細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制研究

王 銳，付 萍

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，云南 昆明 650000）

細(xì)胞死亡組成機(jī)體免疫應(yīng)答的重要部分，是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，可以幫助機(jī)體清除內(nèi)源性和外源性傷害，從而維持組織正常機(jī)能和形態(tài)。細(xì)胞死亡的形成和機(jī)制是多種多樣的，研究者已經(jīng)逐漸發(fā)現(xiàn)了各種細(xì)胞死亡模式，例如凋亡，壞死，自噬，脹亡和焦亡[1]。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種由半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡。它的特征在于細(xì)胞腫脹和破裂，細(xì)胞內(nèi)含物的釋放以及強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡和各種疾病密切相關(guān)。本文綜述了細(xì)胞焦亡的定義、形態(tài)特征、分子機(jī)制，以探討細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制，為治療細(xì)胞焦亡的相關(guān)疾病提供新途徑。

1 細(xì)胞焦亡的定義

細(xì)胞焦亡是近年發(fā)現(xiàn)并被證實(shí)的一種伴隨炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡方式，與其他死亡方式不同，主要通過識(shí)別微生物和各種內(nèi)源性危險(xiǎn)刺激，炎性caspase-1/4/5/11 被激活，GSDMD 裂解，膜上形成孔隙，細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜破裂，伴隨釋放大量炎癥因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的過程[2，3]。Chen Y 等[4]首次報(bào)道了存在著caspase-1 依賴性細(xì)胞死亡方式。1999 年對(duì)沙門桿菌感染的巨噬細(xì)胞的研究也表明[5]，活化的caspase-1 可導(dǎo)致一種促炎癥形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，釋放大量促炎因子，與caspase-3、caspase-6、caspase-7 的激活無(wú)關(guān)；接下來(lái)，在被李斯特菌、嗜肺軍團(tuán)菌、假結(jié)核耶爾森菌、銅綠假單胞菌等多種病原體感染的巨噬細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)這種依賴caspase-1 的細(xì)胞死亡方式[3]。caspase-1 通過激活白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的前體，促進(jìn)IL-1β、IL-18 成熟并產(chǎn)生活性，IL-1β 成熟后參與免疫反應(yīng)，發(fā)揮促炎癥介質(zhì)作用，將固有免疫細(xì)胞召募到感染部位和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫細(xì)胞，而IL-18 成熟后對(duì)于產(chǎn)生干擾素-γ 和增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和T 細(xì)胞的溶解活性非常關(guān)鍵[6]。焦亡與凋亡之間的區(qū)別之一是誘發(fā)炎癥，并且焦亡與凋亡和壞死等其他細(xì)胞死亡方式在形態(tài)、機(jī)制和病理生理上也有顯著不同。Pyroptosis 一詞最早由Brennan MA 等[7]在2001 年提出，來(lái)定義這種獨(dú)特的伴隨促炎介質(zhì)釋放的細(xì)胞死亡方式。

2 細(xì)胞焦亡的特征

常見的細(xì)胞死亡分為凋亡和壞死。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡過程，而不將細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，可有效抑制炎癥。壞死由環(huán)境破壞引起，是細(xì)胞的被動(dòng)和意外死亡，并導(dǎo)致炎性細(xì)胞內(nèi)容物不受控制的釋放。細(xì)胞焦亡像細(xì)胞凋亡一樣，它使細(xì)胞自殺，但是兩者又具備顯著的不同[8]：發(fā)生細(xì)胞凋亡的是未被病毒和細(xì)菌感染的正常細(xì)胞，而發(fā)生細(xì)胞焦亡的是那些被病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞；從形態(tài)學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，細(xì)胞焦亡的明顯特征是胞膜完整性的破壞，胞內(nèi)容物的流出，類似于壞死，但與細(xì)胞凋亡不一樣，凋亡維持完整的細(xì)胞膜，胞質(zhì)不會(huì)外流；形成凋亡與焦亡的機(jī)制也不同，胞膜內(nèi)陷包裹胞內(nèi)容物，形成凋亡小體，細(xì)胞腫脹、胞膜受力不均造成焦亡[8，9]。隨著焦亡細(xì)胞膨脹，細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)DNA 斷裂，TUNEL 染色顯示出陽(yáng)性，這與壞死和凋亡相同。但是細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞膜上會(huì)形成小孔，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性破壞，膜內(nèi)外的離子失去平衡，細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，水從孔隙中流入，細(xì)胞發(fā)生腫脹，細(xì)胞膜破裂，同時(shí)大量促炎因子，如IL-1β和IL-18 等細(xì)胞內(nèi)容物大量滲出，使周圍更多的炎癥細(xì)胞募集，導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)誘發(fā)[1]。發(fā)生焦亡的細(xì)胞膜迅速的破裂，伴隨釋放細(xì)胞內(nèi)容物和促炎介質(zhì)，明顯不同于凋亡及壞死。簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞焦亡是凋亡和壞死結(jié)合的一種新型細(xì)胞死亡方式。

