上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化引起非小細(xì)胞肺癌耐藥的機(jī)制及中醫(yī)藥治療進(jìn)展*

夏盡力 鄧海濱

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤二科，上海 200032

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型的基本形態(tài)發(fā)生過(guò)程，其在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥中起到重要的作用。近年來(lái)，EMT在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)耐藥中的作用受到廣泛關(guān)注。許多EMT相關(guān)的信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子都被證實(shí)參與了NSCLC治療耐藥，靶向EMT也被認(rèn)為是克服耐藥的新機(jī)會(huì)。中醫(yī)藥在干預(yù)EMT引起的NSCLC耐藥中扮演了重要的角色，能夠通過(guò)抑制EMT的發(fā)生而延緩腫瘤耐藥，從而起到增效減毒的作用?，F(xiàn)本文就EMT引起NSCLC耐藥機(jī)制及中醫(yī)藥干預(yù)治療進(jìn)展進(jìn)行概述如下。

1 EMT及其相關(guān)信號(hào)調(diào)控

1.1 EMT概述

經(jīng)歷EMT后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、閉合蛋白(Occludin)等表達(dá)下降，并開(kāi)始表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)等，在大多數(shù)情況下，E-cadherin的丟失或表達(dá)降低是EMT的標(biāo)志。EMT并不是簡(jiǎn)單的從上皮到間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)換，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，EMT通常誘導(dǎo)上皮細(xì)胞處于混合的上皮-間充質(zhì)狀態(tài)，在各種內(nèi)源性和外源性信號(hào)的影響下，細(xì)胞可以變得更具間質(zhì)表現(xiàn)或恢復(fù)到更具上皮性的表型(間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化)，它被認(rèn)為與腫瘤干細(xì)胞表型和多重耐藥的發(fā)展有關(guān)[1]。EMT過(guò)程中基因表達(dá)的變化導(dǎo)致了大量的表型變化，如細(xì)胞形態(tài)變化、粘附喪失和獲得干細(xì)胞樣特征，從而導(dǎo)致了腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥。

1.2 EMT相關(guān)信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子

EMT涉及的信號(hào)通路十分復(fù)雜，目前有關(guān)具體機(jī)制尚未全部掌握。其中關(guān)鍵的信號(hào)通路包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、Wnt、Notch和Hedgehog等。在NSCLC中，TGF-β是研究重點(diǎn)。TGF-β通過(guò)Smad依賴(lài)途徑和非Smad依賴(lài)途徑介導(dǎo)EMT的發(fā)生。在Smad依賴(lài)途徑中，TGF-β配體在細(xì)胞表面結(jié)合的I型受體(ALK5)被II型受體磷酸化，這導(dǎo)致Smad2、Smad3磷酸化，并與Smad4形成復(fù)合物；TGF-β受體激活后，Smad復(fù)合物不僅能激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而且能提高轉(zhuǎn)錄因子的活性，如誘導(dǎo)Vimentin、Fibronectin等間充質(zhì)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致EMT的發(fā)生和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及治療耐藥。在非Smad依賴(lài)途徑中，TGF-β通過(guò)RHO-GTP酶、PI3K和MAPK等介導(dǎo)EMT的發(fā)生。其他信號(hào)通路，包括Notch，Wnt，Hedgehog，也參與在EMT中。這些信號(hào)通路導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄因子的激活，其中包括的SNAIL、E12/E47、TWIST1/TWIST2和ZEB1/ZEB2等已經(jīng)被確定為EMT的主要調(diào)控因子。還有一些新的EMT轉(zhuǎn)錄因子，如SOX和FOX轉(zhuǎn)錄因子[2-3]；這些轉(zhuǎn)錄因子是EMT的重要誘導(dǎo)者，在EMT的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。例如SNAIL(又稱(chēng)SNAIL1)和SLUG(又稱(chēng)SNAIL2)在胚胎發(fā)育、組織纖維化和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中可激活EMT過(guò)程，抑制上皮表型基因的表達(dá)；SNAIL既能參與抑制E-cadherin基因的表達(dá)，還可激活間質(zhì)表型基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)EMT的作用。TWIST1、TWIST2屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在EMT的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中亦具有關(guān)鍵作用。與SNAIL一樣，TWIST也可下調(diào)上皮表型基因的表達(dá)，并激活間質(zhì)表型基因的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中，TWIST1可通過(guò)組蛋白甲基化抑制E-cadherin的啟動(dòng)子、激活N-cadherin的啟動(dòng)子，從而抑制E-cadherin的表達(dá)，并誘導(dǎo)N-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生；與TWIST1相比，TWIST2具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)EMT的作用。其他轉(zhuǎn)錄因子，如ZEB1、ZEB2、FOX和SOX對(duì)EMT也具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用[4-7]。

