天山花楸葉黃酮提取物抗心肌缺血再灌注損傷作用機(jī)理分析

林偉，熊尚全

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建福州 350000

抗心肌缺血再灌注損傷（MIRI）為臨床常見(jiàn)現(xiàn)象，對(duì)機(jī)體危害性強(qiáng)，極易導(dǎo)致病死[1]。MIRI 是加重心肌梗死的重要原因。為預(yù)防病死，應(yīng)進(jìn)行促進(jìn)心肌血氧供恢復(fù)治療[2]。血供恢復(fù)中極易造成再灌注損傷，加重細(xì)胞損傷，或致不可逆損傷，在此過(guò)程中心肌代謝、心功能和電生理功能等都可能加重受損，出現(xiàn)心肌梗死范圍擴(kuò)大、心律失?；蛐募〗M織缺血性壞死[3]。天山花楸葉是新疆地區(qū)出產(chǎn)的天然藥材，常用于咳、喘、痰瘀等治療。現(xiàn)代研究顯示，該藥可舒張心肌血管，改善心肌缺血[4]。相關(guān)研究證明黃酮類(lèi)成分可治療心肌缺血和抗氧化，但對(duì)天山花楸葉中所含有的黃酮提取物在MIRI 治療中的作用機(jī)制研究較少[5]。該文選取2020 年1 月—2021 年1 月大鼠試驗(yàn)樣本50 只，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為主要方法，篩選藥物化合成分，定位抗MIRI 的有效成分和作用靶點(diǎn)，評(píng)價(jià)其藥效學(xué)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

①試劑：選用自制91%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的天山花楸總黃酮。鹽酸、氯化鎂、氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈣等選用國(guó)產(chǎn)試劑。mPTP 孔抑制劑選用CDZ，用于陽(yáng)性對(duì)照。SOD、T-AOC 線粒體制備試劑盒。

②樣本：選用SD 大鼠（雄性）作為試驗(yàn)體樣本，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。提前1 周領(lǐng)取樣本適應(yīng)環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，自由飲食。

③設(shè)備：使用離心心臟灌注設(shè)備、天平、多功能酶標(biāo)儀、超聲波清洗器以及超低溫冰箱、離心機(jī)、切片機(jī)、勻漿機(jī)等標(biāo)準(zhǔn)操作儀器設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 試劑調(diào)配 配制K-H 灌流液、肝素鈉溶液、總黃酮溶液、CDZ 溶液和水合氯醛溶液。

1.2.2 明確藥物靶標(biāo) 根據(jù)ADME/T 標(biāo)準(zhǔn)篩選有效化合物以及核心靶標(biāo)，定位藥物靶標(biāo)，構(gòu)建相關(guān)互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)與大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。

1.2.3 用藥方法 ①對(duì)照組（n=10）：使用K-H 灌注液給藥，在恒壓狀態(tài)下進(jìn)行110 min 灌注。②模型組（n=10）：K-H 液20 min 灌注，予以20 min 全心停灌，然后予KH 液60 min 復(fù)灌。③高劑量FST 組（n=10）：予K-H 液20 min 灌注，再灌注10 min 總黃酮，劑量為1.5 mg/L，然后停灌20 min，K-H 液復(fù)灌60 min。④低劑量FST 組（n=10）：予K-H 液20 min 灌注后，使用0.5 mg/L 金絲桃苷實(shí)施10 min 灌注，停灌20 min，K-H 液復(fù)灌60 min。⑤CDZ 組（抑制劑組）（n=10）：予K-H 液20 min 灌注，1 μmol/L 含抑制劑 灌注液灌注20 min，停灌20 min，K-H 液復(fù)灌60 min。

1.3 觀察指標(biāo)

檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)情況、梗死面積，進(jìn)行病理檢查，分析FST 預(yù)處理和氧化應(yīng)激、mPTP 孔開(kāi)放相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選化合物

天山花楸葉可提取化合物62 個(gè)，從中篩選獲得34個(gè)候選化合物。候選化合物中，金絲桃苷和蘆丁口服用藥時(shí)難以被有效利用，然而含量豐富，藥理學(xué)活性較廣，其余成分類(lèi)藥性較好，口服用藥生物利用率較高。在上述成分中，靶點(diǎn)數(shù)目較高度分子包括黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)3 種。上述分子可針對(duì)多靶點(diǎn)起效，藥理活性多樣化。小鼠實(shí)驗(yàn)證明，該藥粗提物可活化超氧化物歧化酶，抑制丙二醛與乳酸脫氫酶，緩解ISO 引起的急性缺血損傷。相關(guān)試驗(yàn)顯示，天山花楸醋酸乙醇提取物可抗MIRI，其揮發(fā)油成分可對(duì)至少9 種病菌產(chǎn)生抑制作用。