3 細(xì)胞焦亡通路中的主要蛋白

3.1 炎性小體 炎性小體是一種多聚蛋白復(fù)合物，迄今為止，已有NOD 樣受體（NLRs），如NLRP1、NLRP3、NLRC4，AIM2 樣受體（ALR）和TRIM 家族成員Pyrin 等主要成員，在炎癥反應(yīng)發(fā)生和維持中起關(guān)鍵作用[10]。在這些炎性體，NLRP3 炎性體被廣泛研究，因?yàn)镹LRP3 炎性體失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致先天和獲得性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展[11，12]。NLRP3 屬于NLR 蛋白家族，廣泛存在于多種免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞中，在人類中包括22 個(gè)成員，在小鼠中至少有34 個(gè)成員?；罨螅琋LRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）及caspase-1 前體會(huì)聚集成一種多聚蛋白，稱為NLRP3 炎性小體。主要包含3 部分：羧基端含有亮氨酸重復(fù)序列，中段為核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域，氨基端為caspase 激活和募集域（CARD）或熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）；C 端被認(rèn)為與識(shí)別刺激有關(guān)，用于配體感應(yīng)和自身調(diào)節(jié)，中段是炎性體的核心部分，介導(dǎo)NLR寡聚化，N 端介導(dǎo)下游蛋白-蛋白質(zhì)相互作用[13，14]。信號(hào)傳輸由PYD 和CARD 組成的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）適配器銜接[15]。多種刺激物作為病原體相關(guān)分子模式和危險(xiǎn)相關(guān)信號(hào)模式，使NLRP3 與ASC結(jié)合，招募無(wú)活性的前體caspase-1 形成NLRP3 炎性體，使caspase-1 活化，誘導(dǎo)促炎因子釋放，發(fā)生細(xì)胞焦亡[16]。NLRP3 炎性體能被一系列激動(dòng)劑激活，包括ATP、細(xì)菌毒素、微生物產(chǎn)物、核酸、透明質(zhì)酸，以及真菌、細(xì)菌和病毒病原體[17]。隨后研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)微生物刺激物，如Toll 樣受體（TLR）配體和胞壁酰二肽，不是直接激活NLRP3 炎性體，而是通過結(jié)合引發(fā)NLRP3 炎性體激活[18]。NLRP1 炎癥小體只能識(shí)別炭疽致死毒素和胞壁酰二肽。NLRC4 炎癥小體僅由鞭毛蛋白和細(xì)胞壁酰二肽等PAMPs 激活。AIM2 屬于具有200 個(gè)氨基酸重復(fù)序列（HIN-200）的造血干擾素誘導(dǎo)性核蛋白[19]。ALR 家族的成員是I型IFN 誘導(dǎo)型蛋白，并且ALR 家族基因的數(shù)量在物種之間有所不同。人類中有4 個(gè)ALR 家族基因（AIM2，IFI16，PYHIN1 和MNDA），小鼠中有13 個(gè)基因（包括AIM2 和IFI202）[20]。AIM2 最初是從人黑素瘤細(xì)胞中分離出來(lái)的[19]。人AIM2 由1 個(gè)HIN-200域的C 端和1 個(gè)PYD 的N 端組成。正常情況下，AIM2 的pyrin 和HIN-200 結(jié)構(gòu)域形成分子內(nèi)復(fù)合物并保持自抑制狀態(tài)。感染后，C 末端的HIN-200 結(jié)構(gòu)域與雙鏈DNA 直接結(jié)合。AIM2 通過PYD 與ASC進(jìn)行連接。在AIM2 的C 端HIN-200 結(jié)構(gòu)域中存在兩個(gè)相鄰的寡核苷酸/寡糖的結(jié)合[21]。AIM2 在細(xì)胞焦亡中的主要作用是識(shí)別病原體釋放的雙鏈DNA，然后與ASC 和Pro-caspase-1 組裝形成AIM2 炎性體。AIM2 沿著DNA 的長(zhǎng)鏈寡聚化，幫助宿主防御細(xì)菌和病毒病原體[22]。AIM2 不僅識(shí)別由細(xì)菌破裂釋放的DNA，而且識(shí)別由病原體宿主細(xì)胞釋放的DNA。因此，AIM2 對(duì)外源DNA 和內(nèi)源DNA 都有反應(yīng)[23]。炎性小體與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，雖然目前研究很多，但其詳細(xì)的活化機(jī)制仍不清楚。

