月經(jīng)血干細(xì)胞來(lái)源外泌體在疾病治療中的應(yīng)用

劉勃彤，劉東哲，陳秀慧

外泌體（exosomes）是由活細(xì)胞釋放的納米級(jí)小囊泡，可通過(guò)其攜帶的生物學(xué)信息介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，參與調(diào)控多種生理及病理過(guò)程。同時(shí)，作為一種納米級(jí)顆粒，外泌體能夠穿過(guò)血腦屏障等生物學(xué)屏障，到達(dá)靶器官發(fā)揮作用。隨著對(duì)外泌體研究的逐步深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了其極大的研究潛能和實(shí)用價(jià)值，尤其在疾病診斷和治療上的獨(dú)特價(jià)值越發(fā)受到關(guān)注，因此成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。月經(jīng)血干細(xì)胞來(lái)源外泌體（menstrual blood stem cell-derived exosomes,MenSC-Ex）具有細(xì)胞來(lái)源無(wú)創(chuàng)、應(yīng)用無(wú)倫理學(xué)問(wèn)題和免疫原性低等優(yōu)勢(shì)而極富研究潛力和應(yīng)用前景。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MenSC-Ex 在組織修復(fù)與再生、腫瘤進(jìn)程調(diào)控以及生殖醫(yī)學(xué)等方向均表現(xiàn)出卓越的干預(yù)作用。

1 干細(xì)胞外泌體概述

外泌體是由活細(xì)胞釋放的攜帶微小RNA（microRNA，miRNA）/長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding，lncRNA）、分泌蛋白和核酸變異體等成分的小囊泡（直徑40～160 nm）[1]。在生物體內(nèi)，外泌體通過(guò)其攜帶的遺傳信息參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控多種生理、病理過(guò)程。一方面，它可以作為“液體活檢”的目標(biāo)，提供其來(lái)源細(xì)胞的生物學(xué)信息；另一方面，它與免疫反應(yīng)、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[1-2]，因此成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。由于外泌體在細(xì)胞內(nèi)含量極低[3]，其相關(guān)研究往往需要培養(yǎng)大量細(xì)胞才能獲得研究所需量。因此，尋找理想的細(xì)胞源成為外泌體研究中的關(guān)鍵。干細(xì)胞具有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能，在再生醫(yī)學(xué)和移植學(xué)中潛力巨大，然而免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題影響了干細(xì)胞治療的效果[4]。如果能夠應(yīng)用攜帶干細(xì)胞有效信息的低免疫源性的外泌體進(jìn)行“無(wú)細(xì)胞”治療，則可降低活細(xì)胞移植的免疫排斥、栓塞和成瘤等風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，干細(xì)胞的高增殖力又能保證獲取足量的滿足研究所需的外泌體。由此可見(jiàn)，干細(xì)胞來(lái)源的外泌體極富研究潛力和應(yīng)用價(jià)值。

2 MenSC-Ex 的研究背景

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種多能干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，即自我更新和多向分化潛能[5]。目前，MSC 多是從骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等組織中獲得，其中對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，bM-MSC）的研究最為深入。在與MSC 相關(guān)的“無(wú)細(xì)胞”治療中，bM-MSC 來(lái)源外泌體（bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes，bM-MSC-Ex）亦備受關(guān)注。如利用bM-MSC-Ex調(diào)節(jié)衰老相關(guān)胰島素抵抗[6]、促進(jìn)骨折恢復(fù)和成骨細(xì)胞分化[7]等，在重癥新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的治療中bM-MSC-Ex也表現(xiàn)出積極的作用[8]。然而，獲取bM-MSC 的有創(chuàng)過(guò)程制約了其廣泛應(yīng)用。2007 年，Meng 等[9]在人類月經(jīng)血中發(fā)現(xiàn)了一類具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群，稱之為月經(jīng)血干細(xì)胞（menstrual blood stem cell，MenSC）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，與骨髓或其他來(lái)源的干細(xì)胞相比，MenSC 不但取材過(guò)程簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)，應(yīng)用不存在倫理問(wèn)題，而且在合成、分泌細(xì)胞因子等方面亦具有顯著優(yōu)勢(shì)[10]。那么，作為一種易于獲得、具有高度增殖能力的干細(xì)胞，MenSC 是否有可能成為高效的供體細(xì)胞，為科學(xué)研究及治療提供優(yōu)質(zhì)且性狀穩(wěn)定的外泌體呢？

