早卵泡期長效長方案添加不同外源性黃體生成素制劑對低黃體生成素患者體外受精-胚胎移植臨床結局的影響

于 蓮，南 燕，王 慧，劉 洋，李玉潔

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin releasing hormone agonist,GnRH-a)可使LH峰得到控制，卵泡發(fā)育與內膜同步化，對輔助生殖技術具有重要意義。目前，GnRH-a對垂體降調后給予促性腺激素(gonadotrophin,Gn)進行控制性超促排卵的長方案被多數生殖中心所采用，并取得了較好的臨床妊娠率[1]。但在臨床實踐中發(fā)現，部分患者在早卵泡期長效長方案中使用GnRH-a進行垂體降調后出現垂體過度抑制，導致血清黃體生成素(luteinzing hormone，LH)水平降低，對卵母細胞質量、受精率、優(yōu)質胚胎及種植率等造成不良影響。目前，采用在早卵泡期長效長方案中垂體降調后出現低LH水平時添加外源性LH制劑。在臨床上較多使用的外源性LH制劑有重組黃體生成素(recombinant follicle-stimulating hormone,r-LH)和人絕經促性腺激素(human menopausal gonadotropin,HMG)。r-LH 是采用基因工程所獲得的一種糖蛋白，r-LH在結構和功能上與生理性LH很相似，且藥物批次穩(wěn)定，在輔助生殖領域中被廣泛使用。HMG是由絕經婦女尿中提取出來的Gn，其價格低廉且安全有效，但HMG制劑中含有>30%的雜質，批次間差異較大，活性不穩(wěn)定。HMG中95%的LH活性是由人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)驅動，具有LH相似的功能。但LH與HCG在化學結構、生物學功能以及其作用的信號通路均有差異：LH與受體結合后，主要選擇細胞外調節(jié)蛋白激酶和蛋白激酶A通路，介導細胞增殖、分化，促進卵泡生長；HCG與受體結合后，通過環(huán)磷酸腺苷途徑促進雄激素和雌激素合成，從而促進卵子成熟和排卵[2]。與LH相比，HCG糖基化幅度大，具有更長的半衰期，生物活性更強[3]。因此，推測r-LH和HMG可能會引起臨床結局的不同?；诖?，本研究比較早卵泡期長效長方案添加r-LH和HMG對低LH患者體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)臨床結局的影響，為臨床藥物應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年4月至2020年5月于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科行IVF-ET助孕并采用早卵泡期長效長方案的不孕女性患者為研究對象。病例納入標椎：(1)年齡≤42歲；(2)垂體降調節(jié)后LH<1.0 U·L-1；(3)卵巢儲備功能正常[基礎促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)<10 U·L-1，竇卵泡數(antral follicle count，AFC)>5個]；(4)不孕原因主要是女性輸卵管不通或功能障礙、輕度子宮內膜異位癥及少精和弱精等男方原因。排除標準：(1)多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者；(2)染色體異常；(3)子宮畸形；(4)患有遺傳病、嚴重軀體疾病和精神心理障礙，接觸致畸量的射線、毒物等；(5)3 個月內服用過口服避孕藥者。本研究共納入238例患者，根據卵泡直徑在12～14 mm時添加外源性LH制劑的不同分為r-LH組(n=116)和HMG組(n=122)。r-LH組：年齡20～43(30.90±4.10)歲，不孕年限1～17(3.25±1.93)a，體質量指數(body mass index，BMI) 6.6～35.0(23.61±3.59)kg·m-2，AFC 4～23(13.22±4.13)個，抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)14～23(3.57±2.30)μg·L-1，基礎FSH 1.6～18.5(8.23±2.51) U·L-1，基礎 LH 0.2～10.0(4.37±2.16) U·L-1，基礎雌二醇(estradiol，E2) 19～81(35.95±12.55)ng·L-1，基礎孕酮(progesterone，P) 0.10～0.30(0.91±1.18) μg·L-1。HMG組：年齡20～43(31.11±4.10)歲，不孕年限1～20(3.74±2.13) a，BMI 15.6～37.1(23.32±3.59) kg·m-2，AFC 2～25(13.72±4.52)個，AMH 0.56～17.81(4.00±2.80)μg·L-1，基礎FSH 2.7～19.3(8.64±2.36)U·L-1，基礎LH 0.6～13.9(4.44±2.00) U·L-1，基礎E210.3～82.9(34.58±12.13) ng·L-1，基礎 P 0.12～2.45(0.74±0.46)μg·L-1。2組患者的年齡、不孕年限、BMI、AMH、AFC、基礎FSH、基礎LH、基礎E2、基礎P比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲醫(yī)院倫理委員會審核批準[倫理審批號：K2020-063-01]。