2.2 化合物與靶標(biāo)和疾病關(guān)系分析

利用數(shù)據(jù)庫(kù)篩選34 個(gè)候選化合物的靶標(biāo)，通過(guò)對(duì)839 個(gè)靶標(biāo)去重處理，總計(jì)265 個(gè)靶標(biāo)。靶標(biāo)度值降序排序，篩除度值＜4 的靶標(biāo)，其中與候選化合物相關(guān)性密切的靶標(biāo)為78 個(gè)。利用數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶標(biāo)相關(guān)疾病，總計(jì)31 類(lèi)443 種，32 種與心血管疾病相關(guān)，29 個(gè)靶標(biāo)（占比37%）關(guān)于心血管疾病。經(jīng)分析，TSPO 是心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)，黃酮類(lèi)化合物是核心化合物。

2.3 靶標(biāo)蛋白分析

針對(duì)34 個(gè)相關(guān)化合物構(gòu)建靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)予以分析，可確定TSPO 為關(guān)鍵靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)和黃酮類(lèi)化合物具有緊密聯(lián)系。TSPO 屬于苯二氮卓類(lèi)受體，在心血管病程中和氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有影響作用。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，TSPO 可通過(guò)調(diào)節(jié)呼吸鏈、線粒體膜電位調(diào)控線粒體功能，對(duì)ATP 水解、合成產(chǎn)生影響，ROS 形成與促凋亡蛋白也受其影響。

mPTP 孔開(kāi)放抑制可通過(guò)TSPO 抑制實(shí)現(xiàn)，心肌血氧供應(yīng)阻斷或再灌注導(dǎo)致能量代謝異常，減弱ATP 依賴(lài)型質(zhì)子泵作用，造成線粒體跨膜電位減弱和失衡。多因素影響下，mPTP 開(kāi)放性增強(qiáng)，提升線粒體膜通透性，消除或減弱線粒體跨膜電位，繼而增強(qiáng)mPTP 開(kāi)放性，形成不良循環(huán)。為抑制mPTP 開(kāi)放，可抑制TSPO，抑制氧化過(guò)激，調(diào)節(jié)線粒體膜電位和細(xì)胞鈣離子，預(yù)防鈣超載，促進(jìn)線粒體ATP 穩(wěn)定供應(yīng)，降低ROS 活性，對(duì)再灌注損傷予以防控。

2.4 血流動(dòng)力學(xué)分析

針對(duì)大鼠MIRI 進(jìn)行建模，可知再灌注后，樣本心肌細(xì)胞舒縮水平在模型組中降低，高劑量FST 組和低劑量FST 組輸送功能增強(qiáng)，CDZ 組有一致性表現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（）

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（）

注：較之對(duì)照組，*P＜0.05，**P＜0.01；較之模型組，*P＜0.05，**P＜0.01，1mmHg=1.333 Pa

2.5 TTC 染色心肌梗死影響分析

對(duì)照組心肌梗死面積占比為（2.21±0.13）%，模型組占比為（72.03±6.82）%，模型組占比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.579，P=0.011）。高劑量FST 組占比（46.19±4.58）%，低劑量FST 組為（62.71±5.29）%，抑制劑組為（50.24±4.80）%，上述各組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.62，P=0.013）。提示上述用藥方式皆可促進(jìn)心肌組織保護(hù)，緩解心肌梗死。在眾組中，高劑量用藥效果較先顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.403，P=0.017）。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌梗死面積比較[（）,%]

表2 各組心肌梗死面積比較[（）,%]

2.6 HE 染色分析

對(duì)樣本進(jìn)行HE 染色處理，借助顯微鏡分析心肌組織病理切片。樣本觀察顯示：

①對(duì)照組未見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)顯著異常，心肌細(xì)胞處于有序排列狀態(tài)，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，可見(jiàn)清晰肌纖維橫紋，未見(jiàn)炎癥性腫脹、壞死發(fā)生，未發(fā)生肥大或萎縮，具有較完整的長(zhǎng)橢圓核形態(tài)。觀察細(xì)胞外膜、間質(zhì)和相關(guān)血管，皆為正常狀態(tài)。

②觀察模型組樣本時(shí)，可見(jiàn)心肌發(fā)生明顯病理變化，細(xì)胞排列紊亂且稀疏。心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹狀態(tài)，肌纖維間隙擴(kuò)大，肌纖維橫紋發(fā)生斷裂跡象或消失。部分心肌細(xì)胞發(fā)生局灶性壞死或崩解，可見(jiàn)心肌細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)充血，發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

