軟骨細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨肥大分化的調(diào)控機(jī)制及策略

靳澤怡 丁彩琳 于睿 閆繼紅

作者單位： 100069 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院長學(xué)制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)(靳澤怡)；100045首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(丁彩琳)；100069首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)系組織胚胎學(xué)教研室(于睿、閆繼紅)

軟骨肥大分化是應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem,MSCs)治療軟骨損傷修復(fù)的面臨的一個難題。軟骨肥大分化在骨關(guān)節(jié)炎中也經(jīng)常會出現(xiàn)。如何抑制軟骨肥大是應(yīng)用MSCs進(jìn)行軟骨修復(fù)以及治療骨關(guān)節(jié)炎亟待解決的問題。MSCs是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，能夠在體內(nèi)或體外分化成多種細(xì)胞，包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種功能性細(xì)胞。在MSCs向軟骨分化過程中，首先是MSCs聚集，依次分化為前軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；后期分化為肥大軟骨細(xì)胞分泌CollagenX膠原。這對維持穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞表型是不利的[1]?，F(xiàn)對軟骨細(xì)胞肥大分化以及間充質(zhì)干細(xì)胞來源的軟骨細(xì)胞肥大分化進(jìn)行概述并提出防止MSCs成軟骨肥大分化有關(guān)策略。

一、調(diào)控機(jī)制

1.WNT信號通路：WNT信號通路是進(jìn)化上高度保守的信號通路，在胚胎發(fā)育、維持穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育以及一系列疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有決定性作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種不同的細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)通路，包括經(jīng)典WNT/β-連環(huán)蛋白通路、c-Jun N-末端激酶(c-jun kinase enzyme,JNK)通路和WNT/Ca2+通路。該信號通路在在不同的分化時期，即有刺激軟骨細(xì)胞肥大的功能，也有成軟骨分化的功能；即在成軟骨分化的早期，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路可促進(jìn)軟骨形成；而在成軟骨分化的晚期，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在促進(jìn)軟骨形成的同時進(jìn)一步加速軟骨細(xì)胞的肥大與成熟[2]。(1)經(jīng)典WNT/β-連環(huán)蛋白通路：經(jīng)典WNT/β-連環(huán)蛋白通路由聚積在細(xì)胞核的β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)，與軟骨細(xì)胞肥大密切相關(guān)。當(dāng)WNT信號未激活時，酪氨酸激酶1(casein kinase-1,CK-1)能將β-連環(huán)蛋白磷酸化。隨后軸蛋白(axin)使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)靠攏β-連環(huán)蛋白，并將β-連環(huán)蛋白磷酸化；最終GSK-3β、CK-1、β-連環(huán)蛋白和多發(fā)性結(jié)腸腺瘤(APC)蛋白結(jié)合在一起構(gòu)成β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合物。β-連環(huán)蛋白受到泛素化修飾，被蛋白酶體降解，造成細(xì)胞內(nèi)β-連環(huán)蛋白的減少，使得WNT調(diào)控靶基因不能表達(dá)[3]。當(dāng)WNT與卷曲蛋白(frizzled,Fzd)結(jié)合后會激活下游信號分子散亂蛋白(dishevelled,Dvl)。Dvl能破壞β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合物，從而使未磷酸化的β-連環(huán)蛋白在胞質(zhì)中積累。β-連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核中，β-連環(huán)蛋白與T細(xì)胞特異性因子(T lymphocyte specific factor,TCF)/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(lymphoid enhancer-binding factor,LEF)轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物。LEF/TCF/β-連環(huán)蛋白可激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，即促進(jìn)誘發(fā)肥大的RUNX2的表達(dá)。SOX9可通過促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的磷酸化抑制這種信號[3]。研究證實(shí)[4-5]，SOX9和RUNX2基因蛋白表達(dá)程度決定了經(jīng)典WNT信號通路對軟骨細(xì)胞肥大進(jìn)程的影響。即在軟骨內(nèi)，WNT的適度激活對于軟骨細(xì)胞增殖是必要的，而過度激活則會增加軟骨細(xì)胞的肥大和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinase,MMP)13的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大分化進(jìn)而骨化。(2)非經(jīng)典WNT信號通路：非經(jīng)典WNT信號通路(如WNT5a信號通路)通常僅在軟骨細(xì)胞形成和分化的早期階段誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的肥大。在早期階段，WNT5a通過細(xì)胞內(nèi)經(jīng)G蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶C進(jìn)而釋放第二信使，使Ca2+通道開放，釋放Ca2+誘導(dǎo)軟骨形成和肥大[6]。而在后期，雖然WNT5a可以通過依賴激活依賴磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PKB或Akt)通路作為肥大抑制劑，進(jìn)而激活核因子-κB，抑制RUNX2的表達(dá)，而抑制肥大的出現(xiàn)[7]。即非經(jīng)典WNT信號通路(如WNT5a信號通路)在MSC軟骨生成中表現(xiàn)出雙重功能。

