社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素在肺炎支原體致病中的作用

鄒雨蕓，陳正榮

（1.蘇州大學兒科臨床學院，江蘇 蘇州 215025；2.蘇州大學附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215025）

社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）仍然是引發(fā)全世界死亡率和發(fā)病率的一個重要原因，特別是在老年人和5 歲以下兒童這些免疫力低下的人群中[1]。在住院病人中，CAP的死亡率可上升至10%，在需要機械通氣和延長住院時間的重癥監(jiān)護病房病人中，CAP的死亡率可超過30%。在所有CAP的病原體中，非典型呼吸道病原體，如肺炎支原體正日益被認為是呼吸道感染最重要的病原體，尤其是兒童呼吸道感染[2]。在一項涉及亞洲12個醫(yī)療中心的多中心研究中，超過23%的CAP病例中發(fā)現(xiàn)非典型呼吸道病原體。肺炎支原體在所有CAP病例中約12%檢測到，是分離的最常見的非典型病原體[3]。

在兒科人群中，肺炎支原體占所有下呼吸道感染的10%～40%[3-4]。肺炎支原體感染多發(fā)生在門診。然而，它也是因肺炎住院的一個重要原因，特別是在老年人和兒童等免疫功能低下的患者中[5]。肺炎支原體感染的表現(xiàn)可以從自限性上呼吸道疾病到嚴重肺炎。5 歲以下的兒童通常會出現(xiàn)輕微的上呼吸道癥狀，而較大的兒童和青少年則會出現(xiàn)支氣管肺炎，需要住院治療。

肺炎支原體屬于柔膜體綱支原體科支原體屬，是細胞壁缺乏的最小的自我復制生物體，能夠無細胞生存。肺炎支原體的絲狀體尖端有特殊結構，在結構中可見透明腔中圍繞著一個濃厚的核狀中心，該核狀中心為黏附于宿主呼吸道上皮細胞的結合點。尖端結構目前被認為是肺炎支原體與宿主相互作用的最主要結構。肺炎支原體侵入呼吸道后，借滑行運動定位于纖毛氈的隱窩內，以其尖端特殊結構牢固地黏附于上皮細胞表面的受體上，能抵抗黏膜纖毛的清除和吞噬細胞的吞噬，繼而產(chǎn)生一系列的細胞毒性作用[6]。肺炎支原體的基因組很小，大約為80萬堿基對，這是其有限的生物合成能力和緩慢的復制速率的原因[7]。因此，研究肺炎支原體的致病作用的一個主要障礙是缺乏對其生物學特性的知識，這是由于培養(yǎng)肺炎支原體存在一定的困難。

在過去的幾年里，研究人員利用分子方法詳細研究了與肺炎支原體相關的潛在致病因素，他們研究了不同的發(fā)病機制，如肺炎支原體的復雜黏附機制，社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征（communityacquired respiratory distress syndrome, CARDS）毒素激活炎癥小體和肺外并發(fā)癥的發(fā)生等等。肺炎支原體感染誘導炎癥途徑主要有以下四種通路：(1)TLR2識別脂蛋白；(2)介導自噬信號；(3)炎癥小體的激活；(4)黏附特性。其中CARDS毒素在肺炎支原體的炎癥小體激活的步驟中發(fā)揮著很重要的作用。這篇綜述將試圖回顧肺炎支原體的發(fā)病機制，簡單闡述CARDS毒素與呼吸道疾病發(fā)生的聯(lián)系，著重突出CARDS毒素在肺炎支原體致病作用方面的進展。

