基于網絡藥理學探究葛根治療重癥肌無力的潛在作用機制及實驗驗證

陳茉，文穎娟，楊俊超，吳倩，彭高強，仝武寧

〔摘要〕 目的 運用網絡藥理學探討中藥葛根治療重癥肌無力（myasthenia gravis， MG）的潛在作用機制，通過動物實驗進行初步驗證。方法 運用TCMSP篩選葛根主要活性成分與相關靶點信息;結合UniProt人類基因數據庫，對活性成分進行蛋白質轉化;篩選GeneCards數據庫、Drugbank數據庫、Therapeutic Target Database數據庫中有關MG疾病靶點信息;通過STRING數據庫、Metascape數據庫對中藥-疾病交集作用靶點進行蛋白互作網絡分析;運用R語言對作用靶點進行基因本體GO與KEGG富集分析;采用動物實驗對IL-4、TGF-β1、Bcl-2、Caspase-9等作用靶點進行驗證。結果 共篩選出中藥-疾病相關基因27個，涉及4種中藥活性成分。蛋白互作網絡分析得知IL-4、TGF-β1、Bcl-2、JUN、MAPK 14等可能是葛根治療MG的重要靶點。KEGG分析結果表明，葛根治療MG主要與APOPTOSIS、AGE-RAGE、P13K-Akt、Hepatitis B等多條信號通路有關。動物實驗結果證實，葛根及其復方配伍通過減弱Bcl-2、升高Caspase-9表達，干預骨骼肌細胞凋亡，此外，EAMG大鼠血清中TGF-β1表達上調，AchR-ab、IL-4表達顯著下降，驗證了網絡藥理學的結果。結論 中藥葛根治療MG的主要生物學機制可能與多種因子及信號通路密切相關，葛根及其復方配伍能夠通過影響IL-4、TGF-β1、Bcl-2、Caspase-9表達干預MG的治療。

〔關鍵詞〕 葛根;重癥肌無力;網絡藥理學;信號通路;細胞凋亡;大鼠

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.012

Potential Mechanism and Preliminary Verification of Gegen （Puerariae Lobatae Radix） and its Compound Compatibility in the Treatment of Myasthenia Gravisabout Based on Network Pharmacology

CHEN Mo， WEN Yingjuan*， YANG Junchao， WU Qian， PENG Gaoqiang， TONG Wuning

（Shaanxi University Of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the potential mechanism of Chinese medicine Gegen （Puerariae Lobatae Radix） in the treatment of myasthenia gravis （MG） by using network pharmacology， and to conduct preliminary verification through animal experiments. Methods TCMSP was used to screen the main active ingredients and related target information of Gegen （Puerariae Lobatae Radix）; combined with the UniProt human gene database， the active ingredients were transformed into proteins; the GeneCards database， the Drugbank database， and the Therapeutic Target Database （TTD） were searched and screened for related MG disease targets information; protein-protein interaction （PPI） network of the traditional Chinese medicine-disease interaction target was analyzed by the STRING database and Metascape database; the R language was used to analyze the target point of gene ontology GO and KEGG enrichment; the animal experiments were used to verify IL-4， TGF-β1， Bcl-2， Caspase-9 and other targets. Results A total of 27 Chinese medicine-disease-related genes were screened， involving 4 active ingredients of Chinese medicine. PPI network topology analysis revealed that IL-4， TGF-β1， Bcl-2， JUN， MAPK 14， etc. may be important targets for Gegen （Puerariae Lobatae Radix） in the treatment of MG. KEGG analysis results showed that the treatment of MG by Gegen （Puerariae Lobatae Radix） is mainly related to multiple signaling pathways such as APOPTOSIS， AGE-RAGE， P13K-Akt， and Hepatitis B. Animal experiment results confirmed that Gegen （Puerariae Lobatae Radix） and its compound compatibility can interfere skeletal muscle cell apoptosis by attenuating Bcl-2 and increasing Caspase-9 expression. In addition， the expression of TGF-β1 in the serum of EAMG rats was up-regulated， and the expression of acetylcholine receptor antibody and IL-4 significantly declined， verified the reliability of network pharmacology. Conclusion The main biological mechanism of the traditional Chinese medicine Gegen （Puerariae Lobatae Radix） in treating MG may be closely related to a variety of factors and signal pathways. Gegen （Puerariae Lobatae Radix） and its compound compatibility can interfere the treatment of MG by affecting the expression of IL-4， TGF-β， Bcl-2 and Caspase-9.

