經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細胞分離培養(yǎng)及制備標準操作規(guī)程

河南省細胞生物學會干細胞專業(yè)委員會

中國研究型醫(yī)院學會臨床數(shù)據(jù)與樣本資源庫專業(yè)委員會

目前，干細胞技術(shù)已成為很多難治性疾病治療的新希望。通過干細胞移植、分化與組織再生，促進機體創(chuàng)傷修復、疾病恢復，給疾病的臨床治療帶來了顛覆性變化[1-3]。在與新型冠狀病毒肺炎疫情的抗爭中，干細胞技術(shù)成為治療新型冠狀病毒肺炎的一種具有良好臨床前景的選擇，而干細胞技術(shù)的安全性、有效性得到了臨床與科研數(shù)據(jù)的驗證，為戰(zhàn)勝疫情提供了強有力的科技支撐[4-7]。截至目前，國內(nèi)通過國家衛(wèi)生健康委員會備案的干細胞研究機構(gòu)已超過100家，國家也正在大力支持干細胞的臨床轉(zhuǎn)化，已批準干細胞技術(shù)在數(shù)十種疾病的治療上進行臨床研究[8]。近年來，國家頻發(fā)政策支持干細胞行業(yè)的發(fā)展，干細胞的監(jiān)管模式逐漸明朗，《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導原則(試行)》的頒布，意味著我國干細胞治療產(chǎn)品的上市審批道路逐漸打通，患者使用干細胞產(chǎn)品治療的時代即將到來[9]。2021年2月9日，國家衛(wèi)生健康委員會在官網(wǎng)發(fā)布的《對十三屆全國人大三次會議第4371號建議的答復》中，明確表示支持推動示范區(qū)干細胞治療、細胞免疫治療等醫(yī)療技術(shù)的臨床應(yīng)用，答復函中明確提出：“國家衛(wèi)生健康委員會一直鼓勵和支持干細胞研究、轉(zhuǎn)化和產(chǎn)業(yè)發(fā)展?！备杉毎苿┚哂忻黠@的藥品屬性，國家藥品監(jiān)管部門審批后可以應(yīng)用，既有利于保障醫(yī)療質(zhì)量安全，又有利于產(chǎn)業(yè)化、高質(zhì)量發(fā)展[10]。

經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細胞(menstrual blood derived endometrial stem cells,MenSCs)憑借其豐富的來源、采集和分離方式的無侵入性、良好的增殖活性等優(yōu)勢獲得國內(nèi)外廣泛關(guān)注[11-13]。在臨床應(yīng)用MenSCs的安全性獲得保障的前提下，其已在骨損傷、心肌損傷、肝臟損傷、子宮內(nèi)膜損傷及中風等疾病的治療過程中展示了良好的治療效果[14-19]。截至2020年6月，國家衛(wèi)生健康委員會已備案干細胞相關(guān)治療項目74個，其中包括6項與MenSCs相關(guān)的臨床備案項目。上述臨床研究項目的備案與開展不僅表明MenSCs有巨大的應(yīng)用前景與市場，也說明建立子宮內(nèi)膜干細胞相關(guān)質(zhì)量標準的緊迫性和必要性。目前，盡管已經(jīng)出臺多項間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及制備的地方或行業(yè)標準[20-25]，但針對MenSCs規(guī)范化、標準化的細胞分離培養(yǎng)及制備操作規(guī)程尚未見報道。因此，基于上述MenSCs的技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用中所存在的機遇與挑戰(zhàn)，本項目以新鄉(xiāng)醫(yī)學院干細胞與生物治療技術(shù)研究中心、河南省干細胞工程實驗室、河南省干細胞與生物治療工程研究中心等科研平臺為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)有間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及制備的方法，通過校企合作的方式與新鄉(xiāng)高新區(qū)中源干細研究院和北京臻溪谷醫(yī)學研究中心共同建立形成了符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(goods mamufacturing practice,GMP)的、標準的、規(guī)范化的MenSCs分離培養(yǎng)及凍存等操作流程，以期為各科研生產(chǎn)單位在制備MenSCs制品的過程中提供借鑒，促進MenSCs的建庫工作，為MenSCs的臨床推廣應(yīng)用提供技術(shù)保障。

1 本操作規(guī)范的目的和適用范圍

1.1 目的規(guī)范MenSCs的分離、培養(yǎng)、入庫過程，充分利用每一份經(jīng)血樣本，有效提高樣本中MenSCs原代細胞的分離數(shù)量。

