免疫檢查點CTLA4和PD-1在急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用

吳川林,汝繼軒,白雪巍

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胰膽外科，哈爾濱 150001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床上常見的一種急腹癥，其發(fā)病原因主要與膽石癥、酒精、高脂血癥和藥物等因素相關(guān)。AP病情進(jìn)展迅速，有5%～10%的患者會發(fā)展為重癥AP。重癥AP患者常合并全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能衰竭以及細(xì)菌感染等并發(fā)癥，病死率高達(dá)30%[1-3]。在AP發(fā)病早期，大量的炎癥因子被激活并釋放入血，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)。為了恢復(fù)免疫平衡，代償性抗炎反應(yīng)隨之出現(xiàn)，并在病情發(fā)展過程中逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制，甚至引起后期感染性并發(fā)癥[4]。近年來有研究指出，共抑制性免疫檢查點是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫抑制的重要組成部分，它與共刺激性免疫檢查點共同組成了免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，對維持機(jī)體自身的免疫耐受以及防止過度的炎癥反應(yīng)具有重要意義[5]。其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)和程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)是免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中作用最大、研究范圍最廣的共抑制性免疫檢查點受體，甚至臨床上已經(jīng)批準(zhǔn)使用相關(guān)免疫抑制劑進(jìn)行癌癥的治療[6]。研究發(fā)現(xiàn)，共抑制性免疫檢查點受體CTLA4和PD-1與AP密切相關(guān)，它們可以通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能參與AP的免疫調(diào)控[7]。現(xiàn)就CTLA4和PD-1共抑制性免疫檢查點受體的結(jié)構(gòu)、功能、激活途徑以及在AP免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 CLTA4和PD-1的結(jié)構(gòu)和功能介紹

1.1CTLA4的結(jié)構(gòu)和功能 CTLA4又稱CD152，是免疫蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要含有1個前導(dǎo)肽和3個結(jié)構(gòu)域，即116個氨基酸的細(xì)胞外V型結(jié)構(gòu)域，37個氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域和34個氨基酸的細(xì)胞內(nèi)尾端結(jié)構(gòu)域[8]。CTLA4主要在活化的T淋巴細(xì)胞上表達(dá)，雖然CTLA4是細(xì)胞膜的表面免疫調(diào)節(jié)受體，但主要存在于細(xì)胞內(nèi)囊泡中，并通過內(nèi)吞作用在細(xì)胞內(nèi)囊泡與細(xì)胞膜之間循環(huán)[9]。此外，CTLA4在靜息狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)上常規(guī)表達(dá)，并且在T淋巴細(xì)胞被激活后表達(dá)水平升高[10]。CTLA4與共刺激性受體CD28高度同源，能夠與抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)上的CD80/CD86配體結(jié)合[11]。CTLA4的免疫抑制信號對維持機(jī)體的免疫平衡具有重要作用。敲除CTLA4基因小鼠可迅速發(fā)展為淋巴細(xì)胞增殖性疾病，并伴有多器官淋巴細(xì)胞浸潤和組織損傷，最終發(fā)生死亡[12-13]。當(dāng)機(jī)體缺乏CTLA4的負(fù)性免疫抑制信號后，可能會引起淋巴細(xì)胞激活的閾值降低，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。CTLA4的相關(guān)研究已經(jīng)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的研究和臨床治療中取得了顯著成效[14-15]。此外，CTLA4作為第一代免疫檢查點的靶標(biāo)，美國食品藥品管理局自2011年起，批準(zhǔn)將抗CTLA4免疫抑制劑用于黑色素瘤等腫瘤的相關(guān)治療[16-17]。

