二代測(cè)序技術(shù)在膿毒癥病原學(xué)診斷中應(yīng)用進(jìn)展

張瑤璐 盧中秋

膿毒癥是一種宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致器官功能障礙的臨床綜合征，是世界上最常見(jiàn)的危重癥之一[1]。近年來(lái)，盡管在診斷和治療方面均有進(jìn)展，但短期病死率仍居高不下[2]。正確的治療策略對(duì)于膿毒癥患者來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，而成功治療的關(guān)鍵在于確診為膿毒癥后盡早使用抗菌藥物。若不能及時(shí)使用抗菌藥物，膿毒癥患者的住院病死率就會(huì)大大增加[3]。病原學(xué)培養(yǎng)技術(shù)是診斷膿毒癥病原體的金標(biāo)準(zhǔn)，但其存在著一些不足，例如，病原體培養(yǎng)所需的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，患者提前使用廣譜抗生素導(dǎo)致無(wú)法培養(yǎng)出致病菌,無(wú)法鑒定除了可培養(yǎng)的細(xì)菌和真菌外的微生物等[4～6]。因此，尋找檢測(cè)范圍廣、不受抗菌藥物干擾并且快速有效的診斷方法對(duì)膿毒癥病原體的診斷將有極大的幫助。

近年來(lái)，二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，已被證明是遺傳性疾病基因診斷的有效手段[7]。同時(shí)，二代測(cè)序技術(shù)也在感染性疾病的病原學(xué)診斷中逐步得到應(yīng)用，為感染性疾病的準(zhǔn)確診斷提供了更多的可靠依據(jù)。2014年，Wilson等[8]報(bào)道了二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原學(xué)診斷中的病例。此后，較多報(bào)道介紹了二代測(cè)序技術(shù)在膿毒癥病原學(xué)診斷中的應(yīng)用，故本文對(duì)此進(jìn)行綜述。

一、二代測(cè)序技術(shù)概述

二代測(cè)序技術(shù)(又稱為高通量或大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù))作為一種新興的分子診斷方法，可在一次測(cè)序過(guò)程中對(duì)樣本中的所有核酸片段進(jìn)行檢測(cè)，既可檢測(cè)出人類基因組，也可檢測(cè)出樣本中病原體的核酸序列。二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)是進(jìn)行合成和延伸的同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序速度比第一代測(cè)序快，測(cè)序通量也較第一代測(cè)序高。二代測(cè)序的病原體檢測(cè)的范圍，遠(yuǎn)大于常規(guī)的血培養(yǎng)病原學(xué)檢測(cè)，不僅包括細(xì)菌、真菌，還包括病毒、寄生蟲(chóng)等[9]。近年來(lái)使用二代測(cè)序技術(shù)的成本已經(jīng)顯著降低[10]。此外，與Sanger測(cè)序技術(shù)比較，二代測(cè)序技術(shù)不需要靶特異性引物，其優(yōu)勢(shì)是通過(guò)一次程序的運(yùn)行，既能識(shí)別全部病原體，還能鑒別病原體的分型。因此，該技術(shù)在臨床上可為醫(yī)師的疾病判斷提供更多有效的信息[11]。

二代測(cè)序技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)的應(yīng)用包括：(1)全基因組測(cè)序：對(duì)目標(biāo)病原體進(jìn)行測(cè)序，獲得完整的基因組信息，用于評(píng)估流行性疾病中的遺傳關(guān)系、鑒定新物種等。(2)靶向二代測(cè)序：用擴(kuò)增或探針雜交的方法進(jìn)行基因富集，即使用16S rDNA細(xì)菌圖譜或PCR擴(kuò)增指定目標(biāo)核酸片段，然后應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。(3)宏基因組二代測(cè)序：是一種對(duì)樣本中全部核酸[DNA和(或)RNA]進(jìn)行平行測(cè)序的方法，可同時(shí)從樣本中分離和擴(kuò)增出宿主和病原體的核酸序列[12]。現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScopeTMSingle Molecule Sequencer、美國(guó)Dana-her Motion公司的Polonator；以及連接法測(cè)序，即通過(guò)引物來(lái)定位核酸信息，技術(shù)平臺(tái)有Applied Biosystems/SOLiDTMsystem。