③觀察高劑量組可見(jiàn)心肌病理變化緩解，肌纖維排列稍顯稀疏但較整齊，可見(jiàn)輕度腫脹，未見(jiàn)局灶性水腫或脂肪變性，心肌纖維未見(jiàn)斷裂表現(xiàn)，炎性細(xì)胞影響范圍縮小。

④在低劑量組中，對(duì)比模型組，心肌病理變化較弱，纖維排列稍見(jiàn)稀疏和紊亂，水腫程度較輕。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維橫紋斷裂、消失的情況較輕。

⑤在抑制劑組中，心肌病理變化緩解，細(xì)胞整齊排列，肌纖維較稀疏，可見(jiàn)輕度細(xì)胞腫脹，未見(jiàn)局灶性細(xì)胞脂肪變性，少見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未發(fā)生肌纖維斷裂情況。

2.7 心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)與FST 相關(guān)性分析

FST 可提升心肌組織抗氧化水平，抑制再灌注損傷。較對(duì)照組，模型組SOD、CAT 等活性減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.221、44.159，P=0.020、0.024），MDA 活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.735，P=0.021）。較模型組，其余各組CAT、SOD 活性增強(qiáng)，MDA 活性較弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)比較[（）,U/mg]

表3 各組心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)比較[（）,U/mg]

2.8 大鼠mPTP 孔開(kāi)放和黃酮提取物的相關(guān)性分析

mPTP 孔開(kāi)放條件是CaCl2達(dá)到200 μmol/L，在此條件下，線粒體A520 指標(biāo)下降。較之模型組，各組可有效抑制mPTP 開(kāi)放，緩解線粒體腫脹。

3 討論

3.1 中草藥對(duì)心血管疾病的適用性

在現(xiàn)代，心血管疾病是威脅生命安全的高發(fā)病。相關(guān)研究顯示，心血管疾病病死率在現(xiàn)代疾病中占比最高[6]。導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的原因較多，遺傳因素、飲食，以及肥胖等，均為關(guān)鍵因素。一旦疾病發(fā)生，患者極容易死亡。在因病死亡人群中，超過(guò)40%是因心血管病死亡[7]。為降低病死率，有效防控心血管疾病具有必要性。生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)不良是心血管疾病的常見(jiàn)消極因素，通過(guò)促進(jìn)健康作息與飲食可促進(jìn)預(yù)防，在其治療中，需要積極探索不良反應(yīng)低、藥效顯著的藥物[8]。中草藥屬于天然藥物，此類(lèi)藥物自然生成，不同藥材成分和藥效各異，為疾病治療提供助力。通過(guò)中草藥研究，研究者們從藥物提取物中發(fā)現(xiàn)更多可用于心血管病癥治療的有效成分[9]。

3.2 缺血性心臟病的臨床特點(diǎn)

缺血性心臟病是現(xiàn)代常見(jiàn)高病死率疾病，對(duì)生存質(zhì)量和存活期有顯著消極影響。在臨床治療中，可采用介入療法、用藥治療或采用超聲療法，也可進(jìn)行基因治療。藥物治療風(fēng)險(xiǎn)較低，適用范圍廣，為常用手段。為此，醫(yī)學(xué)研究致力于發(fā)掘?qū)ΠY藥物，促進(jìn)有效治療[10]。

心肌血氧供應(yīng)中斷或不足對(duì)心肌細(xì)胞器、心肌酶結(jié)構(gòu)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化有不良影響，損傷心肌功能，分析其內(nèi)在原因，是因缺血誘發(fā)細(xì)胞鈣超載，導(dǎo)致自由基含量提升，影響線粒體能量無(wú)法常規(guī)合成[11]。因血氧缺失影響出現(xiàn)線粒體損傷，此種損傷蔓延，對(duì)細(xì)胞宏觀功能造成破壞。在抑制和修復(fù)缺血性損傷時(shí)，治療要點(diǎn)是促進(jìn)血供恢復(fù)[12]。有研究人員對(duì)狗進(jìn)行心肌缺血損傷治療試驗(yàn)，在試驗(yàn)中，結(jié)扎狗冠狀動(dòng)脈，使其持續(xù)缺血，然后解除結(jié)扎恢復(fù)血供，血流灌注恢復(fù)較突然，該過(guò)程引起室顫，造成狗死亡[13]。

