軍團(tuán)菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

趙子睿 張怡 李萍 陳愉

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,沈陽(yáng) 110004

軍團(tuán)菌是一種革蘭陰性桿菌,因在1976年的一次美國(guó)退伍軍人會(huì)議上首次暴發(fā)并被分離鑒定而得名。該菌廣泛分布于自然界的水和土壤環(huán)境中,也存在于公共供水系統(tǒng)如自來(lái)水管道、空調(diào)冷卻塔水及浴室溫泉等環(huán)境中[1],患者吸入含有軍團(tuán)菌的氣溶膠后細(xì)菌進(jìn)入肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi),在其特有的四型分泌系統(tǒng)作用下,軍團(tuán)菌能夠成功地躲避溶酶體酶的殺菌作用,并在巨噬細(xì)胞中生存繁殖,從而導(dǎo)致軍團(tuán)病的發(fā)生[1-2]。軍團(tuán)病,表現(xiàn)為軍團(tuán)菌感染的肺炎型和非肺炎型兩種,非肺炎型又稱龐蒂亞克熱,癥狀表現(xiàn)類似流感,以發(fā)熱為主要表現(xiàn),為自限性疾病；肺炎型軍團(tuán)病常表現(xiàn)為重癥社區(qū)獲得性肺炎。我國(guó)于1982年在南京發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)首個(gè)病例,隨后國(guó)內(nèi)相繼出現(xiàn)多起軍團(tuán)病的暴發(fā)與散發(fā)病例,但以散發(fā)為主[1,3]。目前已知的軍團(tuán)菌有61種71個(gè)血清型,同時(shí)還有新的菌種不斷從環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)并分離[4]。在軍團(tuán)菌中,引起人類軍團(tuán)病的主要病原是嗜肺軍團(tuán)菌,其中又以血清型1型嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila1,LP1)為主[5]。自1976年以后,全世界范圍內(nèi)越來(lái)越多的與社區(qū)、醫(yī)院及旅行相關(guān)的軍團(tuán)病病例及其小規(guī)模暴發(fā)被報(bào)道[6],其嚴(yán)重程度從輕度到重度不等,平均病死率為10%,而對(duì)于病情危重,未得到及時(shí)治療的免疫力低下的患者,其平均病死率達(dá)到30%[7]。在臨床上,通常使用大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物對(duì)軍團(tuán)菌感染進(jìn)行治療[8],近年來(lái),不斷有研究人員通過(guò)在抗菌藥物環(huán)境下對(duì)軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)得到了高度耐藥的軍團(tuán)菌菌株,證實(shí)了軍團(tuán)菌產(chǎn)生耐藥的可能性[9-11]。同時(shí),國(guó)內(nèi)外均發(fā)現(xiàn)環(huán)境中分離出的菌株對(duì)治療藥物存在耐藥的情況[12-13]。由于軍團(tuán)菌肺炎在臨床常為重癥,及時(shí)有效的治療對(duì)預(yù)后至關(guān)重要,一旦產(chǎn)生耐藥,將危及患者生命。盡管新近應(yīng)用的替加環(huán)素等四環(huán)素類抗菌藥物被報(bào)道對(duì)于治療軍團(tuán)菌肺炎有較好的治療效果,但未見軍團(tuán)菌對(duì)該類藥物耐藥方面的研究。因此,本文重點(diǎn)針對(duì)大環(huán)內(nèi)酯和氟喹諾酮類的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制作一綜述,臨床醫(yī)生對(duì)該方面的了解將為治療決策的制定及調(diào)整提供參考。

