微小RNA 在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究進展

曹敏，張廣美

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是育齡期女性最常見的婦科疾病之一，據(jù)估計EMs 在育齡期婦女中發(fā)病率為10%～15%[1]，其特征為有活性的子宮內(nèi)膜組織（腺體或間質(zhì)）種植于子宮腔以外的部位，臨床上通常表現(xiàn)為疼痛、不孕、性交不適、月經(jīng)異常、消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)異常等癥狀，雖為良性疾病卻在行為學(xué)上表現(xiàn)為惡性生物學(xué)特征。盡管有幾種假說試圖解釋EMs 的發(fā)生原因，但根本機制仍不清晰，并不能解釋90%的女性存在經(jīng)血逆流現(xiàn)象而僅有10%左右發(fā)展為EMs，預(yù)示著EMs 的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在著其他調(diào)控機制。最近，微小RNA（microRNA，miRNA）在EMs 的發(fā)病機制中起到的作用日益引起重視。miRNA 是一類長約22 個堿基的內(nèi)源性非編碼RNA 分子，通過不完全堿基互補的方式與靶基因mRNA 的3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）結(jié)合，完成對靶基因mRNA 的抑制、關(guān)閉，進而實現(xiàn)對基因的負調(diào)控作用[2]。有研究檢測到EMs 患者的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜、血清中miRNA的表達與正常女性均存在差異，現(xiàn)就miRNA 與EMs的病理生理學(xué)研究新進展進行綜述。

1 miRNA調(diào)節(jié)細胞的增殖和凋亡

細胞的增殖與凋亡受多種基因的復(fù)雜調(diào)節(jié)，任何一方失控都能導(dǎo)致機體功能障礙和疾病發(fā)生，異常增殖及凋亡抑制是EMs 異位病灶在盆腔內(nèi)存活甚至發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要因素，以下miRNA 均有可能參與這些基因的調(diào)控與表達。

1.1 miR-503Hirakawa 等[3]通過結(jié)合亞硫酸氫鈉變性的限制性酶分析（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位囊腫基質(zhì)細胞（endometriotic cyst stromal cells，ECSCs）受到DNA 超甲基化影響而出現(xiàn)miR-503 表達下降。將miR-503轉(zhuǎn)染到ECSCs 中，發(fā)現(xiàn)miR-503 可通過抑制細胞周期蛋白D1 并誘導(dǎo)G0/G1 期的細胞周期停滯抑制細胞增殖，通過抑制B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因促進細胞凋亡。Bcl-2 是在子宮內(nèi)膜和基質(zhì)均表達的一種原癌基因，具有重要的抑制凋亡作用。文曉鳳等[4]用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)Bcl-2 表達水平在子宮內(nèi)膜增殖期增加，在分泌期降低，異位內(nèi)膜組織較正常內(nèi)膜組織中的Bcl-2 表達明顯增加，這些差異性表達為異位內(nèi)膜組織中miR-503 低表達致Bcl-2 水平升高而抑制凋亡的猜想提供了依據(jù)。Taghavipour 等[5]認為Bcl-2 的這種抑制凋亡作用主要通過抑制促凋亡蛋白[如Bcl 相關(guān)的X 蛋白（Bax）、Bcl 樣蛋白（Bcl-X）和Bcl-2 同源拮抗物（Bak）等]發(fā)揮作用。Lai 等[6]通過電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技術(shù)證實了Bax 在促進凋亡方面的重要性，當細胞受到各種因素刺激后，Bax 等在凋亡過程中被激活，從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移到線粒體外膜并寡聚，使線粒體外膜發(fā)生實質(zhì)性結(jié)構(gòu)變化，實現(xiàn)線粒體外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），使線粒體釋放的凋亡因子通過而觸發(fā)凋亡。

1.2 其他miRNA研究證實多種miRNA 參與異位子宮內(nèi)膜細胞增殖，并在EMs 患者中差異表達。Zhao 等[7]發(fā)現(xiàn)與正常子宮內(nèi)膜相比，EMs 異位內(nèi)膜中孤兒核受體/miR-181c/哺乳動物STE20 樣激酶1（NR4A/miR-181c/Mst1）信號通路發(fā)揮著重要作用，異位內(nèi)膜組織中NR4A/miR-181c 高表達，Mst1 表達量顯著下調(diào)，其中Mst1 具有增強線粒體分裂蛋白Drp1 轉(zhuǎn)錄后Ser616 位點磷酸化、通過p53 抑制Parkin 基因轉(zhuǎn)錄活化和啟動半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Capase9）等作用，激活線粒體分裂和抑制自噬，推測該通路抑制了異位內(nèi)膜細胞凋亡。Hu 等[8]發(fā)現(xiàn)用miR-370-3p 模擬物轉(zhuǎn)染原發(fā)性子宮內(nèi)膜異位細胞會導(dǎo)致類固醇生成因子1（steroidogenic factor-1，SF-1）和其下游靶基因類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）和芳香化酶（CYP19A1）的表達改變，促進異位內(nèi)膜組織凋亡，證實EMs 患者血清中miR-370-3p 水平降低而EMs 病變中SF-1 mRNA 水平上調(diào)，可促進異位內(nèi)膜細胞增殖并抑制其凋亡。

