骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響因素：供體年齡和體外擴(kuò)增

田小榮，宋紅麗（. 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009 ；. 天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津3009）

1970 年，F(xiàn)riedenstein 教授第一次從骨髓中分離出具有在體外以克隆集落形式快速生長(zhǎng)能力的貼壁的成纖維樣細(xì)胞［1］。1991 年，Caplan 提出“間充質(zhì)干細(xì)胞”這個(gè)術(shù)語(yǔ)［2］。而2006 年，國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)才正式提出了定義人類間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的基本標(biāo)準(zhǔn)：① 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，必須具有塑料黏附性；② 表面分子CD73、CD90 和CD105 陽(yáng)性；并缺乏表面分子CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α 或CD19 和HLA-DR；③ 在體外具有分化為成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的能力［3］。其被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、移植學(xué)等領(lǐng)域，用于治療移植物抗宿主病、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、肝臟移植、肌腱愈合等多種疾病。MSCs 可以來(lái)源于骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶等多種組織。骨髓是第一個(gè)分離出MSCs 的組織［1］，與臍帶源性MSCs 和脂肪組織源性MSCs 相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有更高的移植物移植率［4-6］。BMMSCs 的分離技術(shù)以及研究較為成熟，故本篇綜述主要闡述對(duì)象為BMMSCs。BMMSCs 生物學(xué)特性包括其形態(tài)學(xué)、免疫表型、增殖能力、多向分化潛能及免疫調(diào)節(jié)能力等，選擇什么狀態(tài)的BMMSCs 在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上能最大程度地發(fā)揮其特性成為人們關(guān)注的問(wèn)題。研究表明，衰老會(huì)影響細(xì)胞的生物學(xué)特性，骨髓中所含的MSCs 數(shù)量極低，約為0.001% ～ 0.01%［7］，獲得足量的BMMSCs，體外擴(kuò)增是必不可少的。供體的年齡、BMMSCs 連續(xù)體外擴(kuò)增均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的衰老，使其生物學(xué)特性發(fā)生變化，進(jìn)而影響其應(yīng)用。

1 供體年齡和體外擴(kuò)增對(duì)BMMSCs 生物學(xué)特性的影響

1.1 供體年齡和體外擴(kuò)增對(duì)BMMSCs 細(xì)胞形態(tài)、衰老標(biāo)志物、細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞周期、增殖能力的影響：當(dāng)BMMSCs 衰老時(shí)，其形態(tài)、表型、細(xì)胞周期、增殖能力等都會(huì)發(fā)生變化。從骨髓中分離出來(lái)的MSCs 的生物學(xué)特性與供者的年齡密切相關(guān)。在老年個(gè)體中發(fā)現(xiàn)BMMSCs 數(shù)量和功能隨年齡而下降［8］。衰老供體相比于年輕供體來(lái)源的BMMSCs，其形態(tài)扁平、增大，胞質(zhì)顆粒狀［9］。Ma 等［10］觀察到老年（16 月齡）小鼠比年輕（3 月齡）小鼠來(lái)源的BMMSCs 的衰老相關(guān)的β 半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量更多，p53、p21 和p16 在蛋白水平上也顯著升高。Chen 等［11］觀察到隨著年齡的增長(zhǎng)（15 ～ 85 歲），人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow MSCs，hBMSCs）SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞周期分布阻滯在G0/G1 期, S 期所占比例隨著年齡的增長(zhǎng)而減少。隨著年齡的增長(zhǎng)BMMSCs 的增殖能力也會(huì)下降［11］。