一、不同來(lái)源的軍團(tuán)菌耐藥現(xiàn)狀

(一)來(lái)自環(huán)境的菌株

軍團(tuán)病主要通過(guò)吸入環(huán)境中污染軍團(tuán)菌的氣溶膠發(fā)病,因此對(duì)環(huán)境中軍團(tuán)菌的耐藥性監(jiān)測(cè)顯得十分重要。國(guó)內(nèi)學(xué)者Jia等[14]對(duì)收集自2005-2012年的149株嗜肺軍團(tuán)菌1型菌株進(jìn)行了藥敏檢測(cè),這些菌株包括來(lái)自北京、上海、深圳、無(wú)錫、濟(jì)南、石家莊等地的臨床軍團(tuán)病患者的19株臨床菌株和來(lái)自醫(yī)院、社區(qū)等公共場(chǎng)所的冷卻塔水、溫泉水和管道水環(huán)境中的130株環(huán)境菌株,最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)范圍為0.032～2.0 mg/L,其中25株軍團(tuán)菌存在對(duì)阿奇霉素的耐藥,耐藥率為16.78%(25/149),并且這25株全部是來(lái)自環(huán)境的菌株,占環(huán)境菌株的比率達(dá)19.23%,基于測(cè)序分型(sequencing based typing,SBT)顯示這25株耐藥菌株包括ST1、ST150、ST144、ST629和ST154,其中ST1型的菌株占到所有耐藥株的84%。在149株軍團(tuán)菌菌株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)左氧氟沙星,環(huán)丙沙星及利福平耐藥的菌株。董穎等[15]在進(jìn)行軍團(tuán)菌的體外藥物活性研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)10株對(duì)阿奇霉素MIC＞1 mg/L的嗜肺軍團(tuán)菌菌株,其中7株為血清型1型,另外3株為非血清型1型的嗜肺軍團(tuán)菌菌株,但它們均為環(huán)境中分離的菌株,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株。在2017年,波蘭的研究人員在一家療養(yǎng)院的供水系統(tǒng)中分離出了一株對(duì)阿奇霉素耐藥的非血清型1型的嗜肺軍團(tuán)菌,并且該耐阿奇霉素菌株同時(shí)表現(xiàn)為對(duì)環(huán)丙沙星和利福平的敏感性降低[12]。2019年,挪威的研究人員對(duì)收集自環(huán)境的67株和來(lái)自臨床患者的55株軍團(tuán)菌進(jìn)行了藥敏檢測(cè),其MIC范圍為0.032～1.0 mg/L,其中17.91%的環(huán)境菌株都存在對(duì)阿奇霉素敏感性降低,并且所有對(duì)阿奇霉素的MIC≥0.5 mg/L的菌株均帶有外排泵基因,同時(shí)受試菌株中所有ST1型菌株均存在對(duì)阿奇霉素的敏感性降低的現(xiàn)象,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星等氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株[16]。在對(duì)希臘一所醫(yī)院進(jìn)行的供水系統(tǒng)采樣檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),在所分離的20株嗜肺軍團(tuán)菌菌株中,有3株對(duì)紅霉素有輕微耐藥,其中2株MIC為1 mg/L,另一株為0.75 mg/L,另有2株對(duì)環(huán)丙沙星存在輕微耐藥,MIC為2 mg/L[17]。此外,印度的醫(yī)院供水系統(tǒng)中分離出環(huán)丙沙星MIC=2 mg/L的嗜肺軍團(tuán)菌菌株,但未發(fā)現(xiàn)對(duì)阿奇霉素存在耐藥的軍團(tuán)菌菌株[18],意大利一家醫(yī)院的供水系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)2株阿奇霉素MIC=3 mg/L和MIC=4 mg/L的嗜肺軍團(tuán)菌菌株,但并未發(fā)現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星存在耐藥的菌株[19]。這些抗藥性在地理上存在一定差異,可能是由于醫(yī)療衛(wèi)生狀況的實(shí)踐,也有可能是由于每個(gè)國(guó)家的農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和肉類行業(yè)的抗菌藥物使用水平和狀況不同[20],從而導(dǎo)致了軍團(tuán)菌的耐藥基因在不同地理分布上出現(xiàn)了差異[21]。顯而易見的是,不同區(qū)域菌株敏感性的數(shù)據(jù)對(duì)指導(dǎo)當(dāng)?shù)嘏R床治療更有實(shí)際意義,在臨床用藥過(guò)程中應(yīng)予以考慮和重視。