1.2PD-1的結(jié)構(gòu)和功能 PD-1是一種分子量為50 000～55 000的Ⅰ型跨膜蛋白，由細(xì)胞的可變型免疫球蛋白胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和執(zhí)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成[18]。其中細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有兩個重要的氨基酸信號序列：免疫受體氨基酸抑制序列和免疫受體氨基酸開關(guān)序列。PD-1主要在T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，也可在單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)[19]。有研究表明，T淋巴細(xì)胞在受到刺激后數(shù)小時內(nèi)即可在細(xì)胞表面表達(dá)PD-1，而無刺激狀態(tài)的靜止性T淋巴細(xì)胞則不表達(dá)PD-1[20]。程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)又稱B7-H1，是PD-1的主要配體，也是Ⅰ型跨膜蛋白，主要由IgV樣結(jié)構(gòu)域、IgC樣結(jié)構(gòu)域、信號序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。PD-L1可以在T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)[19]。PD-1/PD-L1信號通路對腫瘤的免疫監(jiān)視具有重要意義。在腫瘤微環(huán)境中，多種細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1,并通過結(jié)合T淋巴細(xì)胞的PD-1后抑制T淋巴細(xì)胞活性，從而逃避免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視及清除[21]。針對PD-1/PD-L1在腫瘤免疫中的作用，美國食品藥品管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了多種靶向PD-1/PD-L1相關(guān)免疫抑制劑用于癌癥的相關(guān)治療[22-23]。此外，有研究顯示，聯(lián)合使用抗CTLA4和抗PD-1藥物治療腫瘤的效果更佳[24]?？笴TLA4主要通過提高淋巴細(xì)胞對腫瘤相關(guān)性抗原的識別能力發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，而靶向抗PD-1治療可以直接激活CD8+T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用[25]。

2 免疫檢查點通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能參與AP的免疫反應(yīng)

2.1T淋巴細(xì)胞在AP中的作用及地位 免疫檢查點調(diào)節(jié)機(jī)制作為免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)方式，主要通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能參與炎癥反應(yīng)。雖然在AP的發(fā)病早期主要是由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放大量的炎癥因子啟動AP的炎癥反應(yīng)，但是T淋巴細(xì)胞在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能方面也發(fā)揮重要作用。Demols等[26]對T淋巴細(xì)胞缺乏的小鼠誘導(dǎo)發(fā)生AP，其胰腺損傷程度較對照組(無T淋巴細(xì)胞缺乏的正常小鼠)明顯減輕，而將T淋巴細(xì)胞移植回T淋巴細(xì)胞缺乏的小鼠后，其病情與對照組相似。該團(tuán)隊進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞能夠通過釋放炎癥介質(zhì)激活巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，并且能夠通過Fas-Fas配體途徑發(fā)揮直接的細(xì)胞毒性作用。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞與AP的病情發(fā)展密切相關(guān)，他們檢測了69例并發(fā)器官衰竭的AP患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞的水平，其中持續(xù)性器官衰竭患者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這可能是外周血中的淋巴細(xì)胞遷移至胰腺等炎癥組織中所致，這些遷移的T淋巴細(xì)胞能進(jìn)一步加重胰腺的炎癥損傷。同時還發(fā)現(xiàn)，可以通過測量患者第1天外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞的水平來預(yù)測AP的病情發(fā)展。這可能與CD4+T淋巴細(xì)胞的輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th細(xì)胞)1和Th17亞群細(xì)胞有關(guān)。這些細(xì)胞釋放的γ干擾素、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2和IL-17等促炎因子能夠活化中性粒和巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步損傷胰腺組織[28-30]。而且活化的T淋巴細(xì)胞釋放的大量炎癥因子通過“扳機(jī)樣反應(yīng)”啟動其他炎癥因子的活化，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子發(fā)生瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)了AP早期的全身炎癥反應(yīng)綜合征。此外，CD4+T淋巴細(xì)胞還可以分化為具有抑炎作用的Th2和Treg細(xì)胞亞群，其中Treg細(xì)胞釋放的IL-10是炎癥反應(yīng)中重要的抑炎因子，能夠抑制腺泡細(xì)胞的壞死，并且還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從促炎的M1型極化為M2型，降低炎癥損傷[31-33]。