1.2 適用范圍本規(guī)范適用于MenSCs的原代分離培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及凍存等規(guī)范化操作流程。

2 操作人員職責

2.1 制備操作進行制備前的準備、整個制備過程的操作及制備后的清場、記錄填寫和樣品送檢、培養(yǎng)過程中的細胞觀察等。

2.2 質(zhì)量控制接收送檢樣品，進行樣品檢測并出具檢測報告。

2.3 現(xiàn)場質(zhì)量保證確保制備操作前制備環(huán)境正常，使用設(shè)備處于正常運行狀態(tài)，制備人員整個操作過程符合標準操作規(guī)程，記錄填寫及時、正確，取樣點正確，樣品送檢及時。

3 物料需求

3.1 耗材器械盒、100 mm培養(yǎng)皿、50 mL離心管、T75培養(yǎng)瓶、T175培養(yǎng)瓶、10 mL移液管、25 mL移液管、1.5 mL離心管、5 mL 離心管、2 mm孔徑濾網(wǎng)、100 μm細胞濾網(wǎng)、50 mL注射器，2 mL凍存管。

3.2 試劑基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、生理鹽水、體積分數(shù)75%醫(yī)用乙醇、1.25 g·L-1胰蛋白酶、消化終止液、細胞凍存液。

4 細胞培養(yǎng)代次定義

原代細胞：樣本接種后培養(yǎng)至融合度為70%～80%的細胞為原代細胞。

第1代細胞(passage 1,P1)：原代細胞按照本規(guī)程操作消化接種后，培養(yǎng)至融合度為85%～90%，可以收獲或傳代的細胞為第1代細胞。

第2代細胞(passage 2,P2)：第1代細胞按照本規(guī)程操作消化接種后，培養(yǎng)至融合度為85%～90%，可以收獲或傳代的細胞為第2代細胞。

本規(guī)程中所述的種子細胞特指第2代細胞。

5 工作規(guī)程

5.1 環(huán)境要求(1)MenSCs種子細胞的分離、培養(yǎng)和凍存操作在C級潔凈室中進行，開放式操作必須在A級環(huán)境內(nèi)進行(生物安全柜)；(2)制備人員(固定的崗位名稱，與質(zhì)量管理手冊一致)應(yīng)提前對細胞操作間和生物安全柜進行紫外線滅菌，紫外線照射時間為30 min。

5.2 操作前準備(1)開啟C級潔凈室中各生物安全柜相關(guān)操作單元紫外線燈照射30 min，關(guān)閉各操作單元紫外線燈后通新風10 min，保持各操作單元處于運行狀態(tài)；(2)從準備間4 ℃冰箱或采集套裝中取出裝有經(jīng)血的樣本采集管，使用噴有體積分數(shù)75%乙醇的無塵布將經(jīng)血樣本采集管自管口向管底螺旋式擦拭一遍后再放入傳遞窗，C級潔凈室中的制備人員從傳遞窗中取出經(jīng)血樣本采集管，再使用噴有體積分數(shù)75%乙醇的無塵布擦拭一遍，然后將其放入處于運行狀態(tài)的生物安全柜中。(3)從C級潔凈室的潔凈物料間取出所需耗材置于物料推車上，再將物料推車推至生物安全柜旁邊。(4)從潔凈物料間4 ℃冰箱中取出培養(yǎng)基，正立放置于37.0 ℃恒溫金屬浴，使其恢復至37 ℃。(5)取出生理鹽水瓶，使用噴有體積分數(shù)75%乙醇的無塵布將生理鹽水瓶自瓶口向瓶底螺旋式擦拭一遍，去除瓶口塑料蓋后將其放入生物安全柜中。(6)開啟玻璃瓶裝生理鹽水瓶塞：先用止血鉗夾斷瓶口鋁外套，再用鑷子夾取體積分數(shù)75%乙醇棉球，將棉球一側(cè)固定在橡膠瓶塞與玻璃瓶口接合處，環(huán)繞一周進行擦拭，再用棉球另一側(cè)擦拭瓶塞頂端；棄去乙醇棉球，靜置，待瓶口乙醇揮發(fā)后傾斜生理鹽水瓶，使其與臺面呈45°，然后應(yīng)用止血鉗夾緊橡膠塞邊緣一角(止血鉗勿接觸玻璃瓶口)，施力拔下瓶塞。