(二)來(lái)自臨床的菌株

在軍團(tuán)病的治療中,軍團(tuán)菌耐藥性的檢測(cè)對(duì)其具有重要意義。通過(guò)以往的研究資料來(lái)看,在實(shí)驗(yàn)室中,可以很容易通過(guò)培養(yǎng)篩選得到具有對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物或氟喹諾酮類藥物具有耐藥性的嗜肺軍團(tuán)菌菌株[10-11,22],然而臨床上并沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有耐藥的軍團(tuán)病病例報(bào)告,但是存在對(duì)阿奇霉素敏感性降低的臨床分離株亞群,利用分子系統(tǒng)發(fā)育分析LP1的阿奇霉素MIC和LP1菌株的SBT分型型別關(guān)系后,研究人員發(fā)現(xiàn)來(lái)自臨床的軍團(tuán)菌菌株對(duì)阿奇霉素敏感性降低與lpe AB基因編碼的大環(huán)內(nèi)酯外排泵有關(guān)[9]。在Natas等[16]研究收集自2000-2017年的55株臨床菌株中有9株對(duì)阿奇霉素敏感性降低,達(dá)到16.36%,他們的后續(xù)研究也顯示這些對(duì)阿奇霉素敏感性降低的菌株均存在lpe AB外排泵的表達(dá)。而對(duì)氟喹諾酮類藥物具有耐藥的臨床分離的菌株,目前報(bào)告較少[23]。2012年,Bruin等[24]研究報(bào)道了一株嗜肺軍團(tuán)菌菌株的臨床分離株,其對(duì)阿奇霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性超出了其野生型范圍,其中環(huán)丙沙星MIC為2 mg/L,阿 奇 霉 素MIC為6 mg/L。2014年,Bruin等又從1例環(huán)丙沙星治療失敗的軍團(tuán)病患者身上分離出來(lái)對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的軍團(tuán)菌菌株,其環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度為2 mg/L,超出其流行病學(xué)界值(epidemiological cutoff,ECOFF)1 mg/L,具有潛在耐藥性,在后續(xù)對(duì)該菌株的基因測(cè)序結(jié)果中,顯示其耐藥性來(lái)自gyr A基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR)的點(diǎn)突變[23]。隨后,在一項(xiàng)有82例互不相關(guān)的軍團(tuán)病患者參與的臨床研究中,Shadoud等[25]對(duì)來(lái)自82例軍團(tuán)病患者住院和抗菌藥物治療期間的共139份呼吸道標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè),并進(jìn)行了深度測(cè)序檢測(cè)了嗜肺軍團(tuán)菌的抗性突變,通過(guò)對(duì)患者抗生素治療過(guò)程的不同時(shí)期呼吸道標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR確認(rèn)和量化標(biāo)本中QRDR突變區(qū)Gyr A基因的變化情況,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了患者體內(nèi)軍團(tuán)菌的耐藥基因水平,結(jié)果顯示存在QRDR gyr A突變的兩例患者中,第一例患者確診軍團(tuán)病當(dāng)天的呼吸道樣本中的軍團(tuán)菌gyr A83突變基因的頻率為2.9%,而在其接受氟喹諾酮類藥物治療4 d后的樣本中軍團(tuán)菌gyr A83突變基因的頻率上升為94%；另一例患者在確診軍團(tuán)病當(dāng)天的標(biāo)本中軍團(tuán)菌的gyr A83突變基因頻率為1.05%,而其氟喹諾酮類藥物治療后的第3天和第5天標(biāo)本中軍團(tuán)菌的gyr A83突變基因頻率上升為75%和85%,其研究結(jié)果證明了軍團(tuán)病患者體內(nèi)嗜肺軍團(tuán)菌耐藥性選擇的發(fā)生與氟喹諾酮類藥物的應(yīng)用有直接關(guān)系,并且其耐藥性選擇發(fā)生于氟喹諾酮類藥物治療之后。