MenSC-Ex 攜帶了其來(lái)源細(xì)胞——MenSC 的豐富的遺傳信息，并對(duì)這些信息進(jìn)行了高效富集，能夠調(diào)控包括凋亡、炎癥和免疫在內(nèi)的多種生物過(guò)程，靶向發(fā)揮作用。對(duì)于MenSC-Ex 對(duì)多種疾病的探索性研究發(fā)現(xiàn)，除了極有可能成為一種新型干預(yù)手段以外，其特殊的納米級(jí)脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)亦使其極富潛力成為一種新型藥物載體，在“無(wú)細(xì)胞”和精準(zhǔn)靶向治療上發(fā)揮積極的作用。

3 MenSC-Ex 的應(yīng)用

3.1 MenSC-Ex 與組織再生MSC 來(lái)源的外泌體能夠通過(guò)抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)元的生長(zhǎng)和突觸連接[11]。比較不同來(lái)源的MSC 所分泌的外泌體對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)的作用后發(fā)現(xiàn)，MenSC-Ex 對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響與bM-MSC-Ex 相當(dāng)，而對(duì)皮層神經(jīng)元最長(zhǎng)軸突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用優(yōu)于bM-MSCEx[12]?？梢?jiàn)，MenSC-Ex 對(duì)大腦皮層神經(jīng)突起的生長(zhǎng)具有更好的促進(jìn)效果。這一研究對(duì)于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的MSC 及其衍生物的選擇具有重要指導(dǎo)意義。

特發(fā)性肺纖維化好發(fā)于中老年人群，是一種以肺組織不可逆纖維化為特征的慢性進(jìn)展性疾病。該病預(yù)后差、病死率高，在美國(guó)65 歲及以上人群中，中位生存期僅為2～3 年[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)MenSC 能夠通過(guò)抑制免疫和抗纖維化作用逆轉(zhuǎn)急性肺損傷[14]。Sun 等[15]發(fā)現(xiàn)，在大鼠特發(fā)性肺纖維化模型中，從月經(jīng)血中獲得的外泌體能夠顯著改善博萊霉素（Bleomycin，BLM）介導(dǎo)的肺纖維化和肺泡上皮損傷。介導(dǎo)這一調(diào)控過(guò)程的關(guān)鍵元件是MenSC-Ex 所攜帶的miRNA let-7。通過(guò)靶向LOX1調(diào)節(jié)NLRP3 信號(hào)，let-7 能夠阻斷活性氧（reactive oxygen species，ROS）的活化，減少DNA 損傷和細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制炎癥反應(yīng)的激活。這些發(fā)現(xiàn)為研究MenSC-Ex 在特發(fā)性肺纖維化臨床治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 型糖尿病是由免疫介導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞團(tuán)丟失所導(dǎo)致的胰島素終身依賴性疾病，調(diào)控免疫反應(yīng)可能是其治療的關(guān)鍵。已有研究發(fā)現(xiàn)MSC 能夠通過(guò)抑制自身免疫促進(jìn)胰島細(xì)胞再生[5]，然而，這一治療方法亦存在干細(xì)胞治療的普遍安全問(wèn)題。為了規(guī)避安全隱患，Mahdipour 等[16]應(yīng)用從月經(jīng)血中分離的外泌體對(duì)1 型糖尿病進(jìn)行干預(yù)。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MenSC-Ex 能夠恢復(fù)β 細(xì)胞團(tuán)的再生并促進(jìn)胰島素的合成，在接受MenSC-Ex 治療后，胰腺十二指腸同源盒1（pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX-1）表達(dá)量明顯增加，而Pdx-1 是具有促進(jìn)β 細(xì)胞再生、成熟和胰島素合成作用的重要細(xì)胞因子。