3.3 MIRI 治療理念與黃酮類(lèi)化合物應(yīng)用

醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展后，有研究者提出MIRI 概念，醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，心肌缺血后血供恢復(fù)過(guò)程極易發(fā)生重癥損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能等變化，影響常規(guī)代謝，此種損傷較之缺血損傷更嚴(yán)重，或見(jiàn)不可逆損傷[14]。醫(yī)學(xué)研究顯示，黃酮類(lèi)化合物可改善心腦組織缺血問(wèn)題，對(duì)組織氧化和衰老具有抑制作用，還可抑制腫瘤和炎性反應(yīng)，對(duì)氧自由基具有清除作用，還可提升免疫力。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，在MIRI 預(yù)防中黃酮類(lèi)化合物可發(fā)揮有效作用[15]。

3.4 該次研究發(fā)現(xiàn)

該次研究中，以天山花楸葉為研究對(duì)象，提取其化合物，應(yīng)用軟件建模，分析化合物與靶標(biāo)和疾病之間的相關(guān)性，經(jīng)過(guò)研究可知靶標(biāo)中和心血管疾病聯(lián)系密切的成分總計(jì)29 個(gè)，29 個(gè)靶標(biāo)中TSPO 為核心靶標(biāo)，直接影響心肌缺血，黃酮類(lèi)化合物是核心化學(xué)物分子。針對(duì)心血管疾病和相關(guān)靶標(biāo)蛋白創(chuàng)建互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行驗(yàn)證，顯示TSPO 為核心靶點(diǎn)。該靶點(diǎn)可對(duì)線粒體功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)線粒體電位造成影響，并可影響能量代謝過(guò)程。為對(duì)線粒體膜mPTP 孔進(jìn)行開(kāi)放干預(yù)，可抑制TSPO，促進(jìn)mPTP 孔閉合，通過(guò)此干預(yù)穩(wěn)定線粒體膜電位，避免發(fā)生鈣超載，減少氧自由基產(chǎn)生，緩解再灌注損傷，調(diào)節(jié)能量代謝狀態(tài)。

該研究經(jīng)提取物用藥后分析顯示，心肌梗死情況在高劑量組中得到有效抑制，心肌梗死面積控制在46.19%左右。同類(lèi)研究中，使用高劑量后也可見(jiàn)一致性表現(xiàn)，在該研究中，高劑量用藥后心肌梗死面積為46.22%左右[16]。

3.5 用藥方案深度分析

通過(guò)模型構(gòu)建，監(jiān)測(cè)再灌注全周期中血流動(dòng)力學(xué)變化[16]，對(duì)比模型組，顯示從天山花楸葉中提取的黃酮化合物可顯著增強(qiáng)心肌收縮力和心功能，降低再灌注損傷。分析TTC 染色結(jié)果，高劑量預(yù)處理可緩解再灌注誘發(fā)的心肌梗死，縮小損傷面積。

切片觀察心肌組織顯示，高劑量預(yù)處理可修復(fù)再灌注后心肌細(xì)胞腫脹，緩解炎性細(xì)胞浸潤(rùn)問(wèn)題，抑制心肌纖維斷裂。經(jīng)過(guò)心肌組織病理分析可直觀了解心肌組織在再灌注中發(fā)生的損傷。再灌注發(fā)生時(shí)，線粒體無(wú)法常規(guī)進(jìn)行氧化磷酸化過(guò)程，中性粒細(xì)胞發(fā)生大規(guī)模聚集，加之黃嘌呤在水解過(guò)程中過(guò)度生成活性氧自由基，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化作用加重，通透性增強(qiáng)，酶與蛋白質(zhì)受損，結(jié)構(gòu)功能由此發(fā)生變化，核酸、染色體受到攻擊，加速細(xì)胞凋亡[17]。

為分析氧自由基造成的心肌組織損傷，對(duì)MDA 指標(biāo)、SOD 指標(biāo)以及CAT 指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)T-AOC 分析可評(píng)價(jià)心肌組織宏觀抗氧化水平。當(dāng)鈣離子超載時(shí)，線粒體膜中mPTP 受此影響開(kāi)放，粒子中＜1 500 質(zhì)量的部分大量透過(guò)mPTP 在線粒體基質(zhì)中發(fā)生作用并提升線粒體滲透壓，誘發(fā)線粒體水腫，此種腫脹導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝異常加重，心肌組織因此受損。較之模型組，CDZ 組、FST 預(yù)處理用藥等可抑制mPTP 孔開(kāi)放，緩解鈣超載以及細(xì)胞腫脹導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[18]。

綜上所述，天山花楸葉中提取的黃酮化合物可調(diào)節(jié)心肌舒縮水平，縮小心肌梗死面積，緩解心肌細(xì)胞腫脹，抑制氧化應(yīng)激損傷。對(duì)TSPO 靶標(biāo)蛋白對(duì)癥施加影響后，線粒體mPTP 孔開(kāi)放得到有效抑制，線粒體腫脹顯著緩解，能量代謝優(yōu)化，防控再灌注損傷。