性仍欠佳[9]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的敏感生物標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)CRC的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)除了在CRC的早期診斷和篩查中應(yīng)用外，已經(jīng)顯示出了評(píng)價(jià)CRC療效和監(jiān)測(cè)CRC復(fù)發(fā)的潛力。在一項(xiàng)研究中，9 例接受根治性手術(shù)的CRC患者分別檢測(cè)了術(shù)前及術(shù)后的外周血SEPT9基因甲基化水平。結(jié)果顯示，在術(shù)后平均118 d時(shí)，有8 例患者SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)陰，同時(shí)CRC復(fù)發(fā)的患者SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果恢復(fù)陽(yáng)性。此外，SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的患者有發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的傾向，并且無(wú)病生存率（disease-free survival, DFS）較低，并與SEPT9基因甲基化水平成負(fù)相關(guān)[43]。雖然該研究的樣本量很小，但它表明外周血中的SEPT9基因甲基化具有作為CRC術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)指標(biāo)的潛力與價(jià)值。

3.2 SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC預(yù)后中的應(yīng)用SEPT9基因甲基化檢測(cè)也顯示出了在CRC中預(yù)測(cè)生存率的潛力。Shen等[44]進(jìn)行了一項(xiàng)系統(tǒng)回顧和Meta分析研究，結(jié)果證明了SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的CRC患者癌癥預(yù)后更差，總生存率（overall survival, OS）更低（HR＝2.07，95%CI：1.40～3.06），提示SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的癌癥患者與檢測(cè)結(jié)果陰性的癌癥患者相比，OS降低的風(fēng)險(xiǎn)將增加2倍。其次，術(shù)前外周血中檢測(cè)到SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的CRC患者的OS較差（HR＝3.25，95%CI：1.93～5.48），這項(xiàng)研究結(jié)果意味著SEPT9基因甲基化檢測(cè)是評(píng)價(jià)患者CRC預(yù)后的一種方便而有前途的方法。

4 SEPT9基因甲基化檢測(cè)與其他CRC檢測(cè)方法的聯(lián)合應(yīng)用

進(jìn)行多種檢測(cè)標(biāo)記物或方法的聯(lián)合應(yīng)用已成為CRC診斷和篩查的一種發(fā)展趨勢(shì)。Jin等[33]的研究表明，SEPT9基因甲基化檢測(cè)單獨(dú)檢測(cè)CRC的敏感性為76.8%，F(xiàn)IT單獨(dú)檢測(cè)CRC的敏感性為58.0%，而SEPT9基因甲基化檢測(cè)和FIT聯(lián)合檢測(cè)CRC的敏感性為94.2%，特異性為92.6%。此研究表明，SEPT9基因甲基化檢測(cè)和FIT檢測(cè)方法的聯(lián)合應(yīng)用與它們?nèi)我粏为?dú)檢測(cè)CRC相比，顯著提高了CRC檢測(cè)的靈敏度。Wu等[34]最近進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，SEPT9基因甲基化檢測(cè)聯(lián)合FIT對(duì)CRC檢測(cè)的敏感性為94.4%，SEPT9基因甲基化檢測(cè)、FIT和CEA三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)CRC的靈敏性為97.2%，而SEPT9基因甲基化檢測(cè)單獨(dú)檢測(cè)CRC的敏感性?xún)H為76.6%。此外，除上述檢測(cè)方法外，SEPT9基因甲基化檢測(cè)還可以與其他現(xiàn)有的CRC檢測(cè)生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，如糖蛋白標(biāo)記物或其他甲基化標(biāo)記物[37]。由T?nzer等[45]發(fā)表的一項(xiàng)研究表明甲基化的SEPT9和ALX4的聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)直腸息肉的檢測(cè)中具有重要意義，其靈敏度和特異性分別達(dá)到71%和95%。另一項(xiàng)研究[46]發(fā)現(xiàn)，SEPT9基因甲基化檢測(cè)和FIT聯(lián)合檢測(cè)晚期腺瘤的敏感性為67.6%，特異性為47.4%，而SEPT9基因甲基化檢測(cè)單獨(dú)檢測(cè)晚期腺瘤時(shí)的敏感性?xún)H為10.8%，這提示SEPT9基因甲基化檢測(cè)和FIT兩項(xiàng)檢測(cè)方法的聯(lián)合應(yīng)用可以提高晚期腺瘤的陽(yáng)性檢出率。這些研究表明了聯(lián)合檢測(cè)在檢測(cè)結(jié)直腸晚期癌前病變中的潛在應(yīng)用價(jià)值。然而，尚需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CRC檢測(cè)和篩查的應(yīng)用價(jià)值。

5 結(jié)語(yǔ)

外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)在CRC診斷和篩查中敏感性及特異性較高，目前有關(guān)外周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)的四種算法中，Septin9(1/3)算法靈敏性最高，Septin9(2/3)算法特異性最高?？筛鶕?jù)研究的目的進(jìn)行周血SEPT9基因甲基化檢測(cè)的算法選擇，滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)需求。SEPT9基因甲基化檢測(cè)在診斷癌前病變、術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)方面有一定應(yīng)用潛力，尚需大量臨床數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證。