2 miRNA 與細胞黏附及侵襲

脫落的子宮內(nèi)膜細胞需經(jīng)過三重防線進入腹腔，然后在腹膜、盆腔臟器，甚至腎、腦等遠處器官植入并產(chǎn)生功能損害，這與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）防御作用減弱、異位內(nèi)膜細胞黏附侵襲能力增強密切相關(guān)。

2.1 核因子κB（NF-κB）Wu 等[9]證實外源性miR-199a 可在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中靶向抑制NF-κB 激活所需輔因子IκB 激酶β（IKKB），從而抑制NF-κB 活化。多項研究證實miR-199a 在異位子宮內(nèi)膜細胞中表達減少，對NF-κB 的抑制活化作用減弱，影響細胞因子的表達，如白細胞介素10（IL-10）過表達并激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），導(dǎo)致ECM 過度降解，促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的侵襲，證實miR-199a 低表達可使異位子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞（EN-MSCs）在體內(nèi)外均具有較高的細胞侵襲能力[10]。Zheng 等[11]證明異位內(nèi)膜組織中高表達的miR-9-5p 通過NF-κB 通路靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）的表達，促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的侵襲和遷移，通過試驗性調(diào)整miR-9-5p 的表達量，進一步發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞遷移的距離以及進入Transwell小室下腔的細胞數(shù)量與之呈正相關(guān)，從而證明了miRNA 在促進異位內(nèi)膜細胞黏附與侵襲方面的作用。

2.2 其他miRNA異位內(nèi)膜黏附種植于腹腔臟器，并完成侵襲及遠處轉(zhuǎn)移是EMs 重要的惡性特征性表現(xiàn)，是復(fù)發(fā)的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，很多miRNA 發(fā)揮了不可忽視的作用。Wang 等[12]通過體外實驗證實，環(huán)狀RNA circATRNL1 過表達可促進內(nèi)膜細胞的遷移和侵襲，并誘導(dǎo)異位病灶形成，而circATRNL1 的沉默則表現(xiàn)出相反的作用，并進一步解釋其原因為高水平表達的circATRNL1 負向調(diào)控miR-141-3p 和miR-200a-3p，使其共同的下游靶基因yes 相關(guān)蛋白1（yes-associated protein 1，YAP1）過表達，促進異位內(nèi)膜細胞的黏附與侵襲。Mai 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-506-5p 在異位內(nèi)膜組織中高表達并通過抑制WNT 抑制因子1（WNT inhibitory factor 1，WIF1）表達激活Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）途徑，β-catenin 是轉(zhuǎn)錄因子家族的協(xié)同激活因子，與其結(jié)合后可啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞的增殖從而誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細胞的遷移和侵襲。

3 miRNA 與血管生成

EMs 發(fā)病機制尚未明確，多數(shù)學(xué)者認為新生血管生成在脫落子宮內(nèi)膜的異位定植過程中發(fā)揮重要作用，近年來發(fā)現(xiàn)多種miRNA 可以調(diào)控血管生成。