2 NSCLC耐藥

目前，腫瘤的耐藥可分為固有性耐藥和獲得性耐藥。固有性耐藥是指腫瘤細(xì)胞初始便對(duì)藥物不敏感，其耐藥因子在治療前已經(jīng)產(chǎn)生；而獲得性耐藥是腫瘤細(xì)胞初始對(duì)藥物敏感，但經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)療程的治療，療效逐漸降低而產(chǎn)生不敏感的現(xiàn)象，其耐藥因子是在藥物治療過(guò)程中形成的；其耐藥機(jī)制廣泛且多樣，如藥物外排、EMT、腫瘤干細(xì)胞生成、藥物靶點(diǎn)突變等。很多耐藥因子都參與了腫瘤耐藥過(guò)程。如肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-related protein，LRP)可以介導(dǎo)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的細(xì)胞毒性藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，使細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低，誘導(dǎo)產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，尤其是對(duì)順鉑、阿霉素、足葉乙苷等化療藥物。磷酸化糖蛋白(phosphorylated glycoprotein，P-gp)由MDR1基因編碼，其耐藥性的產(chǎn)生是由于P-gp通過(guò)其疏水位點(diǎn)和疏水性與紫杉醇、蒽環(huán)類(lèi)等化療藥物結(jié)合，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞，從而表現(xiàn)為耐藥，P-gp高表達(dá)是導(dǎo)致MDR現(xiàn)象的重要依據(jù)。除P-gp、LRP蛋白外，肺癌的耐藥性還與MRP蛋白、GST和TOPOⅡ酶、凋亡基因Bcl-2、p53表達(dá)水平有關(guān)，與NF-kB、PI3K/Akt、PKC信號(hào)通路等也有關(guān)[8-10]。在NSCLC中，轉(zhuǎn)移和耐藥(包括化療和靶向治療)仍然是患者生存率低的重要原因[11]。在臨床上，化療和靶向治療已是成熟的癌癥治療方法，長(zhǎng)期以來(lái)它們被用作單一療法或與手術(shù)或放療相結(jié)合來(lái)治療腫瘤。然而，無(wú)論是經(jīng)典的細(xì)胞毒性藥物還是分子靶向藥物都面臨耐藥性的挑戰(zhàn)[12]。

3 EMT引起NSCLC耐藥的主要機(jī)制

EMT與腫瘤耐藥之間的關(guān)系雖然被研究了很久，但其具體的機(jī)制仍不清楚。在上皮性癌癥發(fā)生過(guò)程中，具有間充質(zhì)特征的細(xì)胞群體被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥有關(guān)。與上皮細(xì)胞相比，間充質(zhì)細(xì)胞往往對(duì)多種抗癌藥物具有更強(qiáng)的耐藥性[13]。其可能與EMT促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞生成、下調(diào)細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

3.1 EMT促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞生成引起耐藥

腫瘤干細(xì)胞(CSC)是假定為具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞亞群，是具有無(wú)限自我更新能力和分裂能力的類(lèi)干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，相同腫瘤中的CSC比缺乏“干性”的腫瘤細(xì)胞(即非CSC)在常規(guī)化療和靶向治療后對(duì)藥物的抵抗力更強(qiáng)，而CSC和非CSC之間的表型差異似乎主要?dú)w因于前者EMT程序的激活所引起的表觀遺傳學(xué)變化[14]。EMT還可以將循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)與CSC聯(lián)系起來(lái)，使這些具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞亞群能夠在外周循環(huán)中存活，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[15]。

