傷口愈合過程中的干細胞動態(tài)變化

張慧聰，周文翹，章婷婷，胡常紅

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院全口義齒診療室/口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室/重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室，重慶，401147)

1 平衡狀態(tài)下的皮膚干細胞

皮膚損傷的修復(fù)需要一系列過程，包括止血、血管生成、再上皮化和細胞外基質(zhì)重塑。這其中有許多皮膚干細胞的參與，包括毛囊間表皮干細胞、毛囊干細胞、毛囊漏斗部細胞、皮脂腺導(dǎo)管細胞等。這些細胞在傷口發(fā)生時，可以轉(zhuǎn)變?yōu)楸砥じ杉毎?，加速傷口的愈合并且促進皮膚附屬器的再生。譜系分析表明，皮膚中的新生毛囊是來自于毛囊干細胞小生境之外的表皮細胞，即毛囊間表皮，這表明傷口中的表皮干細胞具有毛囊干細胞的表型。毛囊間表皮由單層增殖性基底細胞和數(shù)層分化的非增殖性細胞組成?；准毎梢宰鳛榻K末分化的角質(zhì)形成細胞的補充細胞。在小鼠模型中，基底細胞遷移到皮膚表面大約需要1周的時間，而補充整個毛囊間表皮需要大約1個月的時間[1]。早期的增殖動力學(xué)實驗表明，毛囊間表皮是由包含干細胞和祖細胞的小增殖單位維持。毛囊間表皮穩(wěn)態(tài)是由一群定向祖細胞維持的，它們以隨機的方式平衡更新和分化[2,3]。但是，進一步的研究表明毛囊間表皮干細胞可以維持更加靜止的狀態(tài)，持續(xù)時間更長，并且可以產(chǎn)生循環(huán)更短，壽命更短的祖細胞[4]。

2 傷口愈合過成中的干細胞

皮膚組織具有替換凋亡細胞和治愈傷口的天然能力。這種能力存在于常駐干細胞當中，它們會在皮膚表皮和其附屬器受到來自外部環(huán)境的日常襲擊時，保持穩(wěn)態(tài)并在受傷后進行自我更新，保存和修復(fù)[5]。在傷口愈合過程中，干細胞被激活并向不同的皮膚區(qū)域遷移。在修復(fù)過程中皮膚干細胞會瞬時失去譜系限制和空間限制，從而允許多個表皮干細胞發(fā)揮作用[6]。

毛囊干細胞位于毛囊凸起處，受傷后，毛囊干細胞會從毛囊凸起處迅速遷移到傷口，這將有助于表皮的修復(fù)。稀薄的毛囊干細胞在傷口愈合過程中具有很高的可塑性，與其在移植后的最終結(jié)果相似[7]。但是Cotsarelis[8]等人在小鼠受傷前將毛囊干細胞進行標記，然后建立皮膚缺損模型，之后觀察到毛囊干細胞遷移到傷口中心，但這種現(xiàn)象并沒有持續(xù)存在，最終只有3%的新生毛囊是被標記的。這說明了非毛囊干細胞是新生毛囊的主要來源。為了進一步研究再生毛囊的起源細胞，使用了Krt1-15-CrePR *;R26R轉(zhuǎn)基因小鼠，在受傷之前將大約70%的毛囊干細胞和50%的非毛囊凸起的表皮細胞標記，受傷后，大約一半的再生毛囊擁有表達lacZ的細胞（非毛囊凸起的表皮細胞的標記物），表明新的毛囊形成需要多種表皮細胞[8]。這些研究表明新的毛囊起源于毛囊干細胞生態(tài)位以外的細胞。