3.1 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）VEGF 是一種高度特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，具有增加血管通透性，促進血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管生成等作用，其中VEGFA 為主要發(fā)揮生物學(xué)作用的一個最關(guān)鍵亞型。Chamorro-Jorganes 等[14]用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)證明miR-16-5p 和miR-424-5p 直接靶向VEGF、VEGF 受體2（VEGFR-2）和成纖維細胞生長因子受體1（FGFR-1），使模擬轉(zhuǎn)染后VEGF、VEGFR-2 和FGFR-1 的表達顯著降低，而這些miRNA 的拮抗劑則表現(xiàn)為相反作用，由此推測這兩種miRNA 在異位內(nèi)膜中的低表達促進內(nèi)皮細胞血管生成。俞田田等[15]用微小RNA 陣列（miRNA array）芯片檢測孕早期妊娠丟失患者蛻膜組織中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p 和miR-29c-3p 差異性表達上調(diào)最為明顯，進一步應(yīng)用靶基因技術(shù)推定兩者均通過對VEGFA 的調(diào)控影響子宮內(nèi)膜蛻膜化血管重塑的過程，參與流產(chǎn)發(fā)生。Ma 等[16]通過研究證實子宮內(nèi)膜異位組織中miR-200b、miR-15a-5p和miR-142-3p 的表達降低，其中miR-142-3p 直接靶 向Krüppel樣因子9（KLF9），KLF9可直接與VEGFA 基因的啟動子結(jié)合，使VEGFA 表達水平升高，腹腔注射miR-142-3p 慢病毒或敲除KLF9 均可顯著抑制新生血管形成，因此，miR-142-3p/KLF9/VEGFA 信號通路可能是減少EMs 患者新生血管形成的潛在治療靶點。

3.2 血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）劉敏娟等[17]通過芯片測序發(fā)現(xiàn)miR-96 在EMs 患者的子宮內(nèi)膜中高表達，且miR-96 可特異性靶向Ang-1 基因的3′UTR 區(qū)，促進Ang-1 的表達，促進血管的重塑、成熟及穩(wěn)定。據(jù)此推測miRNA 可作用于多種靶點，促進子宮內(nèi)膜異位病灶的血管生成與植入。

4 miRNA 與免疫和炎癥

研究發(fā)現(xiàn)EMs 患者腹腔內(nèi)可檢測到多種類型的免疫細胞，形成了復(fù)雜的炎癥性微環(huán)境，這種微環(huán)境有利于內(nèi)膜細胞的種植與EMs 病灶的形成；EMs病灶切除術(shù)后，腹腔內(nèi)炎癥狀態(tài)可明顯改善，這為EMs 病灶促進炎癥因子分泌的猜想提供了證據(jù)。

4.1 炎癥促進EMs 發(fā)展微環(huán)境中長期存在的慢性炎癥會誘導(dǎo)免疫抑制細胞積累，出現(xiàn)T 細胞質(zhì)量受損表現(xiàn)，如輔助性T 細胞1/輔助性T 細胞2（Th1/Th2）失衡、CD4+T 細胞生成一氧化氮（NO）增加，T 細胞受體（T cell receptor，TCR）z 鏈水平降低，促進EMs炎癥的發(fā)生和疾病的進展[18]。Chen 等[19]研究表明炎性細胞因子和外泌體miRNA 可能與EMs 的發(fā)展關(guān)系密切，普遍認為外泌體miRNA 是炎癥和T 細胞免疫反應(yīng)的介體，晚期EMs 患者腹腔液中可檢測到多種外泌體miRNA 表達改變、調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）擴增，其中miR-451a 上調(diào)尤為顯著，這些外泌體可能導(dǎo)致腹腔內(nèi)炎癥環(huán)境的形成與免疫異常，為EMs 病灶的定植與血管生成提供了可能。

4.2 EMs 異位病灶促進炎癥發(fā)生EMs 異位病灶直接或間接地改變了患者的腹腔內(nèi)微環(huán)境。有學(xué)者證實EMs 患者的腹腔液和腹腔內(nèi)CD14 單核細胞/巨噬細胞中miR-146b 的表達增加，miR-146b 通過減弱干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）表達參與了炎癥的負調(diào)控[20]。Tang 等[21]發(fā)現(xiàn)miR-455 在EMs 患者的異位內(nèi)膜組織中低表達是腹腔內(nèi)炎癥損害的重要原因，并進一步推定其是脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）的靶向miRNA，并進一步證實miR-455 可以成功結(jié)合FABP4 的3′UTR 保護子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞免受過氧化氫（H2O2）引起的損害。

5 miRNA 與不孕

EMs 患者不孕原因與子宮內(nèi)膜容受性降低、免疫異常等原因密切相關(guān)，應(yīng)著眼于多種因素尋找突破點提高患者妊娠率[22]。眾多學(xué)者通過研究人體組織與小鼠模型證實EMs 患者的分子標志物已發(fā)生改變，多種miRNA 參與妊娠調(diào)節(jié)。