3.2 Caspase 家族 炎性半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）是一類進(jìn)化相對(duì)保守的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶家族，主要參與細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)。Caspases 不參與其他程序性細(xì)胞死亡，只在啟動(dòng)細(xì)胞凋亡和焦亡中起重要作用[15]，參與細(xì)胞凋亡的半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase-2/3/6/7/8/9/10）相關(guān)研究較多，caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者；而人鼠共有的caspase-1（人類caspase-4/5 及鼠類caspase-11）近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)是一類炎癥性caspase，與細(xì)胞焦亡有關(guān)。炎性小體通過各種內(nèi)源性和外源性信號(hào)刺激激活caspase，活化的caspase 可快速形成直徑為1.1～2.4 nm 的質(zhì)膜孔，乳酸脫氫酶等胞內(nèi)物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)流出，細(xì)胞滲透壓改變從而腫脹破裂，細(xì)胞膜完整性的喪失使炎癥介質(zhì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境，進(jìn)而放大局部和全身炎癥反應(yīng)，這是細(xì)胞焦亡發(fā)生的主要機(jī)制[24]。有研究顯示[3]，多蛋白復(fù)合物炎性小體介導(dǎo)caspase-1 的活化，炎性小體活化后，將caspase-1 前體分別裂解成為p10、p20 兩個(gè)亞單位，caspase-1 p20 介導(dǎo)前體IL-1β 和IL-18 的成熟，成熟的IL-1β 和IL-18 分泌到胞外，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[25]。雖然caspase 家族的成員在氨基酸結(jié)構(gòu)和序列上相似，但其生理作用上卻有很大差別，參與細(xì)胞焦亡的主要是caspase-1/4/5/11。

3.3 執(zhí)行蛋白GSDMD GSDMD 是一種含有Gasdermin 結(jié)構(gòu)域的打孔蛋白，大小約為53 ku。GSDMD 不能被凋亡相關(guān)的caspase3/7/8 切割，而炎性caspase1/4/5/11 能促進(jìn)GSDMD 的激活和N 端裂解釋放。未受刺激時(shí)，其活性功能因C 端與N 端結(jié)合而被抑制，因此全長(zhǎng)GSDMD 是不活躍的。GSDMD 被活化后的炎性caspase 切割后，形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，22 ku 的C 端和31 ku 的N 端[26]?；罨蟮腉SDMD-N端片段易位至細(xì)胞膜，通過特異性結(jié)合細(xì)胞膜上磷酸化磷脂酰肌醇，發(fā)生寡聚化，在細(xì)胞膜上打孔，形成孔道，可以允許IL-1β 和IL-18 以及其他細(xì)胞內(nèi)容物通過該孔道，滲透壓改變，促進(jìn)水分內(nèi)流，引起局部細(xì)胞腫脹，使細(xì)胞膜裂解[27]，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。由此可知，只有N 端被激活后才能發(fā)生細(xì)胞焦亡。有文獻(xiàn)報(bào)道[28]，GSDMA3 和GSDMA 的N 端與GSDMD 的N 端相似，同樣可以結(jié)合脂質(zhì)，參與孔隙形成，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜完整性。這可能提示Gasdermin 家族的蛋白有相似的成孔活性從而執(zhí)行細(xì)胞焦亡，將來(lái)可以定義為Gasdermin 介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡[29]。GSDMD 是導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白，也是主要執(zhí)行者，通過活化后的N 端在細(xì)胞膜上打孔引發(fā)細(xì)胞焦亡。

