FEZF1-AS1在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生中的作用研究進(jìn)展

周麗亞 李小利 曹子肖 向俊馨 劉佳慧 李殿明

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 呼吸系病臨床基礎(chǔ)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 233004

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤,據(jù)2020年全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)GLOBOCAN分析報(bào)告顯示,全球肺癌新發(fā)例數(shù)達(dá)220.7萬；死亡例數(shù)達(dá)179.6萬[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占全世界所有肺癌病例的絕大部分,分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌等[2]。近年來,NSCLC的治療盡管采用了多種手段,但5年生存率仍較低,其原因在于,NSCLC診斷時(shí)大多已處于中晚期,因而導(dǎo)致生存率低。因此,篩選新的生物標(biāo)志物對(duì)NSCLC的早期診斷意義重大。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一組位于細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)且長度大于200 nt的RNA,是機(jī)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物,不具有任何生理活性[3],但具有包括保護(hù)蛋白質(zhì)編碼基因在內(nèi)的多種生物學(xué)功能,從而影響著細(xì)胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、細(xì)胞周期及基因組穩(wěn)定性[4]。

近年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,對(duì)包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的早期診斷和治療中具有重要意義[5]。然而,這些lncRNA中絕大多數(shù)的功能尚未能確定。FEZ家族鋅指1反義RNA1(FEZ family zinc finger 1-antisense RNA 1,FEZF1-AS1)作為一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,已經(jīng)證實(shí)在各種腫瘤中上調(diào),參與腫瘤的進(jìn)展,其潛在的應(yīng)用前景包括腫瘤的分子診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面。本文就FEZF1-AS1在NSCLC發(fā)生中的作用研究進(jìn)展作一綜述。

1 FEZF1-AS1概述

FEZF1-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,從7號(hào)染色體的加鏈轉(zhuǎn)錄,定位于編碼FEZF1的同源基因的相反鏈上,位于7q31.32號(hào)染色體上,產(chǎn)生2 564 bp轉(zhuǎn)錄本,含有7個(gè)外顯子,其中有611個(gè)互補(bǔ)核苷酸存在于FEZ F1-AS1第一外顯子和FEZ F1第一外顯子之間[6]。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)包括FEZF1-AS1-1201(679 bp,1個(gè)外顯子),FEZF1-AS1-202(2 653 bp,3個(gè)外顯子),FEZF1-AS1-203(768 bp,1個(gè)外顯子)在內(nèi)的FEZF-AS1的3個(gè)剪接變異體[7],然而它們都不具備編碼蛋白質(zhì)的功能。FEZF1-AS1表達(dá)上調(diào)在多種類型的癌癥中可被發(fā)現(xiàn),但在腫瘤細(xì)胞中的位置有不同的看法,且與腫瘤的關(guān)系密切,參與其發(fā)生發(fā)展過程。

2 FEZF1-AS1在NSCLC中的表達(dá)

He等[8]檢測NSCLC組織和鄰近正常組織中FEZF1-AS1的表達(dá)水平是通過采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,q RTPCR)方法,結(jié)果表明,NSCLC組織中FEZF1-AS1的表達(dá)較高,其表達(dá)水平與NSCLC患者分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。FEZF1-AS1在NSCLC細(xì)胞系(A549、SPC-A1、H1299和PC9細(xì)胞)中也顯示出其表達(dá)水平高于正常肺細(xì)胞16HBE,因此認(rèn)為,FEZF1-AS1在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義,可以作為NSCLC的癌基因。另外,Liu等[9]研究中指出,高水平的lncRNA FEZF1-AS1與肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAD)細(xì)胞的侵襲性表型和LAD患者的預(yù)后不良有關(guān)。LAD細(xì)胞系(SPCA-1,NCI-H1299,A549,NCI-H441和LTEP-a2)和正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B),siRNAs轉(zhuǎn)染敲除FEZF1-AS1,應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR,RT-PCR)測定了FEZF1-AS1在LAD組織和相應(yīng)正常組織中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示FEZF1-AS1在LAD組織中過表達(dá),且與分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),但與年齡、性別、吸煙和TNM分期無明顯關(guān)聯(lián)。通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1水平與FEZF1水平呈正相關(guān),FEZF1-AS1負(fù)調(diào)控FEZF1的表達(dá)在LAD細(xì)胞中起癌基因的作用,且兩者之間的相互作用已被報(bào)道[10]。

在肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma,LSCC)的研究中[11],收集37例LSCC組織和鄰近的非腫瘤組織,應(yīng)用RT-PCR測定及Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示FEZF1-AS1的低表達(dá)預(yù)測了LSCC的不良預(yù)后。同時(shí),采用Kaplan-Meier方法和log秩檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)高水平的FEZ F1-AS1與預(yù)后不良有關(guān)。