〔Keywords〕 Gegen （Puerariae Lobatae Radix）; myasthenia gravis; network pharmacology; signal pathway; apoptosis; rat

重癥肌無力（myasthenia gravis， MG）是一種由自身抗體介導的獲得性神經肌肉接頭（neuromuscular junction， NMJ）傳遞障礙的免疫性疾病，主要受乙酰膽堿受體抗體（acetylcholine receptor antibody， AchR-ab）、肌肉特定受體酪氨酸激酶抗體（muscle skeletal receptor tyrosine kinase antibidy， MuSK-ab）、低密度脂蛋白受體相關蛋白4（lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein， LRP4）、蘭尼堿受體（ryanodine receptor， RyR）等影響，以眼瞼下垂、四肢乏力、肌肉消瘦、吞咽困難等為主要臨床表現[1]。全球患病率約為（150～250）/百萬，我國MG發(fā)病率約為0.68/10萬，臨床多以糖皮質激素、膽堿酯酶抑制劑、血漿置換術、胸腺切除術等方式治療，然不良反應較多、治療乏效[2-3]。因此，近年來選用中醫(yī)藥治療MG受到廣泛關注。

中醫(yī)學認為，MG屬“痿證”范疇[4]，以脾氣虛弱，兼有濁邪堆積為基本病機，治療以“治痿獨取陽明”為基本大法。葛根為豆科植物野葛的干燥根，甘、辛、涼，歸脾、胃經，具有解肌升陽、通經活絡之功。藥理研究[5]證實，葛根具有保護神經、預防骨質疏松、促進細胞增殖、提高免疫力等作用。因此，本研究擬借助網絡藥理學平臺，對葛根治療MG的活性成分及作用靶點進行探析，挖掘葛根治療MG的潛在作用機制，并利用實驗動物模型進行驗證。

1 材料與方法

1.1? 數據庫及軟件

運用中藥系統(tǒng)藥理分析平臺[6]（traditional Chinese medicine systems pharmacology datebase and analysis platform TCMSP， https：//tcmspw.com/tcmsp.php）;UniProt數據庫[7]（https：//www.uniprot.org）;Gene

Cards數據庫[8]（https：//www.genecards.org）;Drugbank數據庫[9]（https：//go.drugbank.com）;Therapeutic Target Database數據庫[10]（http：//db.idrblab.net/ttd/）;STRING數據庫[11]（http：//string-db.org/）;Metascape數據庫[12]（https：//metascape.org/gp/index.html）;R語言（x64.4.0.0）;Cytoscape軟件（Version3.7.2）。

1.2? 葛根活性成分的篩選

運用TCMSP 數據庫，輸入關鍵詞“葛根”，設置口服生物利用度（Oral bioavailability， OB）>20%和類藥性（drug-likeness， DL）>0.18，篩選出中藥葛根的有效成分靶點信息。通過Uniprot數據庫將候選藥物靶點信息轉化為基因名稱。

1.3? 疾病靶點的預測

以“Myasthenia Gravis”為關鍵詞，通過GeneCards、

Drugbank、TTD數據庫檢索并搜集與MG相關的基因信息。對符合MG疾病的相關基因信息與葛根靶點信息進行篩選與匹配，獲取基因活性靶點。

1.4? 蛋白相互作用（protein protein interaction， PPI）網絡構建分析

在STRING數據庫中錄入葛根與MG蛋白作用靶點，得到PPI網絡分析關系信息并繪制VENN圖，運用Cytoscape 3.7.2對網絡信息關系進行分析。

1.5? GO功能與KEEG通路富集分析

在Metascape中，導入葛根與MG共同基因，選擇“sapiens”“custom analysis”，進行“enrichment”富集分析，運用R語言進行圖形繪制。

1.6? 動物實驗驗證

1.6.1? 實驗動物? SPF級8周齡的Lewis大鼠，雌性，體質量160～180 g。由成都達碩實驗動物有限公司提供。飼養(yǎng)場所：陜西中醫(yī)藥大學實驗室，飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級。動物許可證號：SCXK（川）2020-030。動物倫理編號：SUCM-DL20210621001。