接受EMT的腫瘤細(xì)胞可獲得干細(xì)胞樣屬性，從而促進(jìn)CSC的產(chǎn)生。EMT與CSC具有共同的關(guān)鍵信號(hào)通路和耐藥表型。通過(guò)激活Hedgehog、Notch和Wnt等途徑，CSC表現(xiàn)出自我更新的能力。TGF-β可誘導(dǎo)EMT的產(chǎn)生，進(jìn)而還可促進(jìn)CSC生成[16]。胡翹廷等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞株(PC-9)發(fā)生EMT后，CSC含量顯著增加；發(fā)生了EMT的吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞株(PC-9/AB)中CSC含量明顯高于PC-9細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT，PC-9/AB細(xì)胞中CSC含量降低，并且對(duì)吉非替尼的敏感性部分恢復(fù)。

3.2 EMT下調(diào)細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡

吉非替尼等EGFR-TKIs通常被用于NSCLC的治療，EGFR-TKI可以與EGFR的ATP位點(diǎn)結(jié)合，從而降低其活性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。然而，研究表明，間充質(zhì)表型比上皮表型對(duì)EGFR-TKI更具抵抗力，EMT不僅與最初的敏感性有關(guān)，而且與對(duì)EGFR-TKI的獲得性耐藥有關(guān)，E-cadherin的恢復(fù)可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性[18]。

與EMT相關(guān)的SLUG蛋白是SNAIL蛋白超家族成員之一，SLUG蛋白的表達(dá)在耐藥細(xì)胞模型中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，與吉非替尼敏感株(PC9)相比，吉非替尼耐藥株(PC9/gef)中SLUG蛋白表達(dá)顯著增加，從而阻止靶向藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。而SLUG蛋白表達(dá)下調(diào)不僅可以逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生，還可以恢復(fù)靶向藥物的敏感性。癌細(xì)胞凋亡與內(nèi)在的凋亡途徑有關(guān)，該途徑可分為抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白和BH3-only蛋白。經(jīng)吉非替尼處理后，BH3-only蛋白和抗凋亡蛋白均無(wú)明顯變化，而促凋亡蛋白Bim的3種亞型表達(dá)量均顯著提高，SLUG蛋白通過(guò)下調(diào)Bim來(lái)產(chǎn)生吉非替尼的耐藥性[19]。Notch通路也被報(bào)道與耐藥有關(guān)，Notch-1可以直接或間接的調(diào)控促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的存活。研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼耐藥株中Notch-1表達(dá)高度上調(diào)，Notch-1可以保護(hù)NSCLC細(xì)胞免受吉非替尼誘導(dǎo)的凋亡，沉默Notch-1的表達(dá)后逆轉(zhuǎn)了EMT的發(fā)生。Notch抑制劑DAPT可使吉非替尼耐藥株恢復(fù)對(duì)吉非替尼的再敏感，并在腫瘤生長(zhǎng)抑制方面產(chǎn)生了有效的反應(yīng)[20]。

4 中醫(yī)藥干預(yù)NSCLC耐藥的研究進(jìn)展

4.1 單味中藥在NSCLC耐藥的作用

中醫(yī)藥可廣泛應(yīng)用于NSCLC治療的各個(gè)階段，對(duì)NSCLC的治療作用不可忽視。研究表明，許多單味中藥和中藥復(fù)方可提高NSCLC對(duì)細(xì)胞毒性藥物和分子靶向藥物的療效。三七具有化瘀止血、活血定痛的作用，其有效成分為三七總皂苷。阮越勇等[21]發(fā)現(xiàn)在三七總皂苷干預(yù)下，經(jīng)歷過(guò)TGF-β1介導(dǎo)產(chǎn)生EMT的A549細(xì)胞E-cadherin增高，F(xiàn)ibronectin和Vimentin降低，提示三七總皂苷能使上皮細(xì)胞保持原來(lái)的特性，逆轉(zhuǎn)EMT并延緩靶向耐藥的發(fā)生。姜黃具有破血、行氣、通經(jīng)、止痛的作用，姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的化學(xué)成分。李優(yōu)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的NSCLC發(fā)生EMT，還可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。姜黃素能夠抑制E-cadherin的下調(diào)，顯著降低N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，且與姜黃素的濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。高寶安等[23]研究證明白花蛇舌草乙醇提取物使肺腺癌耐藥細(xì)胞株(A549/DDP)對(duì)順鉑的耐藥倍數(shù)下降近一半，對(duì)順鉑的敏感性增加近兩倍，并顯著降低多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)?？鄥⒕哂星鍩嵩餄?、利尿的功效。沈云飛等[24]發(fā)現(xiàn)，苦參可以降低吉非替尼誘導(dǎo)的NSCLC耐藥細(xì)胞(PC9/ZD)中Vimentin及N-cadherin的表達(dá)，增加E-cadherin表達(dá)，提示苦參可逆轉(zhuǎn)PC9/ZD細(xì)胞發(fā)生EMT和增加其對(duì)EGFR-TKIs的敏感性。

