MCM蛋白在消化系統(tǒng)腫瘤的研究進(jìn)展

商昌權(quán) 李國(guó)東 魏九峰 綜述 劉明 校審

微小染色體維持(Minichromosome maintenance，MCM)蛋白是由MCM基因編碼，由六個(gè)相關(guān)蛋白組成(MCM2～MCM7)的蛋白家族。MCM蛋白家族各成員的分子質(zhì)量大小不一，多由776～1 017個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。MCM蛋白家族成員間有很高的序列相似性，在DNA的復(fù)制過(guò)程中，MCM蛋白使一個(gè)細(xì)胞周期中DNA復(fù)制僅出現(xiàn)一次[1]。MCM蛋白與腫瘤密切相關(guān)[2]，MCM蛋白有成為新的腫瘤標(biāo)記物的可能性，靶向MCM蛋白可能會(huì)成為新的治療策略[3]。

1 MCM蛋白

1.1 MCM蛋白的結(jié)構(gòu)

MCM蛋白主要由ATP酶AAA+亞類結(jié)構(gòu)組成。最早發(fā)現(xiàn)包括MCM2、MCM3、MCM4(CDC21)、MCM5(CDC46)、MCM6(MIS5)、MCM7(CDC47)，各個(gè)蛋白都具有特征性的ATPase結(jié)構(gòu)域，它們六個(gè)的保守亞基相連構(gòu)成異六聚體結(jié)構(gòu)，是真核DNA復(fù)制所必需的。隨著深入研究還發(fā)現(xiàn)了MCM8、MCM9、MCM1和MCM10。MCM蛋白家族成員有高度的同源性，都擁有一個(gè)約200多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的區(qū)域，被稱為MCM盒(MCM1和MCM10不擁有)[4]。MCM1和MCM10盡管被納入MCM蛋白家族，且也參與DNA的復(fù)制，但它們與MCM2-7蛋白并不存在同源性[5]。MCM盒包括Walker-A模序、Walker-B模序及丙氨酸結(jié)構(gòu)。MCM2、MCM4、MCM6、MCM7在Walker-B模序之后均有一個(gè)精氨酸鋅指模序[6]，MCM蛋白C端有WH結(jié)構(gòu)域，N端可延伸，可聯(lián)合DNA并調(diào)節(jié)其極化、螺旋程序，所以MCM蛋白家族多以復(fù)合物的形式存在，如MCM4/MCM6/MCM7三聚體、MCM2/MCM4/MCM6/MCM7四聚體、MCM2～7六聚體等[7]。

1.2 MCM蛋白的功能

MCM蛋白在靜息細(xì)胞中不表達(dá)，在有絲分裂開始時(shí)升高，在G1/M期下降。MCM蛋白與其他物質(zhì)協(xié)同作用于DNA，形成復(fù)制分叉，參與DNA的合成。在有絲分裂細(xì)胞中，DNA復(fù)制程序的開始分為：(1)復(fù)制前復(fù)合物的構(gòu)造：在有絲分裂晚期至G1初期，起始識(shí)別復(fù)合體與基因的啟動(dòng)子結(jié)合，將MCM2～7六聚體聯(lián)合到DNA復(fù)制的起始點(diǎn)組成復(fù)制前復(fù)合物；(2)形成具有復(fù)制活性的復(fù)制叉：到S期時(shí)，復(fù)制前復(fù)合物被細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶及CDC7/DBF4激酶(DDK)活化后，MCM蛋白復(fù)合物具有解螺旋酶活性，在復(fù)制起始點(diǎn)將雙股DNA鏈打開，形成雙向復(fù)制叉，DNA開始復(fù)制[8]。MCM2可能具有促進(jìn)DNA復(fù)制的功能，使復(fù)制前復(fù)合物與染色質(zhì)分離，負(fù)反饋抑制DNA的再次合成，從而對(duì)DNA的復(fù)制進(jìn)行精確調(diào)控[9]。MCM4的鋅指結(jié)構(gòu)參與了三聚體的亞基相互作用，MCM6在ATP結(jié)合過(guò)程發(fā)揮重要作用，MCM7通過(guò)與其他亞基相互作用來(lái)促進(jìn)MCM蛋白復(fù)合物的DNA解旋酶活性[6]。MCM8、MCM9形成復(fù)合物參與DNA同源重組，具有抵抗DNA損傷的作用[10]。MCM1通過(guò)與Bck2相互作用，激活細(xì)胞周期所需的初始基因組[11]，MCM10的C端與MCM2～7六聚體結(jié)合并相互作用，參與CMG復(fù)制解旋酶的激活[12]。