5.3 細胞原代培養(yǎng)(1)在制備檔案上記錄環(huán)境狀況和經(jīng)血樣本信息。(2)使用體積分數(shù)75%乙醇擦拭采集管外壁。(3)吸取7 mL樣本密度分離液加入15 mL離心管中，然后沿管壁緩慢加入7 mL經(jīng)血樣本(含收集液)，置于水平轉(zhuǎn)子離心機中，4 ℃、1 800 r·min-1離心25 min。(4)離心完畢后取中間白膜層轉(zhuǎn)入新的50 mL離心管中，加入生理鹽水重懸，所抽取白膜層與生理鹽水體積比例為1：2；1 500 r·min-1離心5 min，洗滌2次，將末次離心后的上清液留樣進行支原體、細菌及真菌檢測。(5)將白膜層離心后的沉淀加入MenSCs原代完全培養(yǎng)基，吹打均勻，均勻接種至T75培養(yǎng)瓶中，每瓶12 mL(在15 mL離心管中，不超過0.5 mL沉淀時接種1個T75培養(yǎng)瓶，超過0.5 mL沉淀時接種2個T75培養(yǎng)瓶)，隨后將細胞培養(yǎng)瓶水平置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。(6)將“5.3(3)”項中密度梯度離心完畢后所獲得的最下層細胞沉淀加入10 mL紅細胞裂解液，室溫裂解5 min，1 200 r·min-1離心5 min，如未裂解完全，可重復上述步驟；離心后的沉淀加入10 mL生理鹽水吹打，1 200 r·min-1離心5 min，洗滌2次；將末次離心后的上清液留樣進行支原體、細菌及真菌檢測。(7)將離心后的沉淀加入MenSCs原代完全培養(yǎng)基，吹打均勻，均勻接種至T75培養(yǎng)瓶中，每瓶12 mL(在15 mL離心管中不超過0.5 mL沉淀，接種1個T75培養(yǎng)瓶；超過0.5 mL沉淀，接種2個T75培養(yǎng)瓶)，隨后將細胞培養(yǎng)瓶水平置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。(8)全量換液：培養(yǎng)48 h后進行一次全量換液，吸去舊培養(yǎng)液，10 mL 生理鹽水沖洗2～3次，除去未貼壁組織及細胞；添加新鮮MenSCs原代完全培養(yǎng)基，T75瓶每瓶12 mL，置入37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d觀察、換液1次。

5.4 原代收集(1)培養(yǎng)至第5～7天，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)有無異常及細胞有無污染。待細胞融合度達到80%～90%時即可進行消化收獲。若細胞融合度未達到40%～50%，將培養(yǎng)瓶中細胞分別按下述步驟進行消化和終止，1 200 r·min-1離心5 min。離心完畢后加入2 mL新鮮MenSCs原代完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，待細胞吹打均勻后將2 mL 細胞懸液加入含有10 mL培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中，T75培養(yǎng)瓶中的細胞及培養(yǎng)基的最終體積為12 mL；注意：原代細胞培養(yǎng)時間不得超過14 d。(2)生理鹽水輕輕沖洗細胞培養(yǎng)瓶底2次，每次每瓶10 mL。(3)消化：將1.25 g·L-1胰蛋白酶加入洗滌后的T75培養(yǎng)瓶中，每瓶1 mL，輕搖疊加培養(yǎng)瓶，使每個培養(yǎng)瓶的消化液均能浸潤培養(yǎng)瓶底面。在培養(yǎng)箱中靜置3～5 min后取出培養(yǎng)瓶，左右輕輕晃勻，并于倒置顯微鏡下觀察，待見鏡下細胞變圓、大部分細胞脫落即表示消化可終止；(4)終止消化：向可終止消化的培養(yǎng)瓶中加入消化終止液，每瓶5 mL，終止消化，再將終止消化后培養(yǎng)瓶中細胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中，然后用10 mL的生理鹽水洗滌黏附在培養(yǎng)瓶中的殘余細胞，并將洗滌后的細胞懸液一并轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中(加入胰蛋白酶到終止消化，時間不超過10 min)。(5)離心洗滌：將離心管配平后置入離心機，1 200 r·min-1離心5 min。(6)合并離心后的細胞沉淀：離心后將洗滌上清液棄去，加入5～10 mL生理鹽水重懸細胞，最終將重懸后的細胞懸液合并到1個50 mL離心管中，并定容至40～45 mL。(7)取樣計數(shù)、計算細胞活率：將定容后的細胞懸液吹打混勻，先取不超過0.5 mL 的細胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，使用細胞計數(shù)儀進行收獲細胞總數(shù)和細胞活率的計算。注意：如果1個50 mL離心管可以完成操作，則在步驟“5.4(5)”前取樣計數(shù)，不必離心第2次。