研究顯示[12],血漿lncRNA FEZF1-AS1也可作為診斷NSCLC的潛在生物標(biāo)志物。該研究中抽取126例NSCLC患者和62例健康對(duì)照者的血漿,采用qRT-PCR方法檢測兩組FEZF1-AS1表達(dá)水平,采用化學(xué)發(fā)光法檢測血漿神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specifific enolase,NSE)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和CYFRA21-1水平。結(jié)果表明,FEZF1-AS1在NSCLC患者中具有較高的表達(dá),進(jìn)一步比較了FEZF1-AS1對(duì)CYFRA21-1、NSE和CEA的診斷能力,并通過二元Logistic回歸計(jì)算FEZF1-AS1和NSE的聯(lián)合診斷能力,結(jié)果表明,與FEZF1-AS1或NSE單獨(dú)相比,FEZF1-AS1和NSE聯(lián)合診斷能力明顯提高,換言之,FEZF1-AS1和NSE的結(jié)合使診斷更具權(quán)威性及臨床意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)與臨床特征及風(fēng)險(xiǎn)性之間的關(guān)系,結(jié)果顯示:與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤大小和疾病狀態(tài)有關(guān)；高水平表達(dá)的FEZF1-AS1其NSCLC風(fēng)險(xiǎn)性顯著增加,且存在顯著的濃度依賴性關(guān)系。

越來越多的研究表明[13]FEZF1-AS1過表達(dá)與NSCLC的分化程度、疾病分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外,Meta分析結(jié)果表明,FEZF1-AS1的失調(diào)已在許多癌癥中被報(bào)道,在腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)增加與癌癥患者較短的總生存率和無病生存率顯著相關(guān),并與預(yù)后不良和晚期臨床病理參數(shù)有關(guān)[14]。因此,FEZF1-AS1在腫瘤的治療靶點(diǎn)中可能具有潛在的重要意義,并被認(rèn)為在該疾病的形成過程中可能起促進(jìn)作用。

3 FEZF1-AS1在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用

3.1 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換通路 研究[8]表明下調(diào)FEZF1-AS1可抑制NSCLC的細(xì)胞增殖、集落形成、細(xì)胞侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程,而通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路也可調(diào)節(jié)EMT過程。在A549和SPC-A1細(xì)胞系中,通過沉默細(xì)胞系中的FEZF1-AS1,發(fā)現(xiàn)Slug,twist和Vimentin表達(dá)水平明顯下調(diào),而鈣黏附蛋白E(E-cadherin)和ZO-1表達(dá)水平明顯上調(diào)；進(jìn)一步的研究證實(shí)FEZF1-AS1可通過與EZH2相互作用抑制E-cadherin的表達(dá),若敲除FEZF1-AS1或EZH2則增加了E-cadherin在A549和SPC-A1細(xì)胞中表達(dá)；通過染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)和RNA免 疫 沉 淀 實(shí) 驗(yàn)(RNA immunoprecipitation,RIP)測定結(jié)果顯示,FEZF1-AS1在A549細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞中能與EZH2和LSD1結(jié)合。因此,我們認(rèn)為FEZF1-AS1促進(jìn)細(xì)胞EMT可通過抑制NSCLC中的E-cadherin來實(shí)現(xiàn)。

3.2 p57通路 p57是細(xì)胞周期素依賴性激酶的抑制劑,被認(rèn)為是抑癌基因,在許多癌癥中失調(diào)。在對(duì)LAD的研究中,Jin等[15]評(píng)價(jià)了CDK抑制劑(p15,p16,p21,p27,p57)的表達(dá),結(jié)果顯示,沉默F(xiàn)EZF1-AS1可顯著提高p57的水平,即FEZF1-AS1也可通過靶向p57在人LAD中起癌基因的作用。通過應(yīng)用RIP證實(shí)了FEZF1-AS1可以直接與LAD細(xì)胞中的EZH2結(jié)合,而p57也是NSCLC中EZH2的直接靶點(diǎn)[16],進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明沉默的FEZF1-AS1可以顯著增加p57的水平,而EZH2的敲除也明顯增加了p57在LAD細(xì)胞中的表達(dá)水平,提示FEZF1-AS1可能通過與EZH2的相互作用來調(diào)節(jié)p57。此外,CHIP檢測表明,FEZF1-AS1可以將EZH2招募到p57啟動(dòng)子區(qū)域并抑制其轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)LAD的進(jìn)展。