2 MCM蛋白與消化系統(tǒng)腫瘤

2.1 食管癌

黃曉平等[13]發(fā)現(xiàn)MCM4在正常上皮中不表達(dá)或弱表達(dá)，在食管惡性病變中表達(dá)明顯高于正常上皮，并且與早期食管惡性腫瘤相比，MCM4在晚期食管惡性腫瘤組織表達(dá)量有明顯上升趨勢(shì)。Choy等[14]研究了食管腺癌、鱗癌和癌前病變中MCM4和MCM7的表達(dá)與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出MCM4、MCM7和Ki-67平均表達(dá)率依次為鱗狀上皮(5.5%、7.3%和5.9%)、柱狀細(xì)胞化生(11.2%、13.5%和3.4%)、Barrett食管(27.7%、35.3%和8.3%)、低度不典型增生(42.6%、52.2%和12.9%)、高度不典型增生(63.2%、77.7%和29.6%)、腺癌(61.3%、75.5%、24.5%)、鱗癌(74.1%，85.4%和36.3%)。MCM4和MCM7表達(dá)率明顯高于Ki-67表達(dá)率，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MCM4的較高表達(dá)與腺癌組的淋巴結(jié)惡性變和較短的生存期存在關(guān)聯(lián)。MCM4可能成為評(píng)價(jià)食管病變的敏感的標(biāo)志物。

Sirieix等[15]探討了MCM2預(yù)測(cè)Barrett′s食道、食道腺癌危險(xiǎn)性的可行性。MCM2蛋白在正常食道、胃和十二指腸的管腔表面均未檢測(cè)到。在Barrett′s食道中，食道上皮細(xì)胞中MCM2蛋白與異型增生程度高度關(guān)聯(lián)(P<0.0001)。在食道腺癌的患者中，異型增生前活檢組織中MCM2蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組(陽(yáng)性細(xì)胞平均表達(dá)率分別為28.4%和3.4%，P<0.0001)。在前瞻性隊(duì)列中，異型增生或食道腺癌的組織病理診斷與MCM2蛋白陽(yáng)性刷檢的符合率為91%(P<0.005)，與回顧性研究中MCM2蛋白表面表達(dá)的例數(shù)相關(guān)(P<0.0001)。Huang等[16]評(píng)估MCM2蛋白作為生物標(biāo)志物的潛力，將其與增殖細(xì)胞核抗原和Ki-67在食管鱗癌人群中進(jìn)行比較。與增殖細(xì)胞相關(guān)抗原和Ki-67相比，MCM2蛋白檢測(cè)食管異型增生的敏感性和特異性更高。MCM2蛋白可用于異型增生和食道腺癌的檢測(cè)，也可用于檢測(cè)有可能發(fā)展為異型增生和食道腺癌的患者。MCM2蛋白免疫染色結(jié)合表面刷檢在人群中篩查食管癌高?；颊呖赡苁怯袃r(jià)值的。

