環(huán)番合成酶PacB催化Xye類核糖體肽翻譯后修飾研究

韓沅均，莫天錄，鄧子新，張琪，丁偉

（1 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2 復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200243）

核糖體翻譯后修飾肽（ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides，RiPPs）存在于所有的生物界中，構(gòu)成了具有結(jié)構(gòu)和功能多樣性的一大類天然產(chǎn)物家族［1-2］。隨著基因組數(shù)據(jù)的不斷增長(zhǎng)，分析顯示大量具有結(jié)構(gòu)多樣和活性潛力的RiPPs以及所涉及的生物合成酶仍未被挖掘和鑒定。在大多數(shù)RiPPs的生物合成途徑中，核心肽部分氨基酸殘基間的環(huán)化是一種常見(jiàn)的后修飾方式［3］。目前為止，常見(jiàn)的RiPPs的環(huán)化的種類有硫醚交聯(lián)（lanthipeptide［4-6］和 sactipeptide［7-9］）、二硫鍵 （cystine knot proteins［10］）、N-to-C 環(huán)化（orbitides［11-13］和 cyclotides［14-16］）、噻唑和唑雜環(huán)（cyanobactins［17-19］）或取代吡啶（thiopeptides［20］）。通常這些環(huán)化修飾增加了RiPPs結(jié)合親和性和蛋白水解穩(wěn)定性，導(dǎo)致它們產(chǎn)生多樣化的生物活性，從而具有良好的藥物發(fā)展前景。

近年來(lái)，含有環(huán)番結(jié)構(gòu)的RiPPs 化合物相繼被發(fā)現(xiàn)［21-22］。這些環(huán)番結(jié)構(gòu)通常是由一個(gè)氨基酸的芳香族碳與另一個(gè)氨基酸的β-碳交聯(lián)成為C－C 鍵或C－O 鍵。如 Streptide［23］、Darobactin［24］和 Triceptide-Fxs［25］。它們?cè)诩?xì)菌中的生物合成途徑通常涉及S-腺苷甲硫氨酸自由基（rSAM）酶，該類酶能夠裂解SAM 形成5'-脫氧腺苷（5'-dA）自由基，然后攫取底物上的一個(gè)氫原子生成底物自由基，進(jìn)一步生成結(jié)構(gòu)多樣化的最終產(chǎn)物［26］。Darobactin 是Ⅰmai 等發(fā)現(xiàn)的一種新型作用機(jī)制的優(yōu)秀的抗革蘭氏陰性菌抗生素，其是典型的含有環(huán)番結(jié)構(gòu)的RiPP（圖1）。Xye 類核糖體肽因?yàn)槠渲饕赬enorhabdus、Yersinia和Erwinia三 個(gè) 屬 的 菌 中 被發(fā)現(xiàn)而得名［22］。這類RiPPs前體肽的核心肽區(qū)域和darobactin 的核心肽均富含芳香氨基酸，但是一般Xye 基因簇中的 rSAM 酶與 darobactin 的 rSAM 修飾酶序列上差異較大［22］，預(yù)示著二者修飾功能上存在一定的差異，從而導(dǎo)致最終的成熟天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有更大的多樣性。Darobactin 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)異的抗革蘭氏陰性耐藥菌的藥物前體分子，這些吸引著我們探究Xye家族核糖體肽化合物的結(jié)構(gòu)、活性以及翻譯后修飾方式。

圖1 含有環(huán)番結(jié)構(gòu)的代表性核糖體肽Fig.1 Structures of several RiPPs with cyclophanes

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

基因全合成和引物合成由蘇州金唯智生物有限公司（表1、表2）；質(zhì)粒、菌株為課題組所有（表3）。

表1 本工作中所涉及的基因Tab.1 Genes used in this study

表2 本工作中所用到的相關(guān)引物Tab.2 Primers used in this study

表3 本工作中所用到菌株和質(zhì)粒Tab.3 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物（yeast extract）5 g，NaCl 10 g，蛋白胨（tryptone）10 g。

LanA Start Buffer：20 mmol/L NaH2PO4， pH 7.5（25 ℃），500 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L 咪唑，20%甘油。

LanA Buffer 1∶6 mol/L 鹽酸胍，20 mmol/L NaH2PO4， pH 7.5（25 ℃）， 500 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L 咪唑。

LanA Buffer 2∶4 mol/L 鹽酸胍，20 mmol/L NaH2PO4， pH 7.5（25 ℃ ）， 300 mmol/L NaCl，30 mmol/L 咪唑。