二、二代測(cè)序技術(shù)在膿毒癥病原學(xué)診斷中的應(yīng)用

1.病原體檢測(cè)：對(duì)疾病進(jìn)行快速診斷并獲得準(zhǔn)確的病原學(xué)資料對(duì)于有效的治療至關(guān)重要。大量病例報(bào)告和臨床研究表明，二代測(cè)序技術(shù)可以用于檢測(cè)腦脊液、呼吸道分泌物、糞便、尿液和血液等中的病原體，能夠提高包括膿毒癥在內(nèi)的感染性疾病病原學(xué)診斷的準(zhǔn)確性、及時(shí)性，為精準(zhǔn)治療提供可靠的保障[8,13～17]。 Grumaz等[17]在2016年報(bào)道了首例基于游離循環(huán)DNA(circulating free DNA，cfDNA)的研究，即使用來(lái)自膿毒癥患者和未感染對(duì)照組的血漿樣本對(duì)膿毒癥病原體進(jìn)行定量測(cè)序診斷。該研究建立了膿毒癥指示性量化指標(biāo)(sepsis indicating quantifier，SIQ)評(píng)分，該指標(biāo)為病原體的豐度和在膿毒癥中致病作用大小的乘積。

SIQ評(píng)分作為評(píng)估病原體致病性的定量評(píng)分，可以在測(cè)序結(jié)果中將病原菌的信號(hào)讀數(shù)從污染物或共生物種中區(qū)分出來(lái)。該研究嘗試將cfDNA的定量結(jié)果作為膿毒癥的診斷和預(yù)后標(biāo)志。由于cfDNA的半衰期很短，獲得的SIQ評(píng)分在感染過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化，因此，微生物來(lái)源的SIQ評(píng)分可以反映感染的動(dòng)態(tài)變化，用于監(jiān)測(cè)患者的病情發(fā)展和評(píng)價(jià)對(duì)治療的反應(yīng)。該團(tuán)隊(duì)在另一項(xiàng)研究中基于二代測(cè)序技術(shù)，使用SIQ評(píng)分來(lái)定量診斷侵襲性真菌感染[18]。該研究表明應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)可以：(1)驗(yàn)證經(jīng)血培養(yǎng)診斷出的念珠菌血癥。(2)檢測(cè)出早期血培養(yǎng)陰性的侵襲性真菌感染。(3)糾正被誤診為真菌定植，實(shí)則為侵襲性真菌感染的診斷。

Grumaz等[19]在一項(xiàng)包括50例膿毒癥患者和20例未感染的擇期手術(shù)患者作為對(duì)照組的研究中發(fā)現(xiàn)，28天的研究期間內(nèi)二代測(cè)序診斷病原體的陽(yáng)性率比血培養(yǎng)高6倍以上，這表明基于二代測(cè)序技術(shù)的分子檢測(cè)技術(shù)為鑒定臨床相關(guān)病原體提供了一個(gè)有價(jià)值的診斷平臺(tái)，患者有可能從測(cè)序診斷中獲得更合適的治療。