1 CARDS毒素來源與結構學

在20世紀70年代和80年代開展的早期研究中，研究人員曾試圖通過細胞培養(yǎng)與器官培養(yǎng)來系統(tǒng)性地描述肺炎支原體感染的致病機理[8-9]。倉鼠氣管培養(yǎng)的感染特點表現(xiàn)為纖毛功能喪失和胞質空泡化。隨后胞內空泡聚集，導致胞質變形和細胞損傷[9]。基于肺炎支原體感染的細胞毒性作用，研究人員猜想支原體膜相關的毒性因子可能是肺炎支原體的致病原因[10]。自由基產(chǎn)生的毒性作用只能部分解釋肺炎支原體的毒性作用[11-12]。1975年，Hu等[9]證明了在肺炎支原體感染的宿主細胞中，RNA和蛋白質的合成受到抑制，同時代謝底物的攝取減少，這不能用機體的細胞黏附過程來解釋。因此，Hu等[9]認為肺炎支原體對宿主細胞的主要有害影響是在DNA分子轉錄或翻譯水平。肺炎支原體感染的細胞病變效應只有在器官培養(yǎng)中感染后24 h以內添加紅霉素才能逆轉。因此這一結論指出，機體需要合成某種蛋白質或毒素來介導宿主細胞損傷[9]。隨后，Kannan等[13]在試圖表征肺炎支原體的毒力因子時觀察到鈣依賴、胰蛋白酶敏感的肺炎支原體與人體表面活性蛋白A的結合。肺炎支原體的活性蛋白A結合被發(fā)現(xiàn)是有機體在呼吸道的集群中的一個關鍵因素。肺炎支原體的蛋白需要通過親和層析法鑒定，然后進行純化和測序。與黏附蛋白、細胞黏附相關蛋白或纖維連接蛋白不同，68-kDa蛋白最初被稱為mpn372。它的催化位點與百日咳桿菌毒素S1亞基具有氨基酸同源性。類似于百日咳桿菌毒素S1亞基，mpn372蛋白被發(fā)現(xiàn)可以用來催化二磷酸腺苷核糖基化（ADP-核糖基化），并在感染細胞中具有空泡化功能[13]。通過利用哺乳動物細胞系和狒狒氣管的器官培養(yǎng)，Kannan和Baseman[10]證實了這種蛋白質的毒力特性，并將其命名為CARDS毒素。

為解決原支原體肉湯培養(yǎng)中微量分離或分離量不足的問題，Kannan等[14]在大腸桿菌中表達合成了重組CARDS毒素。用重組毒素處理倉鼠卵巢細胞或HEp-2細胞，結果表明重組毒素具有將煙酰胺腺嘌呤二磷酸（NAD+）中的ADP核糖基轉移到細胞蛋白氨基酸的能力。CARDS毒素的核糖化特性導致蛋白質靶點的改變，包括宿主細胞代謝途徑的酶，從而導致細胞毒性。細胞病變表現(xiàn)為空泡化、細胞圓化和細胞變形[14]。

2 CARDS毒素在肺炎支原體發(fā)病機制

2.1 CARDS毒素導致氣道上皮細胞壞死 CARDS毒素已被證明通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用內化到哺乳動物細胞中[15]。在狒狒氣管環(huán)器官培養(yǎng)中，重組CARDS毒素導致呼吸上皮纖毛功能喪失、胞質大量空泡化、核固縮以及上皮完整性被破壞[16]。這些毒素介導的氣管環(huán)細胞毒性的進展性變化也在一定程度上解釋了肺炎支原體呼吸道疾病的發(fā)病機制。CARDS毒素的空泡毒素作用與肺炎支原體感染后的組織病理改變有著重要聯(lián)系，包括氣道上皮細胞與纖毛細胞等空泡變性，進而導致纖毛運動障礙、纖毛剝脫、氣道上皮細胞壞死脫落與氣道上皮完整性缺失等改變。而胞質中空泡的大量產(chǎn)生多來源于細胞內吞系統(tǒng)的核內體、溶酶體等[17]。

2.2 CARDS毒素的促炎癥作用 在小鼠和靈長類動物模型中，Kannan等[18]也針對重組CARDS毒素對呼吸道的影響進行了研究。在鼻腔接種BALB/c的小鼠誘導氣道黏膜產(chǎn)生廣泛的細支氣管周圍炎癥和血管周圍炎癥。暴露于支氣管肺泡灌洗液后第7天，嗜酸性粒細胞顯著增加，伴有短暫中性粒細胞增多。Hardy等[19]證明，小鼠早期的細胞因子反應主要是促炎癥反應，包括IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α。在狒狒中，毒素接種導致趨化因子增加，如粒細胞集落刺激因子以及促炎細胞因子，與人類肺炎支原體感染非常相似。因此，在動物模型中，CARDS毒素暴露會引起呼吸道的促炎反應。