LanA Elution Buffer： 4 mol/L 鹽 酸 胍 ，20 mmol/L Tris，pH 7.5（25 ℃），100 mmol/L NaCl，1 mmol/L 咪唑。

分子生物學(xué)用的聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、重組酶、核酸和蛋白maker、培養(yǎng)基等購(gòu)置于南京諾唯贊、上海生工、Sigma 和阿拉丁等公司。測(cè)序和引物合成由蘇州金唯智和上海生工完成，質(zhì)粒提取和凝膠回收試劑盒購(gòu)置于天根生化。

1.1.3 儀器

賽默飛Q Exactive HPLC/MS液相質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用儀，英國(guó)賽默飛Ultimate3000 高效液相色譜（HPLC）儀，美國(guó)貝克曼Avanti J-26S XP 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)伯樂(lè)GELDOCXRT 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)致微GⅠ80TW 高壓滅菌鍋，德國(guó)Eppendorf 5424 離心機(jī)，美國(guó)伯樂(lè)T100 PCR 擴(kuò)增儀，海爾-80 ℃冰箱，美國(guó)伯樂(lè)電泳儀，蘇州凈化有限公司SW-CJ-ⅠD超凈工作臺(tái)，移液槍（梅特勒），寧波新芝 UP250/JY92-ⅠⅠN 超聲粉碎儀，搖床（上海知楚），上海一恒DHP-9052/DHG-9070A 電熱恒溫培養(yǎng)箱，梅特勒-托利ME204E電子天平。

1.2 未知核糖體肽成熟酶系統(tǒng)的大腸桿菌異源表達(dá)

Photorhabdus australisDSM 17609 前體肽PacA和rSAM 酶PacB 的氨基酸序列來(lái)源于NCBⅠ數(shù)據(jù)庫(kù)，提交蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行基因全合成，要求針對(duì)于大腸桿菌表達(dá)宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化，最終將基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒pRSFduet-1 的BamH1/EcoRⅠ和NdeⅠ/XhoⅠ兩個(gè)位點(diǎn)中。

全合成的表達(dá)質(zhì)粒（pacA-pacB-pRSFduet-1）和鐵硫簇裝配輔助質(zhì)粒pDB1282 共轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coliBL21（DE3）中，挑取單菌落于5 mL LB 液體培養(yǎng)基（Kan 50 μg/mL，Amp 100 μg/mL），37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入50 mL LB液體培養(yǎng)基（Kan 50 μg/mL，Amp 100 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)3～5 h，待菌液OD600為0.5 左右時(shí)，先轉(zhuǎn)入1L LB 液體培養(yǎng)基（Kan 50 μg/mL，Amp 100 μg/mL），37 ℃培養(yǎng) 2～3 h，待菌液濃度OD600為0.4 時(shí)，首先加入2g/L L-阿拉伯糖，37 ℃培養(yǎng)2 h左右誘導(dǎo)質(zhì)粒pDB1282中鐵硫簇裝配輔助蛋白的表達(dá)；待菌液濃度OD600達(dá)到約0.6 時(shí)，加入 0.1 mmol/L ⅠPTG，溫度降為 18 ℃ ，搖床速度降到80 r/min，誘導(dǎo)表達(dá)20 h。離心10 min 收集菌體（11 900g，4 ℃），棄去上清后，用20 mL 的LanA Start buffer 重懸菌體，然后超聲30 min（頻率40%，超5 s，暫停55 s），4 ℃，11 900g4 ℃離心1 h，再次棄去上清后，然后用20 mL LanA Buffer 1 重懸菌體，11 900g4 ℃離心30 min 去除不可溶的沉淀，然后上清用0.45 μm 濾器過(guò)濾去除不可溶顆粒，上清流過(guò)5 mL HiTrap-Ni樹(shù)脂的親和色譜柱，用2倍柱體積LanA Buffer 1和1 倍柱體積的LanA Buffer 2 洗去非特異性結(jié)合的蛋白后，用1～3 倍柱體積的LanA Elution Buffer洗脫目標(biāo)多肽。洗脫的多肽分子量8000 左右，小量的洗脫多肽利用透析袋進(jìn)行脫鹽，經(jīng)冷凍干燥后存儲(chǔ)于-80 ℃?zhèn)溆?。少量多肽溶于pH 7.6的磷酸緩沖溶液（PBS），進(jìn)行高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)目標(biāo)化合物的分子量，在ESⅠ離子源下高分辨率質(zhì)量分析器能捕捉到多肽的多電荷分子量。對(duì)于化合物結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步鑒定采用HSEE［27］分析方法。對(duì)于化合物的Xye 預(yù)測(cè)和計(jì)算采用mMass 分析軟件［28］。