對毛囊間表皮干細胞的克隆分析表明，在小鼠尾巴皮膚損傷后，毛囊間表皮干細胞會被募集到傷口處，可以幫助表皮修復(fù)并持續(xù)長達35天[4]。但是，從長遠來看，毛囊間表皮干細胞群體僅在其起源區(qū)域長期存在，而不會在傷口愈合過程中其所遷移到的位置長期存在。這些觀察結(jié)果表明，在修復(fù)過程中，所有基底細胞均表現(xiàn)出一定程度的可塑性，基底細胞雖然可以在傷口發(fā)生時迅速遷移到傷口中心促進傷口的愈合，但基底細胞最終會保留其原始位置的記憶，而長期停留在原始位置。與毛囊干細胞相似，毛囊峽部表達Lrig1和Lgr6的干細胞在受傷后會動員起來，并且可能比毛囊干細胞活化得更快。但毛囊干細胞在再生過程中會迅速丟失，僅用作瞬時繃帶，使毛囊間表皮和毛囊峽部/漏斗部中的其他干細胞能夠長期維持修復(fù)狀態(tài)[9]。在表皮損傷后，來自凸起的干細胞被募集到表皮中，并以線性方式向傷口中心遷移，最終形成明顯的放射狀。值得注意的是，盡管凸起處的細胞也具有表皮表型，但多數(shù)在數(shù)周內(nèi)從表皮中清除，這表明凸起處的干細胞通過對急性傷口產(chǎn)生短時的“瞬時擴增”效應(yīng)以應(yīng)對皮膚傷口的急性修復(fù)。無毛的皮膚（例如爪子的腹側(cè)或掌側(cè)）會比人的皮膚動力學(xué)愈合發(fā)生的更慢，這表明毛囊干細胞對于傷口的愈合是必不可少的[10]?？偠灾蓜?chuàng)傷所產(chǎn)生的皮膚缺損可廣泛激活干細胞，使其呈現(xiàn)出不同于其穩(wěn)態(tài)作用的特征。

3 傷口愈合過程中的干細胞的招募，遷移

通常表皮損傷后角質(zhì)形成細胞增殖增加。有趣的是，在傷口邊緣未觀察到細胞的增殖，而是在傷口周圍，距邊緣0.5-1.5 mm處的增生區(qū)處觀察到增殖[11,12]。在傷口的最前沿，角質(zhì)形成細胞不會增殖，而是以細胞片的形式遷移[11,12]。表皮細胞在受傷后12小時內(nèi)開始遷移到傷口床中。受傷后的第二天，靠近傷口的毛囊間表皮細胞朝著傷口的方向呈細長形，并且處于靜止狀態(tài)，而遠處的細胞開始增殖。在這個區(qū)域之間，可以觀察到包含遷移細胞和增殖細胞的混合區(qū)域。在這個混合區(qū)域中，基底細胞向傷口拉長，并在該方向定向分裂。在表皮中，最初存在于前緣的細胞會平行于傷口的方向而被拉長，這表明細胞會主動遷移，但在傷后2-4天呈垂直方向，這可能是因為它們被后面的細胞推動和壓縮[11]?？偠灾@些觀察結(jié)果提示，在受傷后的前沿首先會發(fā)生細胞遷移，接著該區(qū)域中的細胞移位會觸發(fā)細胞的定向分裂。細胞增殖的增加本身可以產(chǎn)生更多的遷移細胞，這些遷移細胞隨后將前沿推向傷口中心。

受傷后的第四天，前沿細胞被壓縮并上調(diào)促進炎癥和再生的特定基因的表達。最前沿的細胞瞬時表達較高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶，促炎分子，控制細胞骨架的基因，微管和肌動蛋白，ECM配體和細胞粘附分子，例如整聯(lián)蛋白α5。前沿的恒定大小及其與傷口大小或皮膚區(qū)域的獨立性表明，控制標記物的表達信號是局部的，并可能在表皮內(nèi)的細胞之間傳播。前沿可以充當瞬時支架，實現(xiàn)和諧的傷口愈合。通過分泌更高水平的蛋白質(zhì)來控制ECM重塑和血凝塊溶解，傷口前沿可能會促進組織的再生朝傷口中心發(fā)展，并保護干細胞及其后代免受組織重塑[13]。

4 干細胞的種群動態(tài)