2.2 胃癌

Liu等[17]用Ki-67、MCM2蛋白和PCNA抗體對(duì)胃癌和相應(yīng)的癌前病變組織進(jìn)行免疫染色。發(fā)現(xiàn)癌前病變組織中90%表達(dá)MCM2蛋白，而Ki-67和PCNA分別表達(dá)67%和80%。MCM2蛋白預(yù)測(cè)癌變的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值分別為90%和87%。Ki-67和PCNA的標(biāo)記指數(shù)(LI)較低。LI(MCM2)，LI(PCNA)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和GCC分級(jí)之間存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。MCM2表達(dá)增加與總體生存率和無(wú)病生存率降低相關(guān)(P<0.05)。榮芳等[18]發(fā)現(xiàn)淺表性胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎和胃惡性腫瘤中的MCM4表達(dá)依序升高。MCM4可以分辯正常組織、不典型增生組織和腫瘤組織。Giaginis等[19]在對(duì)66例胃腺癌患者腫瘤標(biāo)本研究中發(fā)現(xiàn)MCM5的表達(dá)與腫瘤大小(P=0.0295)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0216)和腫瘤組織學(xué)分期(P=0.0098)明顯關(guān)聯(lián)。MCM5高表達(dá)病人生存期明顯縮短(P=0.0042)，MCM5的高表達(dá)與胃腺癌病人臨床病理存在相同趨勢(shì)，與較短存活時(shí)間存在聯(lián)系。譚寧平等[20]在84例胃癌組織及癌旁正常組織中發(fā)現(xiàn)MCM8在胃癌組織中的陽(yáng)性率為92.9%，在癌旁正常組織中陽(yáng)性率為45.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。MCM8在胃癌組織中的異常表達(dá)與組織分化程度及浸潤(rùn)深度相關(guān)(P<0.05)，在胃癌組織中表達(dá)陽(yáng)性者總生存期低于陰性者(P<0.05)。Guo等[21]通過(guò)使用ONCOMINE、GEPIA2、UALCAN、癌細(xì)胞系百科全書(CCLE)人類蛋白圖譜、Kaplan-Meier繪圖儀、cBioPortal、GeneMANIA和MMP發(fā)現(xiàn)MCM1/5/7是胃癌患者精確治療的潛在目標(biāo)，MCM4/6/9是胃癌預(yù)后的新生標(biāo)志物。MCM蛋白有作為胃癌中的診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

Wei等[22]發(fā)現(xiàn)MCM7在9個(gè)胃腺癌細(xì)胞系中均呈表達(dá)升高。MCM7蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)高于相應(yīng)的非腫瘤胃組織。在彌漫型胃腺癌中，MCM7蛋白表達(dá)與年齡高、疾病特異性生存差有關(guān)，與腫瘤分級(jí)、分期、淋巴結(jié)惡性變等臨床病理因素?zé)o關(guān)，MCM7蛋白高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，說(shuō)明MCM7蛋白的表達(dá)有可能成為彌漫型胃腺癌的生物標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)；在正常胃上皮組織中，MCM7蛋白僅在增殖期間表達(dá)。用siRNA敲除胃惡性腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)GS和NCI-N87中MCM7蛋白可明顯抑制細(xì)胞增殖，減少單層集落形成，細(xì)胞侵襲能力衰減，促進(jìn)晚期凋亡。RNA干擾可抑制MCM7蛋白在胃癌中的致瘤性，也可能會(huì)成為新的治療靶點(diǎn)。

2.3 肝癌

Liu等[23]研究MCM參與肝癌的發(fā)生和肝細(xì)胞癌的預(yù)后。定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)用于105個(gè)樣品(正常肝15個(gè))，肝硬化肝(40個(gè))和肝細(xì)胞癌(50個(gè))中，并鑒定出MCM2-7、MCM8和MCM10在肝癌中顯著上調(diào)，MCM6獨(dú)立預(yù)測(cè)了175例肝細(xì)胞癌患者的生存期，表達(dá)量越高，生存期越短，MCM6被認(rèn)為是S/G2細(xì)胞周期進(jìn)程的驅(qū)動(dòng)力，也是肝細(xì)胞癌中潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