5.5 細胞傳代(1)計算傳代數(shù)量：根據(jù)計數(shù)結(jié)果，并按照每個T175瓶2×106個細胞傳代密度，計算傳代需要的T175培養(yǎng)瓶數(shù)量。(2)去上清液、重懸細胞懸液：1 200 r·min-1離心5 min后將上清液去除，應(yīng)用適量培養(yǎng)基重懸離心后的細胞沉淀(按每瓶接種2 mL細胞懸液計算)。(3)根據(jù)最終傳代T175培養(yǎng)瓶數(shù)量及生物安全柜一次能放置T175培養(yǎng)瓶的容量(不超過25瓶)，將所需T175培養(yǎng)瓶排成一排，豎直擺放在生物安全柜內(nèi)，在瓶壁上標注細胞編碼、細胞代數(shù)、培養(yǎng)時間等信息后，開蓋，用25 mL移液管加入培養(yǎng)基，每瓶23 mL。(4)接種：將細胞吹打均勻后分別往已加23 mL培養(yǎng)基的T175培養(yǎng)瓶中每瓶加入2 mL細胞懸液(1×109L-1)，使每個T175培養(yǎng)瓶中的細胞及培養(yǎng)基的最終體積為25 mL。(5)混勻：加完細胞懸液后將T175培養(yǎng)瓶瓶蓋擰緊，以3個疊加后將培養(yǎng)瓶平置，輕輕混勻10 s，使加入細胞懸液均勻分布于整個培養(yǎng)瓶底面。(6)放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)：將接種后的T175培養(yǎng)瓶以3個疊加平穩(wěn)置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合度達到85%～90%。

5.6 傳代細胞收集(1)棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，使用生理鹽水輕輕沖洗細胞培養(yǎng)瓶2遍。(2)消化：于洗滌后的培養(yǎng)瓶中加入1.25 g·L-1胰蛋白酶，每瓶2 mL，輕搖疊加培養(yǎng)瓶，使每個培養(yǎng)瓶的消化液均能浸潤培養(yǎng)瓶底面。在培養(yǎng)箱中靜置1 min后取出培養(yǎng)瓶，輕輕拍打，取1個培養(yǎng)瓶于倒置顯微鏡下觀察，鏡下見細胞變圓、大部分細胞脫落即表示消化可終止(加入胰蛋白酶到終止消化，時間不超過5 min)。按步驟“5.4(2)至5.4(4)”進行消化和終止，消化后的細胞懸液移至1個50 mL離心管中，洗瓶1～2次，洗瓶后的液體也移至同1個50 mL離心管中。(3)離心洗滌：將離心管配平后放入離心機，1 200 r·min-1離心5 min。(4)合并離心后的細胞沉淀：離心后將洗滌上清液棄去，用10 mL的生理鹽水重懸細胞，將重懸后的細胞懸液合并到1個50 mL 離心管中，并定容至40 mL。(5)取樣計數(shù)、計算細胞活率：將定容后的細胞懸液吹打混勻，取不超過0.5 mL的細胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，進行收獲細胞總數(shù)和細胞活率的計算，并進行支原體、細菌及真菌檢測。

5.7 細胞凍存(1)從4 ℃冰箱中取出凍存液，根據(jù)步驟“5.6(5)”細胞計數(shù)結(jié)果，離心獲得細胞沉淀，在離心管中加入適量的凍存液，重懸細胞沉淀，用1 mL槍頭輕輕吹打均勻，使細胞密度與要求凍存密度一致(5.0×109～1.0×1010L-1)。(2)根據(jù)凍存規(guī)格，將細胞懸液按每支凍存管1 mL的標準分裝于2 mL的凍存管中。(3)貼標簽，封口：將分裝后的凍存管貼上凍存細胞編碼標簽，封口膜封口。