BMMSCs 體外連續(xù)擴(kuò)增會(huì)發(fā)生衰老［9］。Izadpanah 等［12］研究表明，在早期傳代中，hBMSC的細(xì)胞增殖率約為48 h。在第10 代（10 passages，P10）后，細(xì)胞的增殖效率穩(wěn)步下降。至少在P10之前hBMSC 保留了其高水平的端粒酶活性和長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度。hBMSCs 在P15 顯示出擴(kuò)大、扁平的細(xì)胞形態(tài)，此后他們停止進(jìn)行細(xì)胞分裂，但仍保持存活。在P20， hBMSCs 經(jīng)歷了周期阻滯，端粒酶活性顯著降低。大鼠的BMMSCs 成纖維細(xì)胞樣形態(tài)維持了7 ～ 10 代。漸漸地，衰老細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，凋亡率增加，最終失去對(duì)底物的黏附［13］。hBMSCs早期傳代的表面抗原檢測(cè)水平比晚期傳代要高得多，如CD146+的細(xì)胞數(shù)量隨著體外擴(kuò)增而下降［9］。大鼠BMMSCs 連續(xù)傳代后細(xì)胞的表面抗原如CD90、CD44 和CD29 表達(dá)水平逐漸降低（P3 ＞P6 ＞P9）［13］。這些結(jié)果表明，BMMSCs 的誘導(dǎo)能力降低了。在hBMSCs P4、P7 和P14 中，SA -β- gal 活性逐漸增高，而端粒長(zhǎng)度逐漸減少，表明hBMSCs 在傳代過(guò)程中衰老細(xì)胞的比例逐漸增加［14］。有研究表明大鼠BMMSCs P2 至P4 的BMMSCs 增殖潛能最高［13］。Konala 等［15］觀察到hBMSC 晚期傳代（P9）比早期傳代（P3）克隆集落形成單位數(shù)目降低，即增殖能力下降。P9 比P3 的G0/G1 期的細(xì)胞比例略有下降而SA -β- gal 陽(yáng)性的細(xì)胞比例增加，說(shuō)明衰老細(xì)胞的百分比隨著傳代次數(shù)的增加而增加。這些結(jié)果證實(shí)了晚期傳代的BMMSCs 活躍性和增殖能力下降。

1.2 供體年齡和體外擴(kuò)增對(duì)BMMSCs 分化潛能的影響：隨著供體年齡增長(zhǎng)，BMMSCs 向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化的能力越低，向成脂細(xì)胞分化的能力越強(qiáng)。老年小鼠來(lái)源的BMMSCs 比年輕小鼠來(lái)源的BMMSCs 成骨、成軟骨能力降低，而成脂能力增強(qiáng)［10，16］。但有研究也發(fā)現(xiàn)來(lái)自老年供體小鼠的BMMSCs 成脂潛能下降［16］。這與多數(shù)文獻(xiàn)結(jié)果不同，可能與供體、實(shí)驗(yàn)室條件、培養(yǎng)方法等不同有關(guān)。Li 等［13］發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)2、6 和12 周齡，以及10 月齡SD 大鼠的BMMSCs 成骨分化，2 周齡組BMMSCs礦化結(jié)節(jié)明顯，骨鈣素濃度顯著高于其他各組，但與6 周齡組骨鈣素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10 月齡組BMMSCs 骨含量明顯減少，礦化結(jié)節(jié)明顯減少，其骨鈣素整體水平明顯低于其他各組。2 周齡和6 周齡供體SD 大鼠的細(xì)胞顯示出明顯增加的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，這與12 周齡和10 月齡動(dòng)物的細(xì)胞相比，與骨含量增加和礦化結(jié)節(jié)強(qiáng)陽(yáng)性染色相一致。10 月齡供體的BMMSCs 的ALP 活性最低，骨含量和礦化結(jié)節(jié)形成減少，表明這些細(xì)胞喪失了成骨分化能力。

Kara?z 等［17］對(duì)大鼠BMMSCs 的P3、P50、P100進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在傳代后期，成脂標(biāo)志物——重組人過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 的表達(dá)顯著降低，這表明在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中大鼠BMMSCs 的成脂分化能力降低。BMP-2、Coll1、Coll2、骨連接素、骨鈣素和Runx2、神經(jīng)標(biāo)記物TUBB3 水平、軟骨形成標(biāo)記物SOX9 水平在長(zhǎng)期傳代中均被檢測(cè)到降低，有些指標(biāo)在P100 中降低最為明顯。hBMSCs 在早期傳代中，成骨分化的菌落比例為50%～65 %。然而，這一頻率在P30 時(shí)下降至30% ～ 35%。在P10及以上培養(yǎng)時(shí)，hBMSCs 的脂肪生成頻率顯著降低。隨著傳代數(shù)的增加，成脂肪分化的集落占整個(gè)細(xì)胞群的比例下降。hBMSCs 在P1 均表現(xiàn)出向軟骨細(xì)胞分化的潛能。在P5 及更高代時(shí)，hBMSCs 迅速喪失了軟骨分化潛能［18］，而有研究則表明hBMSCs 至少在P10 之前保留了其多譜系分化的潛能［12］。大鼠BMMSCs體外培養(yǎng)時(shí)P3與P7均具有成骨、成脂能力，但是P7 的分化潛能比P3 小，到P9 時(shí)可能已失去多向分化潛能［19］。