Yan等[24]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)MCM3、MCM4在肝細(xì)胞中的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞周期的抑制，從而達(dá)到抑癌的作用，為肝癌的化學(xué)防治提供依據(jù)。Nan等[25]探討了細(xì)胞周期途徑基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。調(diào)查新診斷肝細(xì)胞癌1 127例病例和1 200例非腫瘤患者的相關(guān)人口學(xué)、行為信息及血液學(xué)資料進(jìn)行分層分析。最終發(fā)現(xiàn)MCM4可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。Liao等[26]利用生物信息學(xué)方法對(duì)MCM基因的生物學(xué)功能進(jìn)行研究，使用GSE14520和腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌患者數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MCM2～7基因在DNA復(fù)制和細(xì)胞周期中顯著富集，并共表達(dá)，MCM2-7基因在腫瘤組織中的表達(dá)增加；在GSE14520隊(duì)列中的生存分析表明，MCM2、MCM4、MCM5和MCM6的表達(dá)與乙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌總生存期(OS)顯著相關(guān)，在GSE14520隊(duì)列中，MCM基因與無(wú)復(fù)發(fā)生存率無(wú)關(guān)。TCGA的驗(yàn)證隊(duì)列提示MCM2、MCM6和MCM7的表達(dá)與肝細(xì)胞癌OS顯著相關(guān)。由此可知MCM2-7基因可能是肝癌病人潛在的診斷生物標(biāo)志物。MCM2和MCM6或許是肝細(xì)胞癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

2.4 大腸癌

Ishibashi等[27]探討了MCM在結(jié)直腸惡性病變中的表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在Dukes A和B期患者中，MCM7陽(yáng)性和陰性患者的OS和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(RFS)均無(wú)明顯不同；在Dukes C期患者中，與MCM7陰性相比，MCM7陽(yáng)性患者的OS和RFS明顯更差。Nishihara等[28]對(duì)5種人大腸癌細(xì)胞系進(jìn)行了蛋白質(zhì)印記分析，并對(duì)202例手術(shù)切除的DukesB、C期大腸癌組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記，以鑒定MCM陽(yáng)性而Ki-67陰性的腫瘤細(xì)胞。5種細(xì)胞系均檢測(cè)到MCM蛋白。MCM7和MCM2在幾乎相同的腫瘤細(xì)胞群中共表達(dá)，而MCM7陰性但Ki-67陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞在雙標(biāo)標(biāo)本中除有絲分裂細(xì)胞外均無(wú)表達(dá)。多因素Cox回歸分析表明，MCM7高、中位LI>58.1%是獨(dú)立預(yù)后因素(RR=2.12，P=0.02)。以上證明MCM7有作為大腸癌預(yù)后相關(guān)腫瘤標(biāo)記物的潛力。

Giaginis等[29]從96例結(jié)腸癌組織切片上進(jìn)行MCM2和MCM5的免疫組織化學(xué)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MCM2與腫瘤組織學(xué)分級(jí)(P=0.003)、是否淋巴結(jié)惡性變(P=0.003)、腫瘤惡性程度(P=0.029)、血管侵犯(P=0.010)顯著相關(guān)，MCM2的表達(dá)與Dukes分期有關(guān)(P=0.005)，未發(fā)現(xiàn)MCM5與這些病理性狀顯著相關(guān)。MCM2和MCM5存在相關(guān)性(r=0.745，P<0.001)與Ki-67呈顯著正相關(guān)(r=0.963，r=0.738，P<0.001)。以上說(shuō)明MCM2與MCM5均與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖相關(guān)，只發(fā)現(xiàn)MCM2蛋白與結(jié)腸癌患者的重要臨床病理密切相關(guān)。

Scarpini等[30]對(duì)54個(gè)肛門組織樣本進(jìn)行了初步的免疫組織化學(xué)研究，并使用144例受試者的235個(gè)肛門細(xì)胞樣本進(jìn)行獨(dú)立前瞻性隊(duì)列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從正常肛門上皮到肛門上皮瘤變(AIN)到肛門鱗狀細(xì)胞癌(SCC)過(guò)程中，MCM2和MCM5的表達(dá)增高，包括在肛拭子采集的大部分細(xì)胞來(lái)源的淺表上皮第三層。AIN2/3和SCC中MCM2和MCM5的中位LI分別為90.2%和84.0%。MCM蛋白能夠提高肛周細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中AIN和SCC檢出率。MCM蛋白是惡性表型和癌前病變的細(xì)胞進(jìn)入非調(diào)控周期的準(zhǔn)確標(biāo)志物。