4.2 中藥復(fù)方在NSCLC耐藥的作用

較單味中藥而言，中藥復(fù)方防治或延緩NSCLC耐藥的發(fā)生效果更佳。羅楊等[25]研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼聯(lián)合除痰解毒方比單用吉非替尼效果更佳，能延緩靶向耐藥的發(fā)生，提示了除痰解毒方對(duì)NSCLC的治療具有協(xié)同增效的作用；而其逆轉(zhuǎn)NSCLC靶向耐藥的機(jī)制與升高E-cadherin，降低SNAIL和Vimentin，從而逆轉(zhuǎn)EMT有關(guān)。張敏等[26]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方益氣養(yǎng)陰解毒方能在不降低EGFR-TKI療效的前提下，減少皮疹、腹瀉等不良反應(yīng)的發(fā)生，明顯改善患者的生活質(zhì)量，其有效性及安全性均優(yōu)于單純EGFR-TKI組，并減少耐藥的產(chǎn)生，具有增效減毒的作用。汪一帆等[27]研究發(fā)現(xiàn)使用中藥抑肺飲后，Lewis肺癌中E-cadherin的表達(dá)量上升，且抑肺飲聯(lián)合順鉑組表達(dá)量最高；而Vimentin呈下調(diào)狀態(tài)，并在抑肺飲聯(lián)合順鉑組中最低。肺巖寧方主要由白術(shù)、生黃芪、干蟾皮、山慈菇、石見(jiàn)穿、黃精等益氣養(yǎng)精、抑癌解毒中藥組成，對(duì)NSCLC起攻補(bǔ)兼施之功效。趙曉珍等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)肺巖寧方治療后，EMT發(fā)生過(guò)程中的Vimentin雖無(wú)明顯改變，但Fibronectin和N-cadherin的表達(dá)顯著性下降；與EMT相關(guān)的TWIST、SNAIL在肺巖寧方聯(lián)合順鉑組表達(dá)顯著降低，E-cadherin顯著升高；提示了肺巖寧方可以逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生?？敌〖t等[30]研究結(jié)果顯示，肺巖寧方聯(lián)合靶向藥物治療晚期肺腺癌的中位疾病進(jìn)展時(shí)間明顯優(yōu)于單用靶向藥物治療組，提示肺巖寧方具有一定的延緩或防治EGFR-TKIs耐藥的作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI耐藥的細(xì)胞株上皮出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型，證實(shí)了EMT的發(fā)生，提示肺巖寧方延緩耐藥的機(jī)制與EMT有關(guān)。

5 問(wèn)題與展望

EMT在NSCLC治療耐藥起到了重要的作用。然而，引起NSCLC耐藥的機(jī)制比較復(fù)雜，EMT并不是唯一的因素，且現(xiàn)代研究也沒(méi)有闡明EMT引起NSCLC多重耐藥的具體機(jī)制。因此有待進(jìn)一步圍繞EMT相關(guān)信號(hào)通路、基因水平等展開(kāi)更加深入的研究。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療NSCLC的方法已經(jīng)相當(dāng)成熟，但容易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用較多，對(duì)身體的損傷也較大。中醫(yī)藥減小腫瘤體積的能力雖不如現(xiàn)代醫(yī)藥，但現(xiàn)代醫(yī)藥聯(lián)合中醫(yī)藥可以有效逆轉(zhuǎn)EMT引起的NSCLC治療耐藥問(wèn)題，達(dá)到事半功倍的效果；同時(shí)，還可以極大地減少現(xiàn)代藥物帶來(lái)的皮疹、腹瀉等毒副作用?？梢?jiàn)，中西醫(yī)結(jié)合治療NSCLC將為干預(yù)EMT途徑引起的NSCLC治療耐藥提供新思路。