核苷酸結合寡聚化結構域富含亮氨酸重復包含受體是細胞內的模式識別受體因子，存在于多種細胞中，如淋巴細胞、巨噬細胞等。NLRs是作為病原體相關分子模式的傳感器。最典型的NLR是髓系細胞表達的NLRP-3，在對PAMPs的反應中上調后與炎性小體結合。這種NLRP-3炎癥復合體可以激活caspase-1，進而導致IL-1β的釋放[20]。IL-1β是一種炎癥細胞因子，它通過活化的B細胞依賴途徑激活核因子輕鏈增強劑來放大針對感染因子的炎癥反應[21]。CARDS毒素與NLRP-3炎性小體在體外小鼠骨髓源性巨噬細胞內共定位，通過NLRP-3的ADP核糖化特性激活炎性小體，隨后釋放IL-1β[22-23]。而CARDS毒素可以通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用內化到哺乳動物細胞中[15]。因此，通過細胞進入CARDS毒素介導的肺泡巨噬細胞中炎癥小體的激活，可以有效釋放促炎細胞因子IL-1β進入氣道。然而，感染后炎癥小體的過度激活會導致組織損傷，因為引發(fā)氣道“過度炎癥”[20,24]。

2.3 CARDS毒素調控Th2分化作用 CARDS毒素在體內具有高免疫原性表位，可引起嗜酸性粒細胞增多，T細胞和B細胞積聚，產(chǎn)生相應的自身抗體，同時釋放各種細胞因子[25]。Medina等[26]通過對肺炎支原體感染小鼠肺泡灌洗液的定量逆轉錄聚合酶鏈反應也證實了TH2細胞因子IL-4和IL-13和趨化因子、趨化因子配體-7和趨化因子配體-32的表達顯著增加。細胞因子的表達增加對T細胞亞群Th1/Th2比例產(chǎn)生破壞，表現(xiàn)為Th2細胞炎性反應增強，導致黏液化生、氣道高反應性增加和肺功能下降。在Medina等[26]的實驗中，先前小鼠曾用卵清蛋白致敏，而重組CARDS毒素暴露導致小鼠呼吸道Th2炎癥反應加重。感染小鼠的侵入性肺測量結果顯示，由于氣道反應性增加，進而導致氣道阻力增加，肺順應性降低。

3 CARDS毒素與疾病的關系

變應原誘導的炎癥小體激活也導致肺損傷和肺重塑，這與哮喘和慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機制有關[27]。同時，CCL-17和CCL-22的趨化活性導致淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的聚集、IL-4和IL-13表達的增加、嗜酸性粒細胞介導的肺部炎癥和氣道反應性的增加是人類哮喘發(fā)病的決定性因素。CARDS毒素在小鼠和狒狒等靈長類動物的呼吸道分泌物中也能產(chǎn)生類似的細胞因子和細胞特征。這些發(fā)現(xiàn)表明了CARDS毒素在哮喘惡化中的作用，并進一步證實了肺炎支原體感染和哮喘之間的聯(lián)系。

4 總結與展望

自從采用高靈敏度的分子分析方法以來，研究人員對這種生物體的發(fā)病機制的認識有所提高，并且開始進一步研究并描述CARDS毒素的生物特征。在炎癥小體的作用方面，研究人員對于免疫發(fā)病機制的認識已經(jīng)取得了重大進展，它們可以作為調節(jié)疾病過程的潛在治療靶點，例如針對相關肽的抑制劑或抗體。然而，大多數(shù)研究都是在細胞系或動物模型中進行的。因此，需要對人類亞細胞水平的發(fā)病機制進行更大規(guī)模的研究來設計出能在易感人群中產(chǎn)生高水平保護性免疫的疫苗。這些研究將進一步提高我們對肺炎支原體致病機制及其過程的了解與認知，特別是在機體與慢性肺部疾病和肺外并發(fā)癥的關系方面。研究CARDS毒素的毒性特性可以提供新的診療模式，從而使肺炎支原體感染能夠得到全面有效的管控。