在穩(wěn)態(tài)過程中，毛囊間表皮細胞在種群水平上不對稱分裂，以維持恒定數(shù)量的表皮細胞[14]。然而，在傷口愈合期間，需要增加細胞數(shù)量以補償丟失的細胞，直到重新上皮化的完成?？梢酝ㄟ^增加對稱性更新或減少細胞分化的比例來實現(xiàn)過度更新，而不是過度分化。對K14-CreER（毛囊間表皮細胞和祖細胞）和Lrig1-CreER（漏斗干細胞）小鼠品系的克隆分析表明，單個毛囊間表皮或漏斗細胞（基底層和基底層以上）產(chǎn)生的標記細胞條紋向著傷口中心[11]。不管它們的最初位置如何，傷口似乎都能誘導(dǎo)少量干細胞的活化。

5 干細胞可塑性

當來自毛囊和毛囊漏斗部的干細胞在受傷時被募集到毛囊間表皮時，它們逐漸失去其最初的特性，而被重新編程為毛囊間表皮干細胞的命運[9]。然而造成這種可塑性的分子機制仍不完全清楚。在比較受傷的毛囊間表皮和穩(wěn)態(tài)中的毛囊干細胞和毛囊間表皮干細胞的染色質(zhì)分布時，受傷的毛囊間表皮在毛囊干細胞和毛囊間表皮干細胞之間表現(xiàn)出雜交特征，其中開放的染色質(zhì)區(qū)域富含毛囊間表皮干細胞（Klf5）和毛囊干細胞（Sox9）轉(zhuǎn)錄因子。這個混合階段似乎確保了表皮屏障的正確重建[15]。這種混合狀態(tài)在修復(fù)過程中是短暫的，但在皮膚癌中持續(xù)存在的[15,16]。

受傷后分化的表皮細胞能夠恢復(fù)到干細胞狀態(tài)[17,18]，這在氣道上皮中也觀察到此類現(xiàn)象。但是，基底毛囊間表皮細胞的譜系追蹤表明，這些細胞在傷口愈合條件下不能再次回到基礎(chǔ)狀態(tài)[11,12]。相反，位于毛囊峽部的表達Gata6的細胞在穩(wěn)態(tài)條件下會產(chǎn)生皮脂腺管，可在傷口愈合期間動員并向受損的毛囊間表皮遷移，并從分化的干細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛赘杉毎鸞19]。這種損傷不會在受傷后立即發(fā)生，因為基底細胞需要幾天的時間才能進入基底層并進行干細胞重編程[19]。與皮膚相似，腸道上皮中負責(zé)終末分化的細胞也可以恢復(fù)為祖細胞樣狀態(tài)，并在損傷后促進組織修復(fù)[20]。但是，需要腸道干細胞來確保電離輻射后的組織修復(fù)[21]，這表明，盡管定向祖細胞具有恢復(fù)干細胞的能力，但正常的組織駐留干細胞對于修復(fù)仍然至關(guān)重要。

創(chuàng)傷程度還可以影響細胞的可塑性。在相對較小的傷口中，皮膚重新上皮化而沒有重新形成毛囊，而在大傷口中則明顯出現(xiàn)了重新發(fā)育的毛囊。譜系追蹤證實，這些重新發(fā)育的毛囊不是源自毛囊干細胞，而是源自毛囊間表皮細胞[13]。這類似于胚胎發(fā)育過程中毛囊的形態(tài)發(fā)生。

6 展 望

在過去的十年中，已將皮膚傷口愈合的重點放在了細胞療法上，包括將各種細胞和生物活性因子摻入到支架中實現(xiàn)細胞-細胞和細胞-基質(zhì)的相互作用，從而實現(xiàn)完整的組織再生。關(guān)于傷口愈合還應(yīng)致力于借助尖端技術(shù)和分子信號傳導(dǎo)途徑的知識，進一步激勵研究人員將來開發(fā)有效的傷口護理療法。最近出現(xiàn)的新技術(shù)展現(xiàn)了傷口特異性治療方法的新途徑和策略。各種基因編輯工具，材料科學(xué)工程學(xué)和跨學(xué)科科學(xué)的共同努力，對改變當前情況具有巨大潛力。隨著生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的新技術(shù)發(fā)展，皮膚再生和修復(fù)的持續(xù)改進正在以更快的速度進行。再生醫(yī)學(xué)及其相關(guān)臨床研究的未來趨勢可能會為新的治療方法打開大門，這可能會帶來傷口的無痛，快速和無疤愈合。