2.2免疫檢查點對T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用 目前認(rèn)為CTLA4主要通過競爭性結(jié)合CD28的配體發(fā)揮免疫抑制作用。當(dāng)T細(xì)胞抗原受體(T cell antigen receptor，TCR)與主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合時，CD28與CD80/CD86相互作用以增強(qiáng)TCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為T淋巴細(xì)胞的活化提供二級刺激信號。然而，當(dāng)CD28及TCR被激活后，可以傳遞信號誘導(dǎo)CTLA4表達(dá)。隨后APC上的CD80/CD86與親和力更高的CTLA4受體結(jié)合，CTLA4再通過反式內(nèi)吞作用去除CD80/CD86導(dǎo)致CD28的激活作用受損，從而發(fā)揮負(fù)性的免疫調(diào)節(jié)功能[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，CTLA4與配體結(jié)合后可以誘導(dǎo)吲哚胺-2,3-雙加氧酶表達(dá)，吲哚胺-2,3-雙加氧酶可以通過分解色氨酸抑制T淋巴細(xì)胞增殖[34-35]。CTLA4還能通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路、細(xì)胞周期蛋白D3、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6和核因子κB來抑制T淋巴細(xì)胞的增殖及活性[35-37]。有研究提出，CTLA4不僅可以通過細(xì)胞內(nèi)部的機(jī)制抑制T淋巴細(xì)胞功能，還可以通過改變T淋巴細(xì)胞與APC之間的作用時間發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。CTLA4受體被激活后直接逆轉(zhuǎn)了由TCR受體產(chǎn)生的“停止信號”，抑制了APC與T淋巴細(xì)胞之間的穩(wěn)定性免疫復(fù)合物形成，阻止了TCR黏附信號的傳遞，縮短T淋巴細(xì)胞與APC作用時間，從而降低細(xì)胞間的信號傳遞效率[38]。還有研究認(rèn)為，CTLA4通過發(fā)出“走”的信號來提高T淋巴細(xì)胞的運(yùn)動性，減少與APC之間的接觸[39]。

與CTLA4不同，在T淋巴細(xì)胞與APC相互作用期間，PD-1在細(xì)胞突觸上廣泛表達(dá)[40]。PD-1與配體結(jié)合后可以募集胞內(nèi)的酪氨酸磷酸酶將PD-1的胞內(nèi)尾端磷酸化，并且PD-1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域免疫受體氨基酸抑制序列和免疫受體氨基酸開關(guān)序列可以與含有Src同源-2(Src homology 2,SH2)結(jié)構(gòu)的SH2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP-2)酪氨酸磷酸酶結(jié)合，從而傳遞抑制信號抑制T淋巴細(xì)胞活性[41]。然而，目前關(guān)于PD-1抑制T淋巴細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚未完全明確。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為PD-1主要通過靶向抑制TCR信號激活發(fā)揮免疫抑制作用[42]。PD-1募集酪氨酸磷酸酶SHP2后降低了TCR內(nèi)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基CD3 ζ和Zeta鏈相關(guān)蛋白激酶70的磷酸化，從而減弱了TCR信號的活化[42]。然而有研究發(fā)現(xiàn)，PD-1介導(dǎo)的抑制信號中的主要靶目標(biāo)是T淋巴細(xì)胞的共刺激受體CD28,通過對比CD28與CD3 ζ和Zeta鏈相關(guān)蛋白激酶70以及TCR下游適配器的T細(xì)胞激活接頭和含有分子量為76 000白細(xì)胞蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域后發(fā)現(xiàn)，CD28是PD-1-SHP2最敏感的靶標(biāo)[43]。Mizuno等[44]的研究則認(rèn)為PD-1可以直接抑制TCR信號，而CD28的共刺激信號則減弱了PD-1對TCR信號的抑制作用。此外，Mathieu等[45]發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1可以通過激活Notch信號通路誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖。PD-1募集酪氨酸磷酸酶SHP2后抑制Th1細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子激活，促進(jìn)Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞，并通過滅活天冬酰胺基內(nèi)肽酶維持Treg細(xì)胞的免疫抑制功能[46-48]。

3 免疫檢查點與AP的相關(guān)研究

20世紀(jì)90年代，研究人員培養(yǎng)了CTLA4基因缺乏的小鼠15 d后，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)出現(xiàn)胰腺炎、心肌炎的多器官損害現(xiàn)象，其中以胰腺炎的表現(xiàn)最為嚴(yán)重[12]。此外，近年在使用Ipilimumab(抗CTLA4相關(guān)免疫抑制劑)和Nivolumab(抗PD-1相關(guān)免疫抑制劑)等免疫檢查點相關(guān)抑制劑的臨床治療過程中，患者出現(xiàn)了胰腺炎等并發(fā)癥[49-51]。這些研究可能提示，在失去共抑制性免疫檢查點受體的免疫監(jiān)視后，免疫平衡狀態(tài)被打破，大量的炎癥細(xì)胞因子被激活并遷移至胰腺組織，通過釋放大量的炎癥因子和直接的細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致局部以及全身的炎癥損傷。