5.8 使用程序降溫盒或程控降溫儀凍存細胞(1)使用程序降溫盒凍存細胞：把含細胞的凍存管放入4 ℃ 冰箱中預冷10 min；把含細胞的凍存管放入4 ℃ 預冷的程序降溫盒中，并轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱中；12～16 h內(nèi)利用中轉(zhuǎn)罐轉(zhuǎn)移到臨時儲存罐中，暫存。(2)利用程控降溫儀凍存細胞：檢查程控降溫儀、杜瓦罐及電腦和打印機是否連接完好；打開電腦和程控降溫儀；打開液氮閥門，點擊“CRF”圖標運行程控降溫儀軟件；點擊“Run”按鈕，輸入使用用戶名和密碼；如果一切正常，軟件會自動彈出一個對話框選擇冷凍規(guī)程，然后選擇脂肪凍存規(guī)程；把含細胞的凍存管放入程控降溫儀的腔體內(nèi)；把探針插入標準樣的冷凍管中，關(guān)閉程控降溫儀的門；點擊“Start”按鈕；等待腔體溫度降到4 ℃，5 min后進入下一步，然后程控降溫儀將自動運行直至結(jié)束：首先，以2 ℃·min-1的降溫速率運行，直至樣本溫度達到-40.0 ℃；隨后，以10 ℃·min-1的降溫速率運行，直至樣本溫度達到-80.0 ℃；打印并保留凍存曲線圖；關(guān)閉電腦和程控降溫儀，關(guān)閉液氮閥門；操作結(jié)束后，將凍存管用中轉(zhuǎn)罐轉(zhuǎn)移到臨時儲存罐中暫存。

5.9 在制備檔案上及時記錄相關(guān)信息詳細記錄從經(jīng)血樣本接收到干細胞入庫全過程，包括人(操作人員、操作時間)、機(所使用的儀器名稱、編號)、料(所使用的物料、物料批號)、法(制備工藝流程、參數(shù))、環(huán)(制備房間、溫濕度)、測(檢測項目、檢測結(jié)果)等方面，并形成完整實驗記錄(生產(chǎn)、檢測)。

6 展望

前期大量基礎(chǔ)及臨床研究結(jié)果已證實，MenSCs移植在多種難治性疾病的治療中取得了改善良好效果，且樣本采集、分離獲得MenSCs具有無創(chuàng)傷性，同一供體可周期性多次采集獲得MenSCs，從而獲得大量遺傳背景一致的種子細胞，并且MenSCs具有自體移植的優(yōu)勢，使其成為干細胞治療中非常具有潛力的種子細胞。因此，建立符合GMP生產(chǎn)要求、標準化、規(guī)范化的MenSCs細胞生產(chǎn)制備標準操作流程，是保證MenSCs細胞制品質(zhì)量的前提，其不僅為MenSCs臨床治療效果提供保障，也進一步為深入探索其對相關(guān)疾病的改善機制奠定堅實基礎(chǔ)。因此，本文在參考已有間充質(zhì)干細胞標準操作的基礎(chǔ)上，結(jié)合MenSCs自身的特性，通過長期的摸索及實踐，已完成針對MenSCs種子細胞分離培養(yǎng)及制備標準操作流程，后續(xù)將根據(jù)研究的深入及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，與時俱進地對現(xiàn)有MenSCs標準操作進行升級和補充。相信基于本文所建立的MenSCs種子細胞分離培養(yǎng)及制備標準操作，可為各科研及生產(chǎn)單位在制備MenSCs細胞制品的過程中提供借鑒，促進MenSCs干細胞資源庫的建立，為MenSCs的臨床使用，包括細胞移植數(shù)量、細胞移植時間窗及細胞移植途徑等關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化提供支持與保障，從而推動MenSCs臨床應(yīng)用進程。

7 附則

執(zhí)筆人：

林俊堂(新鄉(xiāng)醫(yī)學院干細胞與生物治療技術(shù)研究中心)

劉彥禮(新鄉(xiāng)醫(yī)學院干細胞與生物治療技術(shù)研究中心)

陳 娟(河南省榮軍醫(yī)院)

楊 芬(新鄉(xiāng)醫(yī)學院干細胞與生物治療技術(shù)研究中心)

何亞南(新鄉(xiāng)市高新區(qū)中源干細胞研究院)

曹毓琳(北京臻溪谷醫(yī)學研究中心)