2.骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenotic protein,BMP)/轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路：BMPs是一組多功能的細(xì)胞因子，屬于TGF-β家族。轉(zhuǎn)化生長因子-β家族是一組多功能生長因子，參與細(xì)胞生長分化、免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育和細(xì)胞凋亡等多種生理過程。(1)BMP信號通路：BMPs在胚胎骨骼發(fā)育過程中具有多重作用，除了具有促進(jìn)MSCs聚集和誘導(dǎo)軟骨形成分化外，BMPs還可誘導(dǎo)早期軟骨形成，并且是軟骨細(xì)胞增殖和軟骨內(nèi)骨化過程中成熟的關(guān)鍵因素。BMPs對MSC軟骨細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用，對軟骨細(xì)胞肥大既有刺激作用又有抑制作用。例如BMP2和BMP4能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大，而BMP7能保持軟骨形成潛力并抑制軟骨細(xì)胞肥大[8]。在軟骨細(xì)胞內(nèi)，BMP信號通路對肥大的抑制過程基本由BMP- Mad相關(guān)蛋白(Smad)通路介導(dǎo)。當(dāng)BMPs(BMP2/4)結(jié)合到受體BMPR-I和II，BMP通路被激活，使Smad1，Smad5和Smad8等受體依賴型Smad(R-Smads)磷酸化[9]。R-Smads磷酸化后招募通用型Smad(Co-Smad，即Smad4)并與其結(jié)合形成異聚體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，隨后結(jié)合到靶基因RUNX2的調(diào)控區(qū)以調(diào)節(jié)RUNX2的表達(dá)[9]，并伴有如X型膠原、MMP13和ALPL等肥大標(biāo)記物的表達(dá)[10]。(2) TGF-β信號通路：在體外，TGF-β是一種軟骨生成的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，即TGF-β信號通路可刺激軟骨細(xì)胞增殖分化并抑制軟骨細(xì)胞肥大。 TGF-β通過Smad2/3信號通路抑制軟骨細(xì)胞的終末肥大分化并穩(wěn)定軟骨形態(tài)[11-12]。Smad2/3途徑被TGF-β直接活化，其作用途徑為：TGF-β受體(tromsforming growth factor-β receptor,TGFβ-R)與TGF-β結(jié)合后聚合并自身磷酸化，進(jìn)而募集并磷酸化Smad2和Smad3；磷酸化的Smad2/3與Smad4形成三聚體后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)；隨后，該Smad三聚體復(fù)合物調(diào)控SOX9轉(zhuǎn)錄抑制RUNX2表達(dá)，從而誘導(dǎo)軟骨生成并抑制軟骨細(xì)胞肥大[13-14]。

3.甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)/印度刺猬因子(Indian hedgehog,IHH)信號通路：(1)IHH信號通路： IHH屬于在hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的一部分。它在軟骨細(xì)胞分化、增殖和成熟等過程，特別是在軟骨內(nèi)骨化過程中均具有重要作用。IHH通常通過反饋控制甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白來調(diào)節(jié)其作用，但也可直接導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大。IHH在與其受體Ptch1結(jié)合后，可通過其下游轉(zhuǎn)錄因子GLI-K家族成員(Gli)1/2促進(jìn)RUNX2/Smad之間的相互作用，進(jìn)而促使X型膠原的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)等軟骨細(xì)胞肥大表型的出現(xiàn)[15]。(2)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白信號通路：甲狀旁腺素相關(guān)蛋白屬于甲狀旁腺激素家族，是抑制軟骨細(xì)胞肥大的關(guān)鍵因素之一。其受體PTH1R為G蛋白偶聯(lián)受體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲狀旁腺素相關(guān)蛋白或PTH1R敲除的小鼠會導(dǎo)致小鼠軟骨細(xì)胞肥大加速[16]。細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白信號的方式主要包括激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)或蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)，或激活NK3同源框2(NK3 homebox protein2,NKx3.2)，也可通過鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(Ca+2/calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)的去磷酸化干擾鈣途徑。PKA介導(dǎo)PTHrP信號過程為PTHrP與PTH1R結(jié)合后，依次激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A，進(jìn)而一條信號通路直接磷酸化SOX9；而另一條信號通路激活蛋白磷酸Ⅱ(protein phosphatase 2A,PP2A)，導(dǎo)致組蛋白脫乙酰4(histone deacetylase 4,HDAC4)去磷酸化以及轉(zhuǎn)錄因子MEF2C和RUNX2的失活，從而抑制相關(guān)肥大基因的表達(dá)[17]。PTHrP信號與Ca2+信號之間的關(guān)系是，PTH/甲狀旁腺素相關(guān)蛋白信號傳導(dǎo)和Ca2+水平之間存在反饋回路。p38MAPK位于PTH/甲狀旁腺素相關(guān)蛋白信號通路的中心，即可通過連接上游的PKC和下游的Bcl-2來調(diào)控軟骨細(xì)胞肥大[18]。PTH/甲狀旁腺素相關(guān)蛋白具有抑制p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的活性的作用，抑制軟骨細(xì)胞肥大[18]。因此，有研究則通過在對MSC進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)中加入PTHrP的4種同分異構(gòu)體后發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白1-34顯著增加了Ⅱ型膠原的表達(dá)且減少了肥大標(biāo)志物[19]。