3.2 MenSC-Ex 與組織修復(fù)傷口愈合是涉及多種機(jī)制的復(fù)雜過(guò)程。近年來(lái)，“細(xì)胞療法”在皮膚組織修復(fù)的研究中備受青睞，已有多種細(xì)胞被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，而MSC 來(lái)源的外泌體因具有免疫調(diào)節(jié)和再生功能亦備受關(guān)注[17]。糖尿病患者體內(nèi)存在多重病理機(jī)制干擾創(chuàng)傷愈合，因此，這一人群的傷口愈合成為創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題。Dalirfardouei 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MenSC-Ex 能夠通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)糖尿病小鼠的傷口愈合。應(yīng)用鏈脲佐菌素在糖尿病小鼠背部構(gòu)建皮膚全層損傷模型，外源性MenSC-Ex通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M1-M2 極化改善了炎癥狀態(tài)，并通過(guò)降低Col1/Col3 比值減少瘢痕形成，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合過(guò)程，改善愈合結(jié)局。

暴發(fā)性肝功能衰竭（fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF）是一種急危重癥，起病急、進(jìn)展迅速且死亡率高。一項(xiàng)關(guān)于FHF 的研究發(fā)現(xiàn)，在接受MenSC-Ex 移植后，包括細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管生成素（angiogenin，ANG）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等在內(nèi)的多種修復(fù)性因子均呈高表達(dá)[19]。在小鼠FHF 模型體內(nèi)，靜脈注入的MenSC-Ex 能夠遷移至肝臟，靶向作用于損傷的肝細(xì)胞，使得單核細(xì)胞數(shù)量減少、活性凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而修復(fù)損傷、改善肝功能和提高存活率。這一研究證實(shí)了MenSC-Ex 的抗凋亡作用，使應(yīng)用MenSC-Ex修復(fù)FHF 成為可能；同時(shí)亦揭示了MenSC-Ex 的“靶向”工作機(jī)制，顯示出外泌體精準(zhǔn)治療的優(yōu)勢(shì)。

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是由于子宮內(nèi)膜基底層損傷而導(dǎo)致的宮腔內(nèi)粘連，表現(xiàn)為月經(jīng)量減少甚至閉經(jīng)，最終導(dǎo)致不孕[20]。IUA 治療手段有限、復(fù)發(fā)率高，是棘手的臨床問(wèn)題。Saribas 等[21]應(yīng)用與MenSC 特征相似的子宮內(nèi)膜MSC 對(duì)IUA 進(jìn)行了干預(yù)性研究。在接受了從子宮內(nèi)膜MSC 中獲得的外泌體治療后，組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和MMP-9 表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和局部血管再生，同時(shí)降低纖維化，發(fā)揮了積極的修復(fù)作用。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜MSC-Ex 對(duì)IUA 的修復(fù)效果明顯優(yōu)于子宮內(nèi)膜MSC，提示外泌體對(duì)子宮內(nèi)膜MSC 內(nèi)的生物信息進(jìn)行了富集，因此治療作用更為高效。

3.3 MenSC-Ex 與腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過(guò)程，因此抗血管生成是當(dāng)前腫瘤靶向治療的主要途徑之一[22]。外泌體多通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）相關(guān)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤血管生成的調(diào)控[23]。Alcayaga-Miranda等[24]發(fā)現(xiàn)，MenSC-Ex 能夠降低前列腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的合成，進(jìn)而作用于核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和VEGF 通路，抑制VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）等ROS 依賴性促血管生成因子的合成，從而抑制腫瘤血管生成、控制腫瘤生長(zhǎng)。此項(xiàng)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，bM-MSC-Ex對(duì)前列腺癌細(xì)胞的血管生成呈現(xiàn)促進(jìn)作用，表現(xiàn)為促血管生成因子的高表達(dá)。Rosenberger 等[25]發(fā)現(xiàn)，在倉(cāng)鼠頰囊癌（口腔鱗狀細(xì)胞癌）模型中，MenSC-Ex 能夠抑制腫瘤細(xì)胞的VEGF 分泌，并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而干預(yù)腫瘤脈管系統(tǒng)的重建，抑制腫瘤生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，MenSC-Ex的抗血管生成作用，可能賦予其獨(dú)特的潛力，為腫瘤的抗血管生成治療開(kāi)辟新的路徑。