5.1 容受性降低子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對植入胚胎的接受能力，只出現(xiàn)于每個月經(jīng)周期中的特殊時期，是一種綜合性狀態(tài)，其中包括子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)以及血流分布等，受多種因素復(fù)雜調(diào)控。Petracco 等[23]認為miR-135a/b 的表達與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)，分泌期子宮內(nèi)膜miR-135a/b 的表達水平比增殖期高，EMs 患者miR-135a/b 的表達水平比正常育齡期女性少。由此可推測其在生殖組織的穩(wěn)態(tài)中起正向決定性作用。但另有研究證實，EMs 相關(guān)性不孕婦女著床窗口期原位子宮內(nèi)膜組織中5 個差異表達的miRNA（miR-142-5p、miR-146a-5p、miR-1281、miR-940 和miR-4634）顯著上調(diào)，而miR-543顯著下調(diào)，從而猜測這些miRNA 的表達改變可能會影響胚胎植入[24]。這些miRNA 的表達異常均有可能影響子宮內(nèi)膜功能，損害胚胎植入從而導(dǎo)致EMs 相關(guān)性不孕的發(fā)生。

5.2 孕酮抵抗多數(shù)EMs 患者對孕酮治療呈現(xiàn)低反應(yīng)或無反應(yīng)，稱之為孕酮抵抗。Pei 等[25]發(fā)現(xiàn)miR-194-3p 在輕度EMs 患者的子宮內(nèi)膜組織中過表達，其通過促進細胞形態(tài)學(xué)變化和調(diào)整催乳素水平來抑制胚胎干細胞的體外蛻膜化。進一步研究證實miR-194-3p 導(dǎo)致EMs 患者孕酮抵抗是通過抑制孕激素受體（progesterone receptor，PGR）的水平和在位子宮內(nèi)膜中的蛻膜化來阻礙生育。Zhou 等[26]認為miR-196a 過表達同樣可導(dǎo)致孕酮抵抗，EMs 患者內(nèi)膜組織中miR-196a 水平顯著上升，其通過上調(diào)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（MEK/ERK）信號通路與抑制PGR 表達來阻礙子宮內(nèi)膜蛻膜化，導(dǎo)致EMs 患者妊娠率下降。

6 miRNA 與EMs 的治療

目前EMs 發(fā)病機制尚不清晰，缺乏特異性診斷標志物，診斷主要依靠于腹腔鏡，所以存在著延遲診斷以及延誤治療，其雖為良性疾病卻嚴重影響婦女的健康與生活質(zhì)量。目前EMs 的治療方式主要為手術(shù)治療，miRNA 治療仍缺乏臨床證據(jù)，但很多學(xué)者從此方面提供了思路，為臨床診斷與治療提供了更為廣闊的思路。

Li 等[27]通過3′UTR 熒光素酶的報告基因測定結(jié)果推測miR-92a 轉(zhuǎn)染后的高表達可降低第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN 基因）水平，使基質(zhì)細胞對孕酮治療更具抵抗力。另一方面使用miRNA 拮抗劑（antagomir）抑制miR-92a 的作用可增強孕酮的治療效果，抑制基質(zhì)細胞增殖，并減少EMs 小鼠模型中異位病灶的形成。另有學(xué)者證實miR-200c 受轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的負向調(diào)控，抑制人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的增殖和遷移，局部注射miR-200c 模擬物或行MALAT1 敲除均可顯著抑制異位子宮內(nèi)膜病變的生長[28]。Park 等[29]發(fā)現(xiàn)EMs 患者子宮內(nèi)膜中miR-21-5p 的表達明顯上調(diào)，用皂苷提取物處理人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞后miR-21-5p 的表達下降導(dǎo)致Caspase3的表達顯著增加，進而促進了內(nèi)膜細胞的凋亡。由此推測，皂苷提取物可能通過調(diào)節(jié)特定的miRNA 來治療EMs。

7 結(jié)語

miRNA 與EMs 具體的發(fā)病機制之間的關(guān)系尚未得到準確充分的認識，全面分析EMs 的發(fā)病機制可對臨床不孕患者的治療起到指導(dǎo)作用。miRNA 之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，一種miRNA 可能作用于多種信號通路、靶位點，一種靶位點可能受多種miRNA調(diào)控，這種復(fù)雜的網(wǎng)狀通路的形成促進了EMs 的發(fā)生、進展。單從某一個方面著手進行治療，往往得不到預(yù)想的結(jié)局。EMs 至今無法根治，對患者生活質(zhì)量造成的不良影響也缺乏有效的干預(yù)手段，目前臨床醫(yī)生應(yīng)著眼于多種復(fù)雜性機制網(wǎng)，根據(jù)不同情況采取個體化治療措施、長期管理、對癥治療，改善患者生活質(zhì)量，提高患者妊娠率。