基于香氣物質(zhì)進(jìn)行烏龍茶核心種質(zhì)構(gòu)建與遺傳評(píng)估

孔祥瑞，楊 軍，林梓溪，馬定國(guó)，王讓劍*，陳常頌*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福州 350013；2.國(guó)家茶葉質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，福建 安溪 362441；3.福安市碧海藍(lán)天農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，福建 福安 355000)

核心種質(zhì)作為種質(zhì)資源少而精的縮影性群體，是遺傳理論研究和育種親本選配的重要基礎(chǔ)[1]。因此，核心種質(zhì)構(gòu)建長(zhǎng)期以來(lái)始終是植物育種研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)[2-3]。以水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、油菜等為代表的大宗作物[4-8]和以樟木、木荷等為代表的木本經(jīng)濟(jì)作物[9-11]，都取得了一系列突破性進(jìn)展。同時(shí)，在取樣策略、評(píng)價(jià)指數(shù)、分析流程等方面積累了很多值得借鑒的技術(shù)[12-18]。

茶樹(shù)作為南方山區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物，核心種質(zhì)構(gòu)建也有相關(guān)文獻(xiàn)可供查閱[19-25]，但專(zhuān)門(mén)針對(duì)烏龍茶的核心種質(zhì)構(gòu)建的研究卻鮮有報(bào)道。從上個(gè)世紀(jì)五六十年代開(kāi)始，烏龍茶育種研究方向正式確立[26,27]，經(jīng)過(guò)近70年的發(fā)展，在品種和資源數(shù)量上有了很大的積累。截至目前，我國(guó)被收集保存的烏龍茶品種和名貴單樅總數(shù)80余個(gè)，占我國(guó)茶樹(shù)品種總數(shù)20%以上[28]。Lin等[29]研究發(fā)現(xiàn)，烏龍茶品種群體內(nèi)具有較高的遺傳多樣性。不斷增長(zhǎng)的資源(含品種)數(shù)量和豐富的遺傳多樣性，為開(kāi)展烏龍茶核心種質(zhì)構(gòu)建提供了客觀(guān)條件。

烏龍茶有別于其他茶類(lèi)最顯著的特征是具有自然優(yōu)雅的花果香，本研究選擇鐵觀(guān)音、黃棪、茗科1號(hào)(金觀(guān)音)等12個(gè)在生產(chǎn)應(yīng)用上綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)異，極具高香特征的烏龍茶品種，以揮發(fā)性香氣物質(zhì)為表型性狀，嘗試構(gòu)建烏龍茶核心種質(zhì)篩選技術(shù)流程，并結(jié)合SSR標(biāo)記，對(duì)篩選前后2個(gè)種群的遺傳多樣性進(jìn)行比較分析，從而全面評(píng)價(jià)整套分析流程的可行性。以期為烏龍茶核心種質(zhì)篩選評(píng)價(jià)和烏龍茶雜交育種親本選配提供理論與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇福建省福安市碧海藍(lán)天農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司福安基地的12個(gè)茶樹(shù)品種(種質(zhì))為試驗(yàn)材料(表1)，均為3齡期無(wú)性系植株，田間管理屬同一立地條件隨機(jī)區(qū)組種植。2020年10月，以一芽三葉為標(biāo)準(zhǔn)，用液氮取樣，每個(gè)品種設(shè)3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

表1 12個(gè)供試品種(種質(zhì))基本情況

1.2 香氣組分測(cè)定

樣品預(yù)處理參照李麗霞等[30]的方法，取1.0 g冷凍干燥樣，加入3.2 g NaCl和5 mL 60℃超純水，加蓋密封后在60℃條件下水浴10 min，再經(jīng)固相微萃取50 min和進(jìn)樣口230℃高溫解析共5 min，-20℃密封保存、待測(cè)。

色譜條件：美國(guó)Agilent公司DB-5(3 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱箱：40℃；進(jìn)樣口溫度：230℃；載氣：氦氣；采用不分流進(jìn)樣；流速：1.0 mL·min-1。升溫程序：先40℃保持2 min，以5℃·min-1升溫至85℃保持2 min，再以2℃·min-1升溫至110℃保持2 min，最后以7℃·min-1升溫至220℃保持8 min，總分析時(shí)間為123.5 min。

質(zhì)譜條件：EI電離能量：70 eV；掃描范圍為質(zhì)荷比(m/z)35～400；離子源溫度：230℃。

香氣物質(zhì)的定性與定量：對(duì)獲得的揮發(fā)性成分總離子色譜圖，通過(guò)檢索mainlib、replib和nist_ri譜庫(kù)完成定性；依據(jù)峰面積歸一化進(jìn)行定量。并與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果比較[31-33]，完成最終確認(rèn)。