4 細(xì)胞焦亡的信號(hào)機(jī)制

根據(jù)細(xì)胞受到的刺激不同可誘發(fā)的不同的細(xì)胞焦亡途徑，人和鼠都存在經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑這兩種方式的細(xì)胞焦亡，經(jīng)典炎性小體途徑依賴于caspase-1 的活化，非經(jīng)典炎性小體途徑是由于小鼠caspase-11 活化以及人類的caspase-4 和caspase-5活化引起的[15]。序列分析表明，人caspase-1 和鼠caspase-1 是直系同源物，而人caspase-4 和5 起源于小鼠caspase-11，因此，鼠caspase-11 與人類細(xì)胞中的caspase-4 和caspase-5 有同樣的功能。細(xì)胞焦亡中的炎癥性caspase 被炎性體激活。經(jīng)典途徑中，一系列微生物刺激和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)被不同的細(xì)胞質(zhì)傳感器蛋白檢測(cè)到，這些蛋白通過銜接蛋白招募前caspase-1 單體，并通過二聚體活化caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[30]。非經(jīng)典途徑中，細(xì)菌脂多糖可以直接被caspase-4，caspase-5 和caspase-11 識(shí)別[31]，結(jié)合后可以觸發(fā)caspase-11 的寡聚化和活化，切割GSDMD，GSDMD-N 結(jié)構(gòu)域在脂質(zhì)膜上形成孔并通過細(xì)胞膜破壞引發(fā)細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展。但脂多糖如何特異性結(jié)合caspase-11，人caspase-4 和caspase-5 的CARD 結(jié)構(gòu)域，而不是其他caspase 的CARD 結(jié)構(gòu)域目前尚不清楚。

5 總結(jié)

細(xì)胞焦亡是一種依賴炎性caspase 的細(xì)胞死亡類型，其特征是膜孔形成、細(xì)胞腫脹、質(zhì)膜破裂和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放。caspase-1/4/5/11 參與細(xì)胞焦亡，并被各種入侵病原體和內(nèi)源性刺激等特異性炎性小體激活。炎性小體直接激活caspase-1，caspase-1 裂解GSDMD 并激活proIL-1β 和proIL-18，通過經(jīng)典細(xì)胞焦亡信號(hào)途徑將IL-1β 和IL-18 從細(xì)胞質(zhì)分泌到外界環(huán)境。在非經(jīng)典途徑中，caspase-11/4/5 識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌脂多糖，導(dǎo)致GSDMD 裂解和炎性物質(zhì)釋放，引發(fā)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡廣泛參與到各種疾病中，且發(fā)揮重要作用。細(xì)胞焦亡是一把雙刃劍，適度的細(xì)胞焦亡有助于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，可以有效防止細(xì)胞過度增殖，從而保護(hù)宿主。但是在某些條件下激活過度，不僅不能控制炎癥反應(yīng)，反而引起相關(guān)疾病，甚至威脅到生命。目前針對(duì)細(xì)胞焦亡的研究有限，還需要深入探索許多機(jī)制。所以，加深了解細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制可以幫助我們解釋其在疾病中的作用以及如何將這些機(jī)制轉(zhuǎn)化為治療產(chǎn)生長(zhǎng)期影響。