1.2 促排卵方案2組患者均采用早卵泡期長效長方案：于月經第2天肌內注射長效GnRH-a[輝凌(德國)制藥有限公司，進口藥品注冊證號H20140123]3.75 mg 進行垂體降調節(jié)，于用藥28～42 d行陰道超聲及性激素檢查，當子宮內膜厚度<5 mm、雙側卵泡直徑<5 mm、血清FSH<5 U·L-1、LH<5 U·L-1、E2<50 ng·L-1后，每天給予重組人促卵泡激素(recombinant follicle stimulating hormone,r-FSH)(瑞士默克雪蘭諾有限公司，進口藥品注冊證號S20160039)150～300 U·d-1；當卵泡直徑在12～14 mm時添加外源性黃體生成素，r-LH組患者皮下注射r-LH(默克雪蘭諾德國制藥有限公司，進口藥品注冊證號S20130058)75 U；HMG組患者肌內注射HMG(麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，國藥準字H10940097)75 U。根據促排卵期間卵泡大小、雌激素水平調整Gn劑量，當2～3個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm或3個優(yōu)勢卵泡直徑≥17 mm，血雌激素水平達到平均每個優(yōu)勢卵泡200～250 ng·L-1時，當日給予注射用絨促性素(麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，國藥準字號H44020674)1 000～2 000 U聯(lián)合重組人絨促性素注射液(默克雪蘭諾德國制藥有限公司，進口藥品注冊證號S20130091)250 μg，注射當日稱為HCG注射日；用藥后36～37 h在陰道B超引導下取卵。

1.3 體外受精胚胎移植取卵后常規(guī)體外受精或卵泡漿內單精子顯微注射，受精后16～18 h在倒置顯微鏡下觀察受精情況，受精后有2個原核(pronucleus，PN)為正常受精卵即2PN卵，不具有2個PN為異常受精卵。第3天觀察胚胎發(fā)育情況，胚胎等級劃分如下：根據胚胎卵裂球大小、碎片所占胚胎的比例進行分級，共分為4級，Ⅰ級：卵裂球形狀規(guī)則，大小均勻，有完整的透明袋，碎片≤5%；Ⅱ級：卵裂球形狀略不規(guī)則，大小略不均勻，碎片6%～20%；Ⅲ級：卵裂球形狀不規(guī)則，大小明顯不均勻，碎片21%～50%；Ⅵ級：細胞大小嚴重不均勻，碎片>50%。依據Istanbul共識胚胎評分標準進行優(yōu)質胚胎評判：卵子受精后第2天卵裂為4個細胞，第3天7個細胞以上，卵裂球大小均勻，碎片小于20%的Ⅰ～Ⅱ級胚胎。取卵當日開始給予肌內注射黃體酮(廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字號H44020229)40 mg，每日2次，至移植后14 d，若血清HCG陽性至移植后50 d開始減量，若HCG 陰性則停藥；地屈孕酮(雅培醫(yī)療保健產品有限公司，進口藥品注冊證號H20170221)10 mg，口服，每日2次，至移植后14 d，血清HCG陽性繼續(xù)服用至孕10～12周停藥，若HCG陰性則停藥。于取卵后第3天，取優(yōu)質胚胎進行子宮內移植；移植后35 d左右行超聲檢查，若宮腔內可見孕囊則確診為臨床妊娠。