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

核心種質(zhì)構(gòu)建通過(guò)QGAStation實(shí)現(xiàn)[34]，抽樣比率設(shè)置為0.25，抽樣方法選多次聚類(lèi)隨機(jī)取樣法，遺傳距離選馬氏距離。

1.4 遺傳多樣性分析

DNA提取和SSR分析參考王讓劍等[35]的方法。群體間遺傳距離及遺傳多樣性指數(shù)等通過(guò)軟件Powermarker計(jì)算[36]，其中基因型bp轉(zhuǎn)0、1數(shù)據(jù)通過(guò)軟件DataFormater完成[37]。個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)組成分析由R語(yǔ)言L(fǎng)EA軟件包實(shí)現(xiàn)[38]，其他相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及圖表繪制也均由R語(yǔ)言的ggplot2、export等包完成[39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣組分的GC-MS分析

經(jīng)SPME-GC-MS獲得香氣組分之后，在控制同一香氣物質(zhì)在不同品種間的保留時(shí)間≤0.1 min的條件下，可分離鑒定出的香氣主要成分見(jiàn)表2。

表2 12個(gè)烏龍茶品種GC-MS分離主要香氣成分相對(duì)含量

2.2 核心香氣組分篩選

因?yàn)楹诵姆N質(zhì)的分析過(guò)程需要構(gòu)建非等長(zhǎng)矩陣，即性狀值必須少于品種數(shù)，所以，對(duì)上述30個(gè)香氣物質(zhì)進(jìn)行核心成分篩選分析，通過(guò)軟件QGAStation，將抽樣比率設(shè)置為0.25，在多次隨機(jī)抽樣之后，根據(jù)核心香氣成分與原總香氣成分2個(gè)種群之間的差異統(tǒng)計(jì)分析，在均值未達(dá)到差異顯著性水平和極差、變異系數(shù)變化趨勢(shì)一致的情況下，獲得橙花叔醇、芳樟醇、香葉醇等7個(gè)香氣成分，初步將其作為典型表型性狀供核心種質(zhì)篩選使用，差異統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 核心香氣成分與原香氣成分之間差異分析結(jié)果

2.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

在篩選獲得核心香氣組分的條件下，同樣使用軟件QGAStation，將抽樣比率設(shè)置為0.25，以多次聚類(lèi)隨機(jī)取樣法進(jìn)行烏龍茶核心種質(zhì)篩選，其中遺傳距離選用馬氏距離。結(jié)果表明，基于核心香氣組分，12個(gè)供試品種中可以篩選獲得3個(gè)核心種質(zhì)，分別是金牡丹、鐵觀(guān)音和悅茗香。這3個(gè)品種構(gòu)建的核心種質(zhì)與包括12個(gè)品種的原種質(zhì)種群相比，在各個(gè)核心香氣組分表型上的差異統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表4。核心種質(zhì)與原始種質(zhì)之間，除芳樟醇氧化物I的方差呈現(xiàn)P<0.05顯著差異之外，其他所有性狀的均值、方差差異百分率都為0，即無(wú)顯著性差異。此外，核心種質(zhì)與原始種質(zhì)間在7個(gè)核心香氣表型上的極差和變異系數(shù)高度對(duì)應(yīng)，極差符合率為67.97，變異系數(shù)變化率為105.27，綜合多個(gè)統(tǒng)計(jì)參數(shù)，證明篩選出的核心種質(zhì)對(duì)供試群體具有較好的表征力。

表4 核心種質(zhì)與原種質(zhì)間表型差異

2.4 核心種質(zhì)遺傳評(píng)估

2.4.1 遺傳多樣性分析 為了進(jìn)一步考察整個(gè)核心種質(zhì)構(gòu)建流程的可靠性，本研究對(duì)所有參試品種進(jìn)行了40對(duì)SSR引物的基因型分型分析，在12份供試材料上共檢測(cè)到161個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，涉及200個(gè)等位變異，平均等位變異數(shù)為4.03，多態(tài)性信息含量(PIC)均值為0.50，說(shuō)明這40對(duì)引物適合揭示該群體的遺傳多樣性。通過(guò)計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)核心種質(zhì)種群的多樣性指數(shù)變幅為0.08～0.77，可以完全涵蓋原始群體的均值0.55水平，且2個(gè)種群間的遺傳距離為0.133，從而在遺傳水平上進(jìn)一步證實(shí)了核心種質(zhì)具有很好的群體表征力。