1.3 供體年齡和體外擴(kuò)增對(duì)BMMSCs 免疫調(diào)節(jié)的影響：BMMSCs 對(duì)T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞、DC 細(xì)胞的增殖均有調(diào)節(jié)作用［20-23］。其免疫抑制功能通過(guò)Notch 信號(hào)和HLA-G 等介導(dǎo)與免疫細(xì)胞直接接觸，或通過(guò)分泌白介素-10（interleukin-10，IL-10）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-6、前列腺素E2、吲哚胺2，3 -雙加氧酶等相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。

BMMSCs 可抑制T 細(xì)胞的激活和增殖。與T 細(xì)胞共培養(yǎng)后BMMSCs 的IL-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）基因表達(dá)顯著增強(qiáng)。BMMSCs 抑制T 細(xì)胞可通過(guò)接觸依賴誘導(dǎo)T 細(xì)胞抑制特性的調(diào)節(jié)性抗原提呈細(xì)胞間接抑制T細(xì)胞［24］、通過(guò)HLA 作用于原發(fā)性和繼發(fā)性反應(yīng)及外泌體作用抑制T 細(xì)胞［22］。

BMMCs 抑制脂多糖活化的B 淋巴細(xì)胞增殖并抑制活化的B 淋巴細(xì)胞分泌IgG、IgM 和IgA。但BMMCs 不能誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞凋亡［25-26］。

BMMSCs 抑制DC 分化過(guò)程中CD1a、CD40、CD80、CD86 和HLA-DR 的上調(diào)，并阻止DC 成熟過(guò)程中CD40、CD86 和CD83 表達(dá)的增加。BMMSCs上清液對(duì)DC 的分化沒(méi)有影響，但在成熟過(guò)程中抑制了CD83 的上調(diào)。BMMSCs 及其上清液均干擾了DC 的內(nèi)吞作用，降低了其分泌IL-12 和激活異反應(yīng)性T 細(xì)胞的能力［23，27］。在接觸和Transwell 系統(tǒng)中，BMMSCs 抑制NK 細(xì)胞增殖，也抑制NK 細(xì)胞分泌γ-干擾素（interferoninterferon，IFN-γ）、IL-10、以及TNF-α，但不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［28］。

來(lái)自老年供體的BMMSCs 抑制T 細(xì)胞增殖的能力降低，而Siegel 等［29］分析了53 例年齡在13 ～80 歲的捐贈(zèng)者，結(jié)果表明年齡和T 細(xì)胞抑制能力之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，這與供者年齡對(duì)BMMSCs 抑制T 細(xì)胞增殖有負(fù)面影響的論斷相矛盾［30］。

BMMSCs 在所有傳代中均高分泌TGF-β1，IL-4 水平略有升高，但不顯著； P6 中IL-6 水平比P4 明顯升高。隨著不斷的傳代，腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6、HLA-G 的表達(dá)均降低。半乳糖凝集素-1 和半乳糖凝集素-3 的表達(dá)均增加。在所有傳代中，TNF-α、IFN-γ、IL-1β 和IL-4 的水平都很低，IL-10 水平相似，TGF-β1 水平都很高［29］。El-Sayed 等［32］對(duì)小鼠來(lái)源的BMMSCs 研究表明，BMMSCs 抑制CD8 的表達(dá)。與早期傳代的BMMSCs（P1）相比，晚期傳代的BMMSCs（P6）釋放的TGF-β 較少。然而，在早期和晚期傳代的BMMSCs中，IL-6 的表達(dá)水平相當(dāng)。其他研究也表明，臍帶MSCs 隨體外擴(kuò)增代數(shù)增加而逐漸衰老，但免疫抑制能力逐漸加強(qiáng)［33］,也有研究表明BMMSCs 隨體外擴(kuò)增代數(shù)增加其免疫抑制能力降低［34］。