3.4 MenSC-Ex 與生殖不孕癥是持續(xù)存在并越發(fā)引起學(xué)者關(guān)注的全球性生殖問(wèn)題，如何提高體外受精-胚胎移植的成功率、改善輔助生殖的妊娠結(jié)局一直是研究熱點(diǎn)所在。Blázquez 等[26]發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜MSC 分泌的外泌體能夠使體外培養(yǎng)的囊胚總細(xì)胞數(shù)增加，提高胚胎血管生成因子A 的分泌，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成和組織重塑，改善體外受精的妊娠結(jié)局。該研究證實(shí)了子宮內(nèi)膜MSC 分泌的外泌體對(duì)胚胎發(fā)育的促進(jìn)作用，為其在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是影響女性生育力的主要原因之一，只有約5%的患者可能由于疾病自然緩解而獲得妊娠。當(dāng)前，恢復(fù)卵巢儲(chǔ)備和激活休眠卵泡是POI 治療的常用策略，而不同來(lái)源的干細(xì)胞亦是可能的治療選擇[27]。Zhang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)MenSC-Ex 對(duì)POI 表現(xiàn)出積極的干預(yù)作用：體外培養(yǎng)的SD 大鼠卵巢在接受MenSC-Ex 治療后，始基卵泡和初級(jí)卵泡中的顆粒細(xì)胞明顯增殖，同時(shí)卵泡凋亡明顯受到抑制。在由四乙烯基環(huán)己烯二環(huán)氧化物誘導(dǎo)構(gòu)建的POI 大鼠模型中，MenSCs-Ex 有效逆轉(zhuǎn)了藥物毒性導(dǎo)致的卵巢功能不全，表現(xiàn)為顯著促進(jìn)卵泡發(fā)育，恢復(fù)體內(nèi)激素水平；同時(shí)，調(diào)控卵巢細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，加速休眠卵泡的募集，進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，改善妊娠結(jié)局。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，多次應(yīng)用MenSC-Ex 全身治療的效果與卵泡內(nèi)MenSC 移植相當(dāng)，這也為利用無(wú)細(xì)胞生物資源恢復(fù)卵巢功能提供了重要理論依據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

MenSC-Ex 憑借著取材過(guò)程簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)、細(xì)胞來(lái)源豐富、應(yīng)用不存在倫理問(wèn)題等諸多優(yōu)勢(shì)，受到研究者的廣泛關(guān)注并已在組織再生與修復(fù)、腫瘤和生殖醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域取得了一定的研究進(jìn)展。然而在逐步深入地對(duì)MenSC-Ex 展開(kāi)研究直至引入臨床治療的過(guò)程中，仍存在諸多問(wèn)題有待解決。例如，當(dāng)前外泌體的提取效率較低，如何優(yōu)化方法、提高效率，是保證研究所需外泌體的關(guān)鍵。對(duì)于MenSC-Ex 的具體工作機(jī)制，尚缺乏系統(tǒng)性的深入研究。明確MenSC-Ex 與MenSC 在遺傳信息上的差異，是進(jìn)一步了解MenSC-Ex 的功能并挖掘其治療作用的重要基礎(chǔ)。此外，體外研究的可重復(fù)性和體內(nèi)研究的安全性尚需大量研究進(jìn)一步論證。

前期研究顯示，MenSC-Ex 對(duì)多種疾病表現(xiàn)出積極的干預(yù)作用，對(duì)于其治療價(jià)值的挖掘有待更多的研究探索。而除了通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊調(diào)控靶細(xì)胞的生物學(xué)功能以外，外泌體特定的分子質(zhì)量和天然的納米脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)亦使得其有可能成為高效的納米顆粒遞送系統(tǒng)，承載藥物及生物分子通過(guò)人體生物屏障，靶向發(fā)揮治療作用[29]。已有研究發(fā)掘了多種其他細(xì)胞來(lái)源的外泌體作為藥物載體的可能性[30-31]，而無(wú)創(chuàng)來(lái)源的MenSC-Ex 是否更具優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步探索。在“無(wú)創(chuàng)”和“精準(zhǔn)”的醫(yī)療研究理念指引下，隨著研究的逐步深入，定能挖掘出MenSCEx 更多的研究潛能和實(shí)用價(jià)值，使其在“無(wú)細(xì)胞”治療中發(fā)揮更大的作用。