1.6.2? 主要藥品、試劑及儀器? 人工合成鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列多肽蛋白（金斯瑞生物科技股份有限公司，貨號：C8385FE270-1）;完全弗氏劑（complete Freunds adjuvant， CFA，美國sigma公司，貨號：F5881）;不完全弗氏試劑（incomplete freunds adjuvant， IFA，美國sigma公司，貨號：F5506）;磷酸緩沖液（phosphate buffer solution， PBS，賽默飛世爾科技公司，貨號：ZLI-9062）;ECL超敏發(fā)光試劑盒（貨號：WB0164）、電泳液（貨號：WB0132）、轉膜液（貨號：WB0154）、一抗稀釋液（貨號：WB0158）、二抗稀釋液（貨號：WB0159）、封閉液（貨號：WB0161）均購自上海威奧生物科技有限公司;GAPDH（貨號：WB0197）、Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體（貨號：bs-0032R）、Caspase-9兔抗大鼠多克隆抗體（貨號：bs-0049R）均購自武漢博士德生物工程有限公司;165-8001型垂直電泳槽、170-3930型Trans-Blot轉印槽均購自Bio-Rad伯樂公司;Multiskan FC 550型酶標儀（賽默飛世爾科技公司）;JY88-II型超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）;SH01D型高速臺式離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司）。

1.6.3? 實驗藥物? 葛根方：葛根20 g;葛芪方：葛根20 g，黃芪15 g;葛參方：葛根20 g，丹參15 g;葛根和四妙散和方（簡稱葛妙方）：葛根20 g，蒼術15 g，黃柏15 g，牛膝15 g，薏苡仁15 g;葛根復方：葛根20 g，黃芪15 g，丹參15 g，蒼術15 g，黃柏15 g，牛膝15 g，薏苡仁15 g。上述中藥均按常規(guī)煎法并分別濃縮成相應的濃縮藥液50 mL，大鼠用量為臨床用量的6.25倍。陽性對照藥：強的松（山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責任公司，5 mg，H20033023），實驗時用0.2%的羧甲基纖維素鈉將其配成0.54 mg/mL混懸液備用。

1.6.4? 分組、造模、治療與取材? 將80只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為8組。復制建立實驗性自身免疫性重癥肌無力（experimental autoimmune myas？鄄

thenia gravis， EAMG）模型[13]。即：首次免疫將R97～116肽段、CFA、PBS三者按1∶1.5∶1.5比例充分混勻成乳劑，取乳劑200 μL（其中包含 R97～116肽段：100 μg）于造模大鼠足墊、腹部、背部行多點皮下注射。對照組注射等量PBS;首次造模后30 d，將R97～116、IFA、PBS三者按1∶3∶3比例充分混勻進行強化接種，15 d后再次強化。對照組注射等量PBS。經肌電圖確認造模成功后，對各組分別進行連續(xù)4周的灌胃治療。各組給藥劑量分別為：葛根組2.08 g/（kg·d），葛芪組3.65 g/（kg·d），葛參組3.65 g/（kg·d），葛妙組8.33 g/（kg·d），葛根復方組11.46 g/（kg· d），強的松組5.4 g/（kg·d），大鼠灌胃給藥體積為10 mL/kg。最后一次灌胃24 h后，處死大鼠取血清并迅速分離其脛骨前肌，以便進行相關實驗指標檢測。

1.6.5? 統(tǒng)計方法? 本研究數據采用SPSS 25.0軟件進行處理，符合正態(tài)分布的數據以“x±s”表示，方差齊則多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，均以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 葛根活性成分

在TCMSP中以OB>20%、DL>0.18為篩選條件并結合文獻檢索共整理出7個葛根活性成分。靶點信息進行逐一對應，共得到葛根活性成分靶點信息184個。利用Uniprot標準化基因信息，并剔除無人類樣本Uniprot ID的基因。見表1。