二、軍團(tuán)菌耐藥的機(jī)制

(一)軍團(tuán)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制

大環(huán)內(nèi)酯類藥物的主要抗菌機(jī)制為透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入軍團(tuán)菌內(nèi)與軍團(tuán)菌70S核糖體的50S亞基結(jié)合,結(jié)合位點(diǎn)為蛋白質(zhì)合成過(guò)程中必須的肽鏈延長(zhǎng)段,與t-RNA結(jié)合位點(diǎn)形成競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng),抑制軍團(tuán)菌菌體蛋白的合成,從而達(dá)到抑菌的作用[26-27]。細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性獲得主要通過(guò)以下機(jī)制:通過(guò)甲基化酶修飾核糖體靶標(biāo)[28],點(diǎn)突變修飾核糖體上大環(huán)內(nèi)酯類藥物作用位點(diǎn)[29-30],以及染色體過(guò)度表達(dá)或產(chǎn)生獲得性外排泵系統(tǒng)[31]。關(guān)于軍團(tuán)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制,目前研究有以下幾種情況。在由于外排泵的存在而導(dǎo)致耐藥性的研究中,Vandewalle-Capo等[9]在大環(huán)內(nèi)酯類藥物濃度逐漸增高的情況下通過(guò)對(duì)軍團(tuán)菌進(jìn)行連續(xù)傳代,獲得了對(duì)阿奇霉素具有高水平耐藥性的軍團(tuán)菌菌株,他們的研究結(jié)果顯示lpe AB外排泵的高表達(dá)賦予了軍團(tuán)菌這種抗性[9]。lpe AB外排泵是發(fā)現(xiàn)于軍團(tuán)菌的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥外排泵,以阿奇霉素為特異性底物。這種外排泵同源于大腸桿菌的Acr AB外排泵,是RND外排泵家族成員[22]。lpe AB操縱子上游序列的突變,導(dǎo)致了這種外排泵的過(guò)度表達(dá)。挪威研究人員Natas等[16]通過(guò)對(duì)搜集自臨床和環(huán)境中的共122個(gè)嗜肺軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行了抗菌敏感性檢測(cè)并進(jìn)行了全基因組測(cè)序,他們的研究結(jié)果表明對(duì)阿奇霉素敏感性降低的嗜肺軍團(tuán)菌菌株,均存在lpeAB外排泵的高表達(dá)特性。

軍團(tuán)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感性降低也可以來(lái)自核糖體點(diǎn)突變,Descours等[11]通過(guò)對(duì)來(lái)自同一敏感菌株培育得到的12個(gè)獨(dú)立譜系進(jìn)行全基因組測(cè)序,分析共有突變,發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性的增加與核糖體突變有關(guān)。其主要的突變位點(diǎn)是編碼L4、L22和23S r RNA的基因,rpl D或rpl V基因的點(diǎn)突變或插入、缺失等主要發(fā)生在進(jìn)化過(guò)程的早期,它們影響了L4(Q62～G66)和L22(P87～G91)蛋白中兩個(gè)高度保守的5個(gè)氨基酸區(qū)域,這兩個(gè)區(qū)域位于大環(huán)內(nèi)酯類藥物結(jié)合位點(diǎn)附近的核糖體出口隧道中的狹窄結(jié)構(gòu)環(huán)上,影響了大環(huán)內(nèi)酯類藥物與軍團(tuán)菌核糖體的結(jié)合,造成了軍團(tuán)菌對(duì)部分大環(huán)內(nèi)酯類藥物的最低抑菌濃度出現(xiàn)輕度上升。耐藥機(jī)制產(chǎn)生的后期則主要是23S r RNA發(fā)生的突變,rrl基因突變使得選擇藥物的最低抑菌濃度出現(xiàn)大幅上升,這與肽基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域內(nèi)的4個(gè)核苷酸位點(diǎn)有關(guān),即23S r RNA結(jié)構(gòu)域V的2057、2058、2059和2611這4個(gè)位點(diǎn)。位點(diǎn)2058和2059是大環(huán)內(nèi)酯類藥物結(jié)合的關(guān)鍵核苷酸,而堿基對(duì)2057和2611是負(fù)責(zé)關(guān)閉肽基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域單鏈部分之前的莖。這些位置的核苷酸突變雖發(fā)生較晚,但導(dǎo)致了軍團(tuán)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的最低抑菌濃度明顯增加[11]。