3.3 作為miRNA海綿 有研究顯示[17],許多miRNA結(jié)合位點(diǎn)存在于多種RNA轉(zhuǎn)錄本上,即不同的RNA轉(zhuǎn)錄本可以具有相同的miRNA結(jié)合位點(diǎn),它們能夠競爭共享相同的miRNA,調(diào)節(jié)靶向的RNA,進(jìn)行相互交流,從而充當(dāng)相互競爭的內(nèi)源性RNAs,進(jìn)而影響疾病的各種過程,其中就包含lncRNAs,此為所謂的競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)假說。一方面,lncRNAs對(duì)miRNA海綿的作用在確定miRNA水平及其翻譯抑制的潛力方面顯然是至關(guān)重要的；另一方面,它大大增加了miRNA-RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。FEZF1-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,同樣具備這種作用。

Huang等[18]分析NSCLC中FEZF1-AS1與miR-34a的關(guān)系及其對(duì)NOTCH-1的影響。細(xì)胞培養(yǎng)人NSCLC細(xì)胞系(H1993)及選取177例NSCLC患者,進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合RT-PCR測定FEZF1-AS1和NOTCH-1m RNA的表達(dá)水平,分析其數(shù)據(jù)表明,NOTCH-1 m RNA的表達(dá)水平在非腫瘤組織中明顯低于NSCLC組織,且FEZF1-AS1和NOTCH-1呈顯著正相關(guān),表明它們之間可能存在相互作用；細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,H1993細(xì)胞中miR-34a、FEZF1-AS1和NOTCH-1的表達(dá)水平明顯上調(diào),此外,FEZF1-AS1和miR-34a的過度表達(dá)對(duì)彼此的表達(dá)并無顯著影響,相反,FEZF1-AS1的過度表達(dá)可使NOTCH-1的表達(dá)上調(diào),而miR-34a過度表達(dá)介導(dǎo)下調(diào)的NOTCH-1和FEZF1-AS1過度表達(dá)的減少效應(yīng)。因此FEZF1-AS1可作為miRNA海綿調(diào)節(jié)miR-34a上調(diào)NOTCH-1,從而對(duì)癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有促進(jìn)作用。Song等[19]細(xì)胞學(xué)培養(yǎng)出肺癌細(xì)胞系(H1299和H520),通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染及miRNA模擬FEZF1 AS1、ITGA11和miR 516b 5p,此外,用RTqPCR及Westernblot分析證實(shí),miR-516b-5p在H1299和H520細(xì)胞中過表達(dá),而ITGA11的表達(dá)在miR-516b過表達(dá)后降低；敲除FEZF1-AS1基因后,ITGA11蛋白水平降低,進(jìn)一步研究了兩者之間表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果顯示H1299和H520細(xì)胞中,FEZF1-AS1過 表 達(dá)在m RNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著上調(diào)ITGA11-1的表達(dá),在miRNA過表達(dá)后,miR-516b-5p顯著下調(diào)FEZF1-AS1的表達(dá)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)提示miR-516b-5p和FEZF1-AS1可能共享一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),ITGA11受miR-516b-5p和FEZF1-AS1的調(diào)控。因此,FEZF1-AS1可作為ceRNA,調(diào)節(jié)NSCLC中miR-516b-5p及其靶基因ITGA11。

4 FEZF1-AS1參與EGFR-TKIs耐藥

對(duì)于EGFR突變陽性的患者在使用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)后的8～12個(gè)月內(nèi)往往會(huì)失去臨床活性,即產(chǎn)生了繼發(fā)性耐藥。目前已將其耐藥的機(jī)制以及耐藥后的治療作為研究重點(diǎn)。關(guān)于EGFRTKIs耐藥的機(jī)制目前多承認(rèn)以下幾種:(1)繼發(fā)性EGFR突變的發(fā)生；(2)激活旁路信號(hào)；(3)組織病理學(xué)轉(zhuǎn)變；(4)下游信號(hào)通路的激活。LncRNAs已被證實(shí)參與一系列細(xì)胞過程,并在不同細(xì)胞位置的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá),并通過多種機(jī)制參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性。已有相關(guān)研究顯示lncRNAs可能對(duì)NSCLC的EGFR-TKIs耐藥的調(diào)控具有重要意義。