4.成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)信號通路：FGF屬于細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白家族，F(xiàn)GF信號通路在調(diào)控軟骨細(xì)胞分化過程中有重要作用[20]。 FGF家族中的4個成員包括FGF2、FGF8、FGF9和FGF18，均是影響軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的因素[20-24]。其中，F(xiàn)GF2通常在增殖和肥大前軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)，其功能在于促進(jìn)RUNX2的表達(dá)[25]。在人類關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，F(xiàn)GF2與成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)1結(jié)合后激活PKC8，通過Raf-MEK1/2-ERK1/2級聯(lián)反應(yīng)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞信號，進(jìn)而促進(jìn)RUNX2的表達(dá)[26]。FGF9的作用機(jī)制仍存在爭議。FGF9可在骨骼發(fā)育的早期階段促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大[23]。FGF18在肥大軟骨細(xì)胞中通過傳遞信號給FGFR1和FGFR2，通過Raf-MEK1/2-ERK1/2級聯(lián)反應(yīng)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞信號，促進(jìn)RUNX2的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等肥大標(biāo)記物的表達(dá)[27]。此外，F(xiàn)GF信號通路與WNT、IHH和BMP等信號通路之間均存在著相互作用關(guān)系，并且對MSCs的命運(yùn)及隨后軟骨細(xì)胞的肥大成熟等過程起到重要的作用[28]。如FGF與FGFR1結(jié)合后，可作用于WNT通路下游的β-連環(huán)蛋白、以及與FGF信號通路存在著拮抗關(guān)系的IHH的信號通路和與FGF信號通路存在著協(xié)同關(guān)系的BMP通路，從而促進(jìn)肥大軟骨細(xì)胞成熟等[28-30]。

5.胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)信號通路： IGF-1具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和成熟的功能，同時對骨骼發(fā)育具有重要作用，常表達(dá)于生長板軟骨細(xì)胞增殖和前肥大區(qū)域[31]。生長發(fā)育過程中IGF-1介導(dǎo)的成骨成軟骨分化過程，是通過改變軟骨細(xì)胞增殖與肥大之間的平衡關(guān)系而相互協(xié)調(diào)[32]。對于MSCs而言，IGF-1能誘導(dǎo)MSCs進(jìn)行分化形成軟骨細(xì)胞，前肥大軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞[33]。IGF-1信號在調(diào)控生長板軟骨細(xì)胞肥大過程是通過調(diào)控WNT/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑而實(shí)現(xiàn)的[34]。在肥大軟骨細(xì)胞中，IGF-1和IGF-1受體(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF1R)結(jié)合后可刺激生長板軟骨細(xì)胞中的Wnt4表達(dá)和激活β-連環(huán)蛋白，進(jìn)而通過該信號通路作用于RUNX2等相應(yīng)的肥大標(biāo)記物[35]。

6.Notch信號通路：Notch信號通路是一條在進(jìn)化上極具保守,影響細(xì)胞命運(yùn)的信號傳導(dǎo)途徑，該通路對整個軟骨形成過程和維持軟骨細(xì)胞的表型,調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖,成熟,肥大化等方面均發(fā)揮重要的作用。Dong 等[36]研究還證明如果軟骨細(xì)胞中的 Notch 信號得到抑制，將會引起軟骨細(xì)胞的增殖和肥大。Notch信號通路在對軟骨細(xì)胞分化的三個不同階段都扮演了一個重要角色。Hayes等[37]在小鼠的生長發(fā)育過程中的研究表明，在關(guān)節(jié)軟骨深層和骨骼生長板的肥大細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)Notch3 受體的特定性表達(dá)。