2.5 胰腺膽管癌

Abe等[31]為提高內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)(ERCP)刷檢細(xì)胞學(xué)診斷腺癌和反應(yīng)性上皮改變的敏感性，對(duì)53例患者(良性13例，惡性40例)的ERCP標(biāo)本進(jìn)行MCM2和p53的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，MCM2的LI為25%，p53的LI為10%。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MCM2和p53的敏感性分別為90%和68%(P<0.05)。Margaret等[32]前瞻性地將97例膽管狹窄患者納入研究，其中50例為惡性狹窄，在ERCP上采集膽刷標(biāo)本檢測(cè)MCM5，惡性腫瘤的敏感性為65.4%，細(xì)胞學(xué)的敏感性為25.0%。在72例膽刷細(xì)胞學(xué)與MCM5配對(duì)檢測(cè)的患者中，MCM5檢測(cè)惡性腫瘤的敏感性(55.6%vs.25.0%，P=0.0002)有所提高。說(shuō)明MCM蛋白在ERCP刷檢細(xì)胞學(xué)診斷胰膽惡性腫瘤可能有臨床應(yīng)用前景。

Liao等[33]從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得112例接受胰十二指腸切除術(shù)的早期胰腺導(dǎo)管腺癌患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集。通過(guò)搜索公共數(shù)據(jù)庫(kù)，觀察到MCM蛋白(MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7)在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且它們之間存在強(qiáng)陽(yáng)性共表達(dá)，其中MCM4可能是通過(guò)參與DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、腫瘤蛋白p53和Notch信號(hào)通路等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和途徑，從而影響胰腺導(dǎo)管腺癌患者的預(yù)后。Peng等[34]根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提供的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)MCM1-10在胰腺癌中普遍存在，MCM2、4、6、8和10的過(guò)表達(dá)與較短的無(wú)病生存期顯著相關(guān)，而MCM2、4、8和10的過(guò)度表達(dá)與OS較短相關(guān)。MCM蛋白可能被視為胰腺癌相關(guān)預(yù)后和治療的標(biāo)志物。

綜上所述，通過(guò)MCM蛋白在人消化系統(tǒng)腫瘤中的研究，證明MCM蛋白能反映細(xì)胞增殖能力。可通過(guò)MCM的表達(dá)效果來(lái)區(qū)分正常組織、不典型增生組織和腫瘤組織。MCM可作為一種特殊的細(xì)胞增殖標(biāo)記物，在臨床消化系統(tǒng)腫瘤的早期診斷、分級(jí)及預(yù)后等方面發(fā)揮參考作用。

3 小結(jié)與展望

MCM蛋白已經(jīng)引起眾多研究者關(guān)注，在消化系統(tǒng)腫瘤中，MCM蛋白表達(dá)增高。在臨床上檢測(cè)MCM蛋白對(duì)惡性腫瘤的診斷、評(píng)價(jià)預(yù)后、早期篩查有著重要意義，MCM蛋白可能成為一種更具指導(dǎo)意義的標(biāo)志物。MCM蛋白也可能作為抗癌藥物靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兪潜匦璧腄NA復(fù)制因子，在惡性腫瘤細(xì)胞和癌前細(xì)胞中高表達(dá)，但在分化的體細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[35]。目前缺乏惡性腫瘤中MCM蛋白作用機(jī)制的相關(guān)研究，王蕾等[36]成功構(gòu)建MCM6重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了重組蛋白表達(dá)，為我們將來(lái)進(jìn)一步研究MCM蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、MCM家族各蛋白間及細(xì)胞增殖期間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)，為腫瘤發(fā)生發(fā)展、治療、預(yù)后等方面提供了更為廣闊的思路。