1.4 觀察指標

1.4.1 促排卵指標(1)降調時間：從開始使用降調藥物至Gn啟動日的時間；(2)Gn總量及使用時間：統(tǒng)計促排期間Gn藥物使用總量(r-LH組為r-FSH+r-LH；HMG組為r-FSH+HMG)及Gn使用時間；(3)HCG注射日子宮內膜厚度：于注射HCG當日，應用Prosound SSD-3500彩色超聲診斷儀(上海阿洛卡醫(yī)用儀器有限公司)檢測子宮內膜厚度；(4)E2、P及LH水平：于HCG注射日應用Access全自動微粒子化學發(fā)光免疫系統(tǒng)(美國貝克曼庫爾特有限公司)檢測患者空腹靜脈血E2、P水平，于添加LH日和HCG注射日應用Access全自動微粒子化學發(fā)光免疫系統(tǒng)(美國貝克曼庫爾特有限公司)檢測患者空腹靜脈血LH水平。

1.4.2 實驗室及臨床結局指標(1)記錄患者獲卵數、MII卵數、受精數(正常受精+異常受精)、2PN卵數、卵裂數、優(yōu)質胚胎數、全胚冷凍周期數、有可移植胚胎的周期數、妊娠周期數、移植周期數；(2)計算受精率、2PN卵率、MII卵率、全胚冷凍周期率、優(yōu)質胚胎率、種植率及臨床妊娠率。受精率=受精數/獲卵數×100%，2PN卵率=2PN卵數/獲卵數×100%，MII卵率=MII卵母細胞數/獲卵數×100%，全胚冷凍周期率=全胚冷凍周期數/有可移植胚胎的周期數×100%，優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數/2PN數×100%，種植率=孕囊數/總移植胚胎數×100%，臨床妊娠率=妊娠周期數/移植周期數×100%。

2 結果

2.1 2組患者促排卵指標比較結果見表1。2組患者的降調時間、Gn啟動量、Gn總量、HCG注射日E2水平、HCG注射日子宮內膜厚度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；r-LH組患者Gn使用時間、添加LH日血LH水平、HCG注射日P水平低于HMG組，HCG注射日LH水平高于HMG組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 2組患者促排卵指標比較Tab.1 Comparison of ovulation induction index of patients between the two groups

2.2 2組患者實驗室及移植后臨床結局指標比較結果見表2。2組患者獲卵數、2PN卵數、MII卵數、卵裂數、受精數、優(yōu)質胚胎數、受精率、2PN卵率、MII卵率、全胚冷凍期率、種植率、臨床妊娠率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；r-LH組患者優(yōu)質胚胎率高于HMG組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 2組患者實驗室及移植后臨床結局指標比較Tab.2 Comparison of laboratory indicators and post-transplant clinical outcome of patients between the two groups