4.1 lncRNA-UCA1參與耐藥 Xu等[20]研究了NSCLC中l(wèi)ncRNA-UCA1在EGFR-TKIs耐藥中的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在獲得性吉非替尼耐藥的NSCLC組織和細(xì)胞(PC-9/GR)中l(wèi)ncRNA-UCA1上調(diào),進(jìn)一步研究顯示,患者的PFS與UCA1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),過表達(dá)可能是預(yù)后不良的新指標(biāo)或吉非替尼治療的進(jìn)展標(biāo)志；RIP及CHIP檢測證實(shí)UCA1與EZH2結(jié)合,CDKN1A是UCA1/EZH2調(diào)控基因的真正靶點(diǎn)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明UCA1可能通過抑制細(xì)胞凋亡、G1-S檢查點(diǎn)、表觀沉默CDKN1A轉(zhuǎn)錄來驅(qū)動(dòng)NSCLC中吉非替尼的耐藥性。此外,Chen等[21]利用生物信息學(xué)在線程序和熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證了UCA1在NSCLC細(xì)胞中作為miR-143的分子海綿,兩者在吉非替尼耐藥細(xì)胞系中呈負(fù)性表達(dá),FOSL2是miR-143的靶點(diǎn),免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)結(jié)果表明,FOSL2在吉非替尼耐藥NSCLC患者組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。即UCA1/miR-143通路有助于過度表達(dá)UCA1的吉非替尼耐藥細(xì)胞系中的吉非替尼耐藥,對(duì)NSCLC中TKI獲得性耐藥的治療具有潛在的治療價(jià)值。這與有關(guān)對(duì)LINC00460,HOST2在吉非替尼耐藥中的作用機(jī)制的研究相似,均可作為miRNA的分子海綿[22-23]。由此可得出,lncRNA可能會(huì)模仿miRNA的靶點(diǎn),從而用海綿狀的miRNA來減弱它們對(duì)沉默下游基因的影響,借此在NSCLC耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

Wang等[24]分析了HOTAIR與EGFR-TKIs相關(guān)的耐藥機(jī)制。研究中采用qRT-PCR檢測出HOTAIR在肺癌細(xì)胞系(PC9/R、H1975、H1299和A549)和耐吉非替尼患者中低表達(dá),且患者的PFS明顯下降；細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Western Blot實(shí)驗(yàn)表明HOTAIR的過表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)EGFRTKIs耐藥的細(xì)胞凋亡,降低了Vimentin和N-cadherin的表達(dá),而增加了E-cadherin的表達(dá),即HOTAIR促進(jìn)吉非替尼的耐藥性可以通過激活EMT來實(shí)現(xiàn)。該研究提示HOTAIR可能是預(yù)測EGFR-TKIs耐藥的潛在指標(biāo)。事實(shí)上,EMT過程涉及到控制細(xì)胞生存、增殖和穩(wěn)態(tài)的整個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重組,以Vimentin的表達(dá)升高和E-cadherin的表達(dá)下降為特征,使腫瘤細(xì)胞依賴于新的分子途徑,并對(duì)靶向治療不敏感,從而被認(rèn)為廣泛參與EGFR-TKIs的耐藥途徑。

4.2 LINC00665參與耐藥 Liu等[25]通過研究分析了LINC00665與EGFR-TKIs相關(guān)的耐藥機(jī)制。將20例晚期NSCLC患者活檢標(biāo)本分為兩組:從未接受過吉非替尼(NG)治療組和耐受吉非替尼(GR)組,與NG組比較,LINC00665在GR組患者中的表達(dá)水平顯著增加,且細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明其在吉非替尼耐藥細(xì)胞(PC9/GR)中的表達(dá)水平約為吉非替尼敏感細(xì)胞(PC9)中的5倍。細(xì)胞轉(zhuǎn)染及敲除實(shí)驗(yàn)顯示,相比單獨(dú)使用吉非替尼治療,LINC00665敲除聯(lián)合吉非替尼后可減少細(xì)胞遷移,從而預(yù)測Si-LINC00665和吉非替尼聯(lián)合治療可能是克服NSCLC中獲得性吉非替尼耐藥性的有效策略。RIP試驗(yàn)和Westernblot結(jié)果表明LINC00665能直接結(jié)合PC9/GR細(xì)胞中的EZH2從而調(diào)控PI3K/AKT通路,敲除LINC00665基因可導(dǎo)致EZH2和非活性PI3K/AKT通路的減少,即LINC00665可能是EGFR-TKI療效的預(yù)測指標(biāo)。

而FEZF1-AS1已被證實(shí)是以上這些耐藥機(jī)制中的重要調(diào)節(jié)因子。但其在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究,為實(shí)現(xiàn)其臨床潛力提供新的理論基礎(chǔ)。

總之,lncRNA FEZF1-AS1可作為一種致癌因子,通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路、競爭內(nèi)源性RNA等多種方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)磷酸化等分子生物學(xué)過程,從而調(diào)控腫瘤的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為,其抑制劑可延緩腫瘤的發(fā)生,進(jìn)而對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展具有重要影響。相關(guān)研究證實(shí)FEZF1-AS1可能通過多種機(jī)制參與調(diào)節(jié)EGFRTKIs耐藥,但仍需要進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)研究來探索FEZF1-AS1在NSCLC的侵襲和癌變中的作用,功能實(shí)驗(yàn)來闡明其與NSCLC臨床預(yù)后不良、耐藥及診斷和治療的關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突