1.4 推薦使用的供體年齡及體外擴(kuò)增代數(shù)：供體年齡的增長(zhǎng)限制BMMSCs 更好地應(yīng)用，根據(jù)前面所述在選擇供體來(lái)源時(shí)盡量選擇年輕的供體。綜合BMMSCs 不同生物學(xué)特點(diǎn)的分析，我們建議最好選6 周齡之內(nèi)的鼠類作為BMMSCs 的供體來(lái)源；于hBMSCs 而言則盡量選擇成年之前的供體作為BMMSCs 的來(lái)源。

連續(xù)體外擴(kuò)增，BMMSCs 會(huì)發(fā)生衰老，進(jìn)而影響其形態(tài)、增殖能力、分化潛能、免疫調(diào)節(jié)等特性，所以選擇合適傳代數(shù)是非常重要的。對(duì)于hBMSCs，我們建議選擇P2-P6 或P8 的BMMSCs［35-36］；而鼠源性的BMMSCs，我們建議選擇P2-P6 的BMMSCs。但是關(guān)于MSCs 是否在傳代過(guò)程中保持免疫調(diào)節(jié)特性的信息較少［31］，如何平衡其他生物學(xué)特性與免疫調(diào)節(jié)特性進(jìn)而選擇合適的傳代數(shù)仍有待進(jìn)一步研究。

2 抗BMMSCs 衰老方法初探尋

BMMSCs 的應(yīng)用廣泛，但是其衰老問(wèn)題成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。如何延緩或者改善BMMSCs 衰老也成為了這些年研究的熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子，是一種促炎細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)年齡相關(guān)信號(hào)通路。其通過(guò)與CD74 相互作用，進(jìn)而激活A(yù)MPKFOXO3a 信號(hào)通路，使BMMSCs 從年齡誘導(dǎo)的衰老狀態(tài)恢復(fù)活力［37］。褪黑激素對(duì)P1、P4 BMMSCs 的集落形成、增殖和成骨分化沒(méi)有影響，但在很大程度上阻止了P15 BMMSCs 的自我更新和分化能力的下降。褪黑素通過(guò)激活抗氧化防御系統(tǒng)，抑制細(xì)胞衰老途徑，保留控制干細(xì)胞特性基因的表達(dá)，能有效地預(yù)防BMMSCs 長(zhǎng)期傳代后的功能障礙和治療失?。?8］。Fei 等［39］研究表明，老年BMMSCs 乙?；胶蚄AT6A 表達(dá)降低，下調(diào)KAT6A 導(dǎo)致老年BMMSCs 增殖、集落形成和成骨分化減少。發(fā)現(xiàn)KAT6A 可以調(diào)節(jié)Nrf2/ARE 信號(hào)通路，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中活性氧的積累，從而促進(jìn)老年BMMSCs 增殖、集落形成、成骨及成骨分化。

研究者們從細(xì)胞因子、作用因素及信號(hào)通路等多個(gè)方面探尋抗BMMSCs 衰老的方法，其仍有待于我們進(jìn)一步探索，這將非常有利于BMMSCs 的治療和研究應(yīng)用。

3 結(jié) 語(yǔ)

隨著供體年齡及體外擴(kuò)增代數(shù)的增加，BMMSCs的形態(tài)、分化能力、增殖速度和免疫調(diào)節(jié)特性等生物學(xué)特性均發(fā)生了變化，BMMSCs 的衰老限制了其在治療及研究方面的應(yīng)用。所以選擇合適的供體及適合的體外擴(kuò)增代數(shù)是非常必要的。為了延緩或逆轉(zhuǎn)BMMSCs 的衰老，探尋抗衰老的方法成為新的研究方向。