3 討論

早卵泡期長效長方案促排過程中使用GnRH-a具有抑制內源性LH的合成和分泌、預防早發(fā)LH峰出現、避免卵泡成熟前出現LH峰等優(yōu)點，逐漸成為輔助生殖的主流方案[4]，但GnRH-a的使用會使部分患者垂體功能度過抑制，造成內源性LH水平過低。近年來，有關長方案GnRH-a導致的內源性LH水平過低對卵母細胞質量、受精率、優(yōu)質胚胎數及種植率等造成不良影響的問題引起輔助生殖界的關注。研究發(fā)現，LH水平過低顯著降低了子宮內膜間質細胞中內膜容受性標志物同源基因A(homebox,HOXA10)水平的表達，影響子宮內膜的容受性，降低了胚胎的著床率及臨床妊娠率，使流產率增加。另外，LH可刺激并促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達,當LH處于低水平時，卵泡液中的VEGF水平降低，導致卵泡周圍血管的微循環(huán)形成不足，引起卵母細胞及顆粒細胞的氧供不足，改變了紡錘體的結構，導致同源姐妹染色體在減數第一次分裂時不分離，造成染色體異常、卵母細胞的受精能力降低及早期胚胎發(fā)育障礙[5-6]。根據兩細胞兩促性腺激素學說，卵泡的生長發(fā)育成熟離不開促性腺激素，FSH直接促進竇前卵泡及竇卵泡顆粒細胞增殖與分化，促使卵泡生長。LH與LH受體結合后利用膽固醇合成孕激素，轉化為雄激素，為雌激素的形成提供底物；另外，LH增加顆粒細胞對FSH的敏感性，促進卵泡募集。近年來研究顯示，在直徑為3～10 mm的卵泡中，80%的卵泡顆粒細胞已有LH受體的表達[7]，表明在更小的竇卵泡階段顆粒細胞上已經存在有功能的LH受體，且與卵泡液內的雌激素、雄激素、AMH、抑制素B相關，這一研究的結論，使得兩細胞兩促性腺激素學說得到擴展。

多項研究和薈萃分析顯示，在體外受精(invitrofertilization,IVF)刺激周期中，添加LH對增加卵母細胞的成熟度、改善胚胎質量有著重要的作用，因此，理論上添加外源性LH制劑可彌補內源性LH的不足[8-11]。研究表明，在促排卵過程中，對于降調后Gn啟動日血清LH水平較低的卵巢反應性正?；颊撸砑觬-LH可降低HCG日血清P水平，而高孕酮水平可能會造成新鮮周期胚胎移植的活產率降低[12-13]，這可能是因為高P提前使子宮內膜過早轉化為分泌期，種植窗口前移，造成內膜與胚胎發(fā)育不同步。對于臨床妊娠率來說，國內學者認為，在促排卵中后期添加r-LH與添加HMG相比可獲得較高的臨床妊娠率[14]；REVELLI 等[15]研究表明，當獲卵數>8個時，接受r-LH治療的患者臨床妊娠率和活產率會更高。李頌軍等[16]研究發(fā)現，添加r-LH可減少Gn使用時間和總量，增加頂級優(yōu)質胚胎數，臨床妊娠率和活產率有增高趨勢。但是有學者認為，對于垂體降調后低LH水平的患者添加外源性LH并無臨床意義[17]。國外一項薈萃分析表明，低基礎LH水平(1.0 U·L-1)的婦女妊娠率并不比GnRH-a降調后LH水平保持正常的婦女低，且補充r-LH組與未補充r-LH組患者的臨床妊娠率比較差異無統(tǒng)計學意義；而對于低反應的患者及36～39歲患者補充r-LH似乎是有益的[10]。XIA等[18]研究證實，對于降調后LH<0.75 U·L-1患者，生化妊娠率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率與體內LH水平無關。本研究結果顯示，r-LH組患者Gn使用時間、添加LH日血LH水平、HCG注射日P水平低于HMG組，HCG注射日LH水平高于HMG組，且r-LH組患者優(yōu)質胚胎率顯著高于HMG組；這一結果提示，與添加HMG相比，添加r-LH后可使內源性LH水平顯著增加，從而顯著降低凋亡相關因子VEGF水平、減少顆粒細胞凋亡，促使卵母細胞減數分裂，完成第一極體的排出，從而增加優(yōu)質胚胎的獲得，且縮短了Gn使用時間，臨床上應用更安全[19]。

綜上所述，早卵泡期長效長方案中垂體降調后LH低水平的患者添加r-LH與添加HMG相比，可顯著提高內源性LH水平和優(yōu)質胚胎率，減少Gn使用時間；但二者對種植率、臨床妊娠率的影響并無差異，這需要進一步研究予以證實。