7.MAPK信號通路：MAPKs在有關(guān)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[38]。Erk1/2 MAPK通路可被生長因子激活，JNK/p38 MAPK通路可在細(xì)胞應(yīng)激、缺氧等條件或細(xì)胞因子的作用下而激活[39-40]。通過單獨(dú)添加PTH、SB203580或同時使用兩者，可抑制肥大軟骨細(xì)胞中的p38MAPK，導(dǎo)致COL10A1 mRNA的減少和肥大前標(biāo)志物軟骨基質(zhì)蛋白表達(dá)的增加。因此，抑制p38可使細(xì)胞從肥大細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀笄凹?xì)胞表型，從而阻止軟骨細(xì)胞過早肥大[41-42]。Erk1/2信號通路的激活促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大[43-44]。TGF-α是表皮生長因子受體信號傳導(dǎo)的激活因子，其在人骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)；抑制MEK/ERK可大大減少或完全阻止TGF-α引起Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖降解[45]。

8.整合素信號通路：整合素可通過參與MAPK信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)軟骨肥大過程。整合素α5β1表達(dá)上調(diào)后，RhoA蛋白表達(dá)隨之升高，進(jìn)而促進(jìn)下游MAPK-ERK蛋白表達(dá)與活化，激活MAPK經(jīng)典信號通路，最終引起RUNX2的mRNA與蛋白表達(dá)水平升高[46-47]。

二、抑制軟骨細(xì)胞肥大分化的策略

1.小分子蛋白抑制劑：由于相關(guān)信號通路參與軟骨肥大分化，因此，可以通過阻斷或者激活相關(guān)信號通路來抑制肥大分化。Smad1/5/8途徑的磷酸化可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的肥大，因此，在培養(yǎng)基中通過添加Smad1/5/8途徑抑制劑dorsomorphin在一定程度上能暫時抑制軟骨的肥大分化，促進(jìn)軟骨形成[48]。有研究表明，同時添加FGF2與甲狀旁腺素相關(guān)蛋白信號通路可抑制軟骨細(xì)胞肥大分化[49]。在含有FGF18的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，ALP活性明顯降低，成骨相關(guān)基因包括ALP、Colla1、骨鈣蛋白、骨唾液蛋白等的表達(dá)明顯被抑制。同時，該細(xì)胞的礦物質(zhì)沉積也明顯降低[49]。由此可知，可通過添加FGF18激活FGF信號通路可抑制肥大分化。已知BMP4位于Notch通路上游，并通過Notch通路抑制成軟骨分化過程而促進(jìn)肥大分化，因而可通過添加相應(yīng)阻斷劑如Notch通路抑制DAPT和BMP信號通路的阻斷劑等來抑制軟骨肥大過程[50]。由于MAPK和整合素信號通路也與軟骨肥大分化相關(guān)，因此，可通過抑制p38 MAPK和Erk1/2以及整合素途徑以抑制軟骨細(xì)胞肥大以維持軟骨分化表型。研究已經(jīng)證實(shí)[51]甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白可以抑制軟骨肥大分化[51]。缺氧條件下可以誘導(dǎo)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白產(chǎn)生進(jìn)而可通過減少肥大軟骨產(chǎn)生而獲得表型穩(wěn)定的軟骨組織。因此，在未來臨床應(yīng)用時，可考慮將體外缺氧環(huán)境適當(dāng)轉(zhuǎn)化為體內(nèi)環(huán)境，以促進(jìn)與天然關(guān)節(jié)軟骨相似的軟骨的形成。

2．支架材料：不僅可針對一些轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)信號通路進(jìn)行調(diào)控以抑制軟骨肥大化，組織工程支架材料的應(yīng)用也提供新的思路[52-53]。在體外，將 MSC種植在支架上進(jìn)行向軟骨方向誘導(dǎo)，構(gòu)建的MSC-mECM支架復(fù)合物，可表現(xiàn)出與天然軟骨相似的軟骨形態(tài)，并且肥大化標(biāo)志物也明顯減少。很多研究表明，MSC種植在支架上，可以更好的發(fā)揮MSC軟骨分化作用。有研究發(fā)現(xiàn)，包裹在光交聯(lián)產(chǎn)生的新型透明質(zhì)酸水凝膠中的MSCs可以產(chǎn)生更多的II型膠原蛋白和硫酸軟骨素，而I型膠原蛋白的沉積較少, 從而形成良好的軟骨組織[54-55]。因此，把 MSCs種植在支架上可以通過減少軟骨肥大分化以起到軟骨缺損修復(fù)的作用。

在體外獲得表型穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程應(yīng)用的首先的環(huán)節(jié)。通過闡明MSC或軟骨肥大分化調(diào)控機(jī)制，以便進(jìn)一步探究如何建立起適當(dāng)?shù)男盘柶胶庖约耙种品蚀蠓只饔玫姆肿影悬c(diǎn)，為精準(zhǔn)地調(diào)控MSCs定向軟骨分化，維持表型穩(wěn)定，推進(jìn)MSCs作為種子細(xì)胞在軟骨組織工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。