2.4.2 遺傳背景分析 借鑒群體遺傳學(xué)中常用的群體結(jié)構(gòu)分析，采用LEA軟件包的Structure功能來(lái)深入考察核心種質(zhì)個(gè)體遺傳背景的代表性，參照Evanno等的方法[40]，在K值等于3時(shí)，ΔK出現(xiàn)最大值拐點(diǎn)，因此將該供試群體暫定分為3個(gè)亞群來(lái)繪制Structure圖。結(jié)果顯示(圖1)，金牡丹、鐵觀(guān)音和悅茗香在個(gè)體遺傳組成上具有高水平的亞群代表性，更進(jìn)一步證實(shí)了這3份材料被篩選成為核心種質(zhì)的合理性。

圖1 12份烏龍茶品種的群體結(jié)構(gòu)圖

3 討論與結(jié)論

3.1 核心種質(zhì)構(gòu)建分析流程

核心種質(zhì)構(gòu)建作為動(dòng)植物資源育種的核心研究?jī)?nèi)容，從最初的單純依照表型篩選，到現(xiàn)在的多組學(xué)聯(lián)合分析，呈現(xiàn)出了解析力度大、精度高的發(fā)展趨勢(shì)，同時(shí)也對(duì)相應(yīng)抽樣策略和評(píng)估算法提出了更高的要求。本研究采用的抽樣和評(píng)估方法均為當(dāng)前的主流算法，根據(jù)分析結(jié)果來(lái)看，在以代謝物作為表型，應(yīng)用多次聚類(lèi)隨機(jī)取樣法可以滿(mǎn)足烏龍茶核心種質(zhì)篩選需求，并通過(guò)標(biāo)記基因型解析方法輔以驗(yàn)證，進(jìn)一步保證了分析結(jié)果的正確率。理論上，該分析流程也應(yīng)該能夠滿(mǎn)足以其他表型值為目標(biāo)性狀的篩選需求。故此，穩(wěn)健的烏龍茶核心種質(zhì)構(gòu)建分析流程可由極具擴(kuò)展度的表型值、取樣算法和遺傳評(píng)估組成(圖2)。

圖2 烏龍茶核心種質(zhì)篩選分析流程

3.2 小樣本抽樣表型值的取舍

在高通量測(cè)試技術(shù)不斷發(fā)展的前提下，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的性狀觀(guān)察值多于供試材料樣本數(shù)的情況十分常見(jiàn)，使得很多算法因無(wú)法構(gòu)建合理矩陣而限制其應(yīng)用，通常的做法是應(yīng)用主成分分析、均值聚類(lèi)等各種算法進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，之后再用降維后的觀(guān)測(cè)值來(lái)做后續(xù)分析。這類(lèi)處理方法需要耗費(fèi)大量的計(jì)算資源，而且實(shí)驗(yàn)效果也無(wú)從保證。本實(shí)驗(yàn)嘗試應(yīng)用原始數(shù)據(jù)倒置的處理方法，對(duì)性狀值進(jìn)行降維處理，分析結(jié)果與預(yù)期是完全吻合的。當(dāng)將這些篩選出的核心性狀在核心種質(zhì)與原生種質(zhì)2個(gè)種群進(jìn)行小樣本非參數(shù)差異統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)時(shí)，7個(gè)表型在2個(gè)種群間無(wú)顯著性差異，且P值0.39～1(圖3)，從而逆向證明了倒置處理針對(duì)小樣本進(jìn)行表型值取舍的可行性。更肯定了該分析流程也可以應(yīng)用于小樣本群體的核心種質(zhì)構(gòu)建。

圖3 非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析在2個(gè)種群間的差異檢驗(yàn)結(jié)果

此外，通過(guò)該流程分析獲得的核心表型值與宛曉春等[41]提到的烏龍茶香氣物質(zhì)主要成分相一致，即橙花叔醇對(duì)應(yīng)木香，芳樟醇及其氧化物對(duì)應(yīng)鈴蘭的清爽性花香，香葉醇對(duì)應(yīng)薔薇的溫暖性花香。所以，今后相關(guān)研究可以將這7個(gè)香氣成分作為烏龍茶呈香重要指標(biāo)加以利用。理論上，選出的3個(gè)核心種質(zhì)可以作為烏龍茶品種香氣改良的優(yōu)選親本加以使用，但由于測(cè)試材料數(shù)量有限，3個(gè)核心種質(zhì)的實(shí)際育種價(jià)值還有待深入研究。

就試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，這套技術(shù)流程完全可以滿(mǎn)足烏龍茶核心種質(zhì)構(gòu)建分析，而且對(duì)表型值有較為寬泛的涵蓋域。此外，對(duì)于小樣本高通量表型數(shù)據(jù)也有相應(yīng)的解決策略，使其在實(shí)際應(yīng)用中具有更大的靈活性。再加上高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和大范圍普及，該流程的基于遺傳信息驗(yàn)證功能也將使整個(gè)分析流程具有更高的穩(wěn)健性和糾錯(cuò)率，能夠多層面確保篩選獲得的核心種質(zhì)具有較高的表征力。