2.2? MG疾病作用靶點

運用GeneCards數據庫、Drugbank數據庫、TTD數據庫共檢索到涉及MG的相關靶點信息845個。

2.3? 藥物活性成分-疾病靶點圖建構

葛根活性成分對應靶點與MG相關作用靶點取交集，通過VENN圖顯示（見圖1），共獲取活性成分-疾病靶點基因27個，對應葛根4個活性成分。見圖2、表2。

2.4? PPI網絡構建與篩選

將通過STRING數據庫將獲取的27個靶點基因信息進行PPI網絡分析，數據以tsv格式導入CYTOSCAPE3.7.2進行圖像繪制。見圖3。

2.5? GO生物功能富集分析

GO注釋涉及分子功能（GOBP）、生物過程（GOCC）、細胞組成（GOMF）三部分。對27個藥物活性成分-疾病靶點基因進行分析，得到GO功能富集網絡柱狀圖（見圖4）。在GOBP中排名靠前的主要包括：膜電位調節(jié)、跨膜傳輸的調節(jié)、化學突觸傳遞、DNA結合轉錄因子活性的調控等;GOCC以突觸、復雜離子通道、膜閥為主;GOMF強調蛋白質同源二聚化活動、蛋白磷酸酶結合、細胞因子受體結合、泛素蛋白連接酶、乙酰膽堿受體活動等多個方面。

2.6? 葛根治療MG作用靶點KEGG通路富集分析

KEGG結果顯示：27個靶點顯著富集在癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、糖尿病并發(fā)癥AGR受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導（adrenergic signaling in cardiomyocytes）、凋亡通路（apoptosis）、P13K-Akt通路（PI3K-Akt signaling pathway）、神經活性配體-受體相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、癌癥（pathways in cancer）、乙型肝炎（hepatitis B）等多條信號通路。見圖5。

2.7? 動物實驗驗證

2.7.1? 葛根及其復方配伍對EAMG大鼠體質量的影響? 通過測量各組體質量發(fā)現，首次免疫前，與空白組相比，各組大鼠體質量差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.4479>0.05）。經AchR免疫后，各實驗組大鼠體質量增長緩慢，從第4周開始，各實驗組體質量明顯低于空白組（P<0.01），免疫后6周，與空白組相比，各實驗組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。用藥干預后，各用藥組體質量均呈增長趨勢（P<0.01）。其中以強的松組、葛根復方組增長最為顯著。見表3。

2.7.2? 葛根及其復方配伍對EAMG大鼠肌力的影響? 經肌電圖檢測得出，與空白組相比，模型組大鼠肌力明顯減弱，與模型組相比，各治療組大鼠肌力明顯恢復（P<0.05），其中強的松組、葛根復方組振幅波動小（P<0.01），肌力恢復程度明顯。見圖6。

2.7.3? 葛根及其復方配伍對EAMG大鼠血清AchR-ab的影響（n=10）? 與空白組相比，模型組大鼠血清AchR-ab含量升高（P<0.01），與模型組相比，各治療組AchR-ab表達下調明顯（P<0.01）。見表4。

2.7.4? 葛根及其復方配伍對EAMG大鼠IL-4表達的影響? 治療前，與空白組相比，各組EAMG大鼠血清中IL-4表達明顯升高（P<0.01）;藥物治療后，與模型組相比，各治療組大鼠血清IL-4表達均出現下調（P<0.05），其中以強的松組、葛根復方組最為顯著（P<0.01）。與空白組相比，治療前各組EAMG大鼠血清中TGF-β1表達顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，各治療組大鼠血清TGF-β1表達明顯升高（P<0.05）。見表5。

2.7.5? 葛根及其復方配伍對EAMG大鼠細胞凋亡通路蛋白的影響? 與空白組相比，模型組Bcl-2蛋白表達量顯著增加（P<0.01）、Caspase-9蛋白表達量明顯下降（P<0.01）;與模型組相比，各治療組Bcl-2表達量下調（P<0.01），Caspase-9表達量升高（P<0.01），其中以葛根復方組蛋白含量變化最為明顯。見表6和圖7。

3 討論

MG屬中醫(yī)“痿證”范疇，臟腑定位主要責之于脾[14]。脾胃為氣血生化之源，肉輪亦歸屬于脾，若脾胃氣血不足，肌肉發(fā)育和運動功能發(fā)生障礙，出現眼瞼下垂、肌肉消瘦、四肢無力等癥狀;此外，足太陰脾經連舌本，散舌下，吞咽咀嚼功能亦歸屬為脾，脾胃受損，則咀嚼無力。葛根，甘、辛、涼，歸脾胃經。《藥類法象》載：“葛根，治脾胃虛而渴，善解酒毒，通行足陽明脈經之藥”，“十一五”國家級規(guī)劃教材《中藥學》中亦提出：“葛根具有解肌、升陽、生津之功，能夠調節(jié)肌肉運動，升發(fā)脾胃陽氣，以養(yǎng)機體?！盵15]國家級名老中醫(yī)周仲瑛[16]、裘昌林[17]、李聲岳等[18]均以葛根為主配伍治療MG，療效確切。