Long等[20]在北京協(xié)和醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)開(kāi)展的單中心研究中包括來(lái)自78例ICU患者和10例健康志愿者的血漿樣本。78份疑似菌血癥患者的血漿標(biāo)本通過(guò)二代測(cè)序和血培養(yǎng)進(jìn)行分析，10份健康志愿者的血漿標(biāo)本作為陰性對(duì)照進(jìn)行二代測(cè)序分析，以校準(zhǔn)和設(shè)定檢測(cè)閾值。研究顯示，就細(xì)菌和真菌而言，7個(gè)樣本血培養(yǎng)和測(cè)序均呈陽(yáng)性，3個(gè)樣本血培養(yǎng)陽(yáng)性而測(cè)序陰性，8個(gè)樣本血培養(yǎng)陰性而測(cè)序陽(yáng)性。以培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，二代測(cè)序的敏感度和特異性分別為72.7%和89.6%。另外，在14個(gè)樣本中應(yīng)用測(cè)序發(fā)現(xiàn)了病毒感染，這說(shuō)明二代測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)診斷病毒和細(xì)菌病原體。然而，在培養(yǎng)中只有細(xì)菌或真菌可被檢測(cè)到。這一測(cè)序優(yōu)勢(shì)能通過(guò)一次性測(cè)試更全面了解患者的感染范圍。當(dāng)把血培養(yǎng)和測(cè)序結(jié)合起來(lái)時(shí)，診斷為陽(yáng)性的樣本數(shù)量從12.82%增加到23.08%，這為建立治療方案提供了更準(zhǔn)確的信息。

2.鑒別污染菌(“排除”檢測(cè))：在疾病評(píng)估中確認(rèn)感染源和排除感染源同樣重要。二代測(cè)序能夠同時(shí)檢測(cè)樣本中存在的DNA和RNA病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)，因此其在排除感染方面似乎比常規(guī)的檢測(cè)方法更有說(shuō)服力。Gosiewski等[21]使用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)健康受試者和膿毒癥患者的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，以確定健康人群和膿毒癥患者血液中的細(xì)菌分類情況。研究表明，在健康受試者中，觀察到血液中厭氧菌的數(shù)量明顯占優(yōu)勢(shì)(76.2%)，其中以雙歧桿菌目細(xì)菌(73.0%)居多。在膿毒癥患者中，檢測(cè)到的大多數(shù)屬于需氧或微需氧細(xì)菌(75.1%)。放線菌門(mén)的豐度在膿毒癥中下降最為顯著(P=0.000)，變形菌門(mén)在健康受試者中下降(P=0.000)。

Grumaz等[17]研究發(fā)現(xiàn)，像痤瘡丙酸桿菌這樣常見(jiàn)的皮膚共生菌的標(biāo)準(zhǔn)化讀數(shù)在所有樣品之間都存在顯著差異，尤其是在未受感染的對(duì)照組中檢測(cè)到更高的豐度。利用這類數(shù)據(jù)，可為在膿毒癥中鑒別致病菌提供依據(jù)。許多研究表明，二代測(cè)序技術(shù)的診斷性能，包括陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，均強(qiáng)于臨床上常用的檢測(cè)方法[22]。在一項(xiàng)前瞻性研究中，Salzberg等[23]從活檢中保留了10例疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦組織，使用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腦組織中的潛在病原體。在5例患者中獲得了陰性或非特異性測(cè)序結(jié)果，以此推斷為無(wú)活動(dòng)性感染。該結(jié)論在后期的病理檢查和有效的類固醇治療中得到驗(yàn)證?？煽康年幮詼y(cè)序結(jié)果有助于支持無(wú)病原體感染的判斷，這能夠幫助醫(yī)生減少對(duì)活動(dòng)性感染的擔(dān)憂。隨著二代測(cè)序技術(shù)工作流程的改善和診斷準(zhǔn)確性的提高，該技術(shù)將在排除感染方面發(fā)揮更大的作用。