CTLA4和PD-1免疫檢查點介導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)與AP的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。Zhulai等[52]研究發(fā)現(xiàn)AP患者外周血中Treg細(xì)胞的CTLA4表達(dá)水平較健康對照組明顯升高。Pan等[7]研究AP患者發(fā)病期間感染性并發(fā)癥與免疫檢查點之間的聯(lián)系發(fā)現(xiàn)，AP患者在發(fā)病后第1天和第3天表達(dá)PD-1的CD4+T淋巴細(xì)胞和表達(dá)PD-L1的CD14+單核細(xì)胞的百分比增加，尤其在并發(fā)感染時增加程度更顯著。而且PD-1表達(dá)的增加與外周循環(huán)血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少以及血漿IL-10水平增加有關(guān)。此外，Chen等[53]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血清中游離的PD-L1水平與AP的感染性并發(fā)癥密切相關(guān)，并發(fā)感染性并發(fā)癥患者外周血中PD-L1水平明顯升高，并與外周血中的淋巴細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，其聯(lián)合血清游離PD-L1水平與淋巴細(xì)胞計數(shù)對預(yù)測AP患者的感染性并發(fā)癥具有較高的準(zhǔn)確性。這些研究均提示，AP發(fā)病期間的免疫抑制可能由免疫檢查點介導(dǎo)。在并發(fā)感染性并發(fā)癥時，這些過度激活的免疫抑制信號遏制了T淋巴細(xì)胞功能，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞對病原體的免疫識別及清除能力下降，進(jìn)一步加重AP患者的感染性并發(fā)癥。但關(guān)于免疫檢查點在AP中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

盡管目前關(guān)于AP與免疫檢查點受體CTLA4和PD-1的研究尚處于起步階段，但逐漸揭示了免疫抑制現(xiàn)象在AP中的作用。在AP的早期發(fā)展階段，機(jī)體為了遏制過度激活的炎癥反應(yīng)，免疫細(xì)胞的CTLA4和PD-1等共抑制性免疫檢查點被激活，釋放抗炎因子發(fā)揮代償性抗炎反應(yīng)。AP的病情轉(zhuǎn)歸最終取決于炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)之間的平衡。當(dāng)抗炎反應(yīng)足夠強(qiáng)烈能夠“中和”炎癥反應(yīng)時，患者病情可能好轉(zhuǎn)。相反，抗炎反應(yīng)無法抵抗過度激活的炎癥反應(yīng)時，患者病情加重，甚至出現(xiàn)多器官功能衰竭等全身性免疫損傷。然而，過度的抗炎反應(yīng)又會使機(jī)體進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)，甚至導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能耗竭，增加機(jī)體易感性，并發(fā)后期的細(xì)菌感染。充分利用免疫檢查點CTLA4和PD-1的免疫抑制通路在AP中的作用，可能為臨床提供新的診療方案。

4 小 結(jié)

針對CTLA4和PD-1的AP治療可能與腫瘤的治療有所區(qū)別。因為在AP發(fā)展的不同階段CTLA4和PD-1的免疫抑制作用可能扮演不同的角色。早期若能充分激活CTLA4和PD-1共抑制性免疫檢查點受體，以遏制炎癥細(xì)胞的過度激活，或許可以阻止局部的胰腺組織的炎癥反應(yīng)擴(kuò)散至全身炎癥反應(yīng)，減少其他器官的炎癥損傷。而在病程晚期，利用抗CTLA4和抗PD-1相關(guān)免疫抑制劑阻止過度發(fā)展的免疫抑制反應(yīng)，提高T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞對細(xì)菌的免疫清除能力，可以降低后期感染性并發(fā)癥的發(fā)生率。但在尚未完全了解免疫檢查點在AP發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制前，針對CTLA4和PD-1的AP治療還處于理論階段。因此，深入探討免疫檢查點在AP發(fā)病過程中的作用，并因此提出針對性的治療方法具有重要的理論意義與實踐價值，這也是今后AP基礎(chǔ)與臨床研究的方向。