(二)軍團(tuán)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制

氟喹諾酮類藥物主要通過(guò)抑制軍團(tuán)菌的DNA促旋酶來(lái)干擾軍團(tuán)菌DNA的復(fù)制,從而起到抑制軍團(tuán)菌增殖生長(zhǎng)的作用。Jonas等[32]在嗜肺軍團(tuán)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的體外選擇實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),嗜肺軍團(tuán)菌出現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥與gyr A基因發(fā)生突變有關(guān),gyr A的第83位氨基酸序列出現(xiàn)T83K或T83I改變,與軍團(tuán)菌出現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥有關(guān)。Almahmoud等[10]在含有環(huán)丙沙星的培養(yǎng)基中通過(guò)連續(xù)傳代,得到8株耐藥性從低到高的軍團(tuán)菌譜系。進(jìn)行基因檢測(cè),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在嗜肺軍團(tuán)菌出現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥過(guò)程中,突變影響了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ編碼基因的gyr A、parC和gyrB三個(gè)位點(diǎn)。gyr A首先發(fā)生突變T83I,然后是parC中發(fā)生G78D或S80R點(diǎn)突變,最后gyr A中再次發(fā)生突變D87N得到相比初代菌株對(duì)莫西沙星濃度提高512倍的耐藥菌株。在Shadoud等[25]研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和二代測(cè)序技術(shù),通過(guò)檢測(cè)來(lái)自住院和抗菌藥物治療期間的軍團(tuán)病患者的呼吸道樣本,檢測(cè)患者標(biāo)本中軍團(tuán)菌對(duì)氟喹諾酮類耐藥基因含量的變化,證明了體內(nèi)對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌gyr A83突變株的選擇與氟喹諾酮類抗菌藥物在患者體內(nèi)的顯著增加有關(guān),并且氟喹諾酮類藥物對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的耐藥性選擇發(fā)生在藥物治療期間,該研究說(shuō)明氟喹諾酮類藥物在臨床應(yīng)用過(guò)程中可誘導(dǎo)軍團(tuán)菌耐藥,并且其發(fā)生概率并不低。

綜上所述,關(guān)于環(huán)境及臨床軍團(tuán)菌菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯和氟喹諾酮類藥物的耐藥國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道,雖然研究尚不多,但已觀察到臨床用藥過(guò)程中誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生,值得臨床醫(yī)生關(guān)注。由于臨床標(biāo)本分離軍團(tuán)菌困難,菌株耐藥性難以判斷,個(gè)別重癥患者,即使應(yīng)用了抗軍團(tuán)菌藥物,仍未逆轉(zhuǎn)其不良預(yù)后。對(duì)于致死性病例,不良預(yù)后是否與藥物耐藥有關(guān),有待于未來(lái)進(jìn)行深入研究。在危重癥治療過(guò)程中,臨床醫(yī)生應(yīng)關(guān)注耐藥情況的發(fā)生,有條件情況下可進(jìn)行軍團(tuán)菌培養(yǎng),進(jìn)而做藥物敏感性檢測(cè)。如無(wú)軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)的條件,可利用二代測(cè)序技術(shù)監(jiān)測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)耐藥基因的載量及其變化,分析患者體內(nèi)軍團(tuán)菌是否存在對(duì)特定藥物的耐藥突變[25]。當(dāng)單藥治療失敗不除外耐藥發(fā)生時(shí),聯(lián)合治療可能對(duì)預(yù)后有益。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突