3.病原體耐藥基因識(shí)別：及時(shí)、有效地應(yīng)用抗菌藥物對(duì)治療膿毒癥至關(guān)重要。常規(guī)的藥敏試驗(yàn)通常在已經(jīng)分離好的病原體上進(jìn)行，這些方法非常耗時(shí)，并進(jìn)一步忽略了難以培養(yǎng)及不可培養(yǎng)的細(xì)菌[24]。二代測(cè)序能夠?qū)Σ≡w的整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，因此在識(shí)別細(xì)菌抗生素耐藥性基因上具有巨大的潛力[25]。二代測(cè)序技術(shù)是一種非靶向方法，理論上可以檢測(cè)包括抗生素耐藥基因在內(nèi)的所有基因。Grumaz等[17]分析了1例在肝移植后出現(xiàn)膿毒癥癥狀的59歲女性的血漿樣本，對(duì)其血漿cfDNA進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)出納入了CARD數(shù)據(jù)庫(kù)中的抗性基因，包括vanB、vanSB、tet1和sat4，且其檢測(cè)結(jié)果與微生物學(xué)測(cè)試相符，顯示病原體為抗萬(wàn)古霉素腸球菌，對(duì)萬(wàn)古霉素和四環(huán)素具有耐藥性。因此，若有足量的序列覆蓋，使用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)抗生素耐藥性基因似乎是可行的。但是，目前研究中細(xì)菌和真菌測(cè)序的覆蓋率仍然較低，往往只能滿足物種鑒定的需要，不能有效地全面覆蓋抗生素耐藥基因的檢測(cè)。因此，在測(cè)序獲得病原體診斷結(jié)果后，臨床醫(yī)生仍需根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇抗生素。這一缺點(diǎn)可能與血液中病原體的核酸含量遠(yuǎn)低于宿主的核酸含量，且cfDNA的半衰期較短有關(guān)[26]。目前，二代測(cè)序技術(shù)在膿毒癥診斷中的應(yīng)用仍集中在病原體鑒定上，在抗生素耐藥性的檢測(cè)上缺少系統(tǒng)性的研究，未來(lái)有望在此方面開(kāi)展深入研究。

三、展 望

膿毒癥的診斷是一個(gè)挑戰(zhàn)。運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病原體的潛力已經(jīng)在許多研究和臨床中得到證實(shí)，而且其在診斷膿毒癥方面也顯示出巨大的影響力。二代測(cè)序技術(shù)在包括膿毒癥在內(nèi)的感染性疾病診斷中也存在著許多亟待解決的問(wèn)題。例如，標(biāo)本中存在的微生物污染、運(yùn)輸及操作過(guò)程造成的污染及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染，都可能導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確度下降，增加檢測(cè)結(jié)果分析的困難。因此，檢測(cè)人員在操作過(guò)程需要遵守?zé)o菌原則，并且要建立完善的質(zhì)量控制體系。由于測(cè)序技術(shù)的非特異性，檢測(cè)出的微生物同時(shí)包括定植菌、污染菌和致病菌，增加了結(jié)果判讀的復(fù)雜性和難度。

綜上所述，cfDNA定量分析在一定程度上有助于致病菌的判讀。未來(lái)有望通過(guò)建立統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)或者統(tǒng)計(jì)模型對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行排序和優(yōu)化，排除正常微生物群和環(huán)境污染物的干擾，加之臨床醫(yī)生對(duì)患者自身情況和臨床表現(xiàn)的綜合分析來(lái)確定致病菌。同時(shí)，多數(shù)二代測(cè)序平臺(tái)完成從采樣到最終結(jié)果的分析需要24～72h(平均為48h)。而在檢測(cè)病毒感染的技術(shù)中，特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可在12h內(nèi)完成病毒的鑒定，二代測(cè)序技術(shù)尚不能達(dá)到這個(gè)速度。二代測(cè)序檢測(cè)感染性疾病病原體的費(fèi)用高于任何一種常規(guī)檢測(cè)手段，是其廣泛應(yīng)用于臨床的一大阻礙。但測(cè)序技術(shù)在樣本處理、工作流程建立、檢測(cè)時(shí)間和費(fèi)用設(shè)定等方面存在的不完善之處都是暫時(shí)的，會(huì)被迅速發(fā)展的技術(shù)所克服。隨著臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和評(píng)估的增多，二代測(cè)序技術(shù)在診斷膿毒癥方面的臨床應(yīng)用價(jià)值將進(jìn)一步提高。