因此，本文以網絡藥理學為工具，對葛根治療MG的潛在作用靶點進行預測與分析，并結合MG脾胃虛弱，虛、瘀、濕邪夾雜、痰濁壅滯的基本病機，選取健脾益氣之黃芪、活血化瘀之丹參、祛濕化痰、通絡治痿之四妙散與葛根配伍干預EAMG的治療，驗證網絡藥理學結果，以期為臨床應用中醫(yī)藥治療MG提供一定的思路與方向。

本次研究發(fā)現，葛根治療MG的相關活性成分主要包括葛根素、芒柄花黃素、β-谷甾醇、西托糖苷。葛根素作為治療MG的主要成分，不僅能夠增強大鼠肢體拉力、增加肌肉力量，改善肌萎縮[19]，同時，通過PINK/PARKIN1途徑修復損傷線粒體[20]，降低RNS衰減度、電壓依賴性陰離子通道VDAC的水平、抑制AchR-ab表達[21]、保護神經、增強免疫力[22]。

KEGG通路富集和PPI相互作用網絡圖表明，SOD1、IL-4、TGF-β1、Bcl-2、NOS2、MAPK14、ESR1、JUN、IFN-β1、TNF-α等基因與葛根治療MG密切相關，AGE-RAGE、細胞凋亡、P13K-Akt、Hepatitis B等可能成為葛根治療MG的主要通路。相關研究發(fā)現[23]，MG患者體內線粒體SOD水平下降、IL-4表達升高。Bcl-2 家族蛋白作為細胞凋亡的主要調控因子，若胞內Bcl-2蛋白上調，機體自身免疫性B淋巴細胞逃脫陽性選擇，AchR-ab過量產生，抑制正常細胞凋亡，將誘發(fā)MG[24-25]。李曉峰等[26]發(fā)現，通過上調免疫抑制性細胞因子TGF-β1表達，促進IFN-γ、NO水平，能夠降低MG患者血清AChR-ab表達，起到積極的治療作用，證實了本次網絡藥理學結果的可靠性。

動物實驗研究結果證實，EAMG大鼠存在骨骼肌細胞凋亡受抑制現象。葛根及其復方配伍通過上調Bcl-2蛋白表達、減弱Caspase-9蛋白含量，干預IL-4、TGF-β1表達，降低AchR-ab含量，起到恢復EAMG大鼠骨骼肌細胞凋亡，降低炎癥因子表達，提高骨骼肌肌力，治療MG的作用。與此同時，本次實驗研究證實，除胸腺組織細胞凋亡受抑制外[27-28]，EAMG大鼠骨骼肌細胞凋亡同樣受到明顯抑制;葛根及其復方配伍通過調節(jié)EAMG大鼠心肌[29]、骨骼肌[30]、胸腺組織[31]相關蛋白表達，可以在一定程度上參與MG的治療。

綜上所述，本次研究借助網絡藥理學對葛根治療MG的治療靶點進行分析，預測了葛根能夠通過多成分、多途徑、多靶點參與MG的治療。經動物實驗初步證實，在EAMG的發(fā)病過程中存在骨骼肌細胞凋亡受抑制現象，葛根及其復方配伍通過調節(jié)EAMG大鼠骨骼肌IL-4、TGF-β1、Bcl-2、Caspase-9蛋白表達，能夠在一定程度上恢復骨骼肌細胞凋亡，減弱相關炎癥反應，降低AchR-ab表達，治療MG的作用，證實網絡藥理學結果。那么，本課題組將在下一步實驗中進一步深入探究葛根及其復方配伍對MAPK14、JUN、VEGFA等蛋白因子表達的影響以及調控PI3K-Akt等信號通路參與EAMG的治療，以期為臨床應用葛根治療重癥肌無力提供依據。

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（本文編輯? 蘇? 維）