1.3 rSAM 酶PacB 的表達(dá)、純化和 ［4Fe-4S］簇化學(xué)重構(gòu)

將帶有SAM 自由基酶基因的表達(dá)質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中。挑選轉(zhuǎn)化子接種在5 mL 含有相應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。隨后將其全部接種到1 L含有相應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基。放置在37 ℃搖床中，220 r/min 孵育至OD600到達(dá)約0.8 后，加入ⅠPTG 到終濃度為0.2～0.4 mmol/L，同時(shí)加入過(guò)濾除菌后的100 mmol/L Fe（NH4）（2SO4）2溶液至終濃度為0.1 mmol/L。在18～20 ℃和120 r/min 搖床中再孵育18 h，5000 r/min 離心15 min，棄掉上清收集菌體，4 ℃直接進(jìn)行蛋白純化或儲(chǔ)存在-80 ℃待進(jìn)一步使用。所有的SAM 自由基酶蛋白純化及化學(xué)重構(gòu)操作均在無(wú)氧手套箱中進(jìn)行，氧氣含量小于2 mL/m3。將上一步中異源表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌，用lysis 緩沖液洗滌菌體并重新離心收集菌體。再使用30 mL lysis緩沖液重懸菌體，冰水浴中進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞，超聲工作時(shí)間30 min，超聲3 s，間隔17 s，功率250 W 超聲完成后，從手套箱中取出高速離心管，取出前保證離心管密封防止接觸空氣，4 ℃下12 000 r/min 高速離心1 h 后，放回?zé)o氧手套箱中，小心倒出上清。準(zhǔn)備一根裝有2 mL 填料的鎳柱，用約3 倍柱體積lysis 緩沖液進(jìn)行柱平衡后，將收集到的菌體破碎上清，流過(guò)鎳柱，進(jìn)行蛋白的裝載。用洗脫緩沖液和lysis 緩沖液配制含有不同咪唑濃度淋洗液，一般使用含50 mmol/L 咪唑的淋洗液10～15 mL，進(jìn)行雜蛋白的洗脫。最后使用洗脫緩沖液洗脫約5 mL，收集目標(biāo)組分，一般為灰黑色的流出液。

對(duì)SAM 自由基酶純化后，需要進(jìn)行［4Fe-4S］簇的化學(xué)重構(gòu)，一般先向體系中緩慢逐滴加入終濃度10 mmol/L DTT保證體系處于還原狀態(tài)，隨后加入蛋白當(dāng)量5～10 倍左右的（NH4）2FeSO4，由于一般將需要重構(gòu)蛋白稀釋到100 μmol/L 時(shí)的重構(gòu)效 果 較 好 ， 因 此 一 般 （NH4）2FeSO4用 量 為100 μmol/L。加入（NH4）2FeSO4后在 4 ℃下放置30 min，再加入與（NH4）2FeSO4等物質(zhì)的量濃度的Na2S（一般分2～3 次緩慢加入，一邊加入一邊攪拌防止蛋白沉淀），低溫放置過(guò)夜，完成［4Fe-4S］簇的化學(xué)重構(gòu)。在化學(xué)重構(gòu)后，需要用PD-10脫鹽柱（美國(guó)GE 公司）對(duì)體系脫鹽，進(jìn)行緩沖體系置換。PD-10脫鹽柱先用5～10 mL的脫鹽緩沖液進(jìn)行平衡，隨后根據(jù)使用說(shuō)明，加入固定量2.5 mL蛋白溶液進(jìn)行上樣，棄掉上樣時(shí)的流出液，再用3.5 mL脫鹽緩沖液洗脫，收集含有SAM 自由基酶的流出液，一般為淡棕色或者棕黑色液體，每500 μL 分裝為一管，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 rSAM酶PacB體外活性測(cè)試

SAM 自由基酶的反應(yīng)都需要在無(wú)氧手套箱中進(jìn)行，氧氣含量低于2 mL/m3。一個(gè)典型的PacB酶活反應(yīng)，通常將200 μmol/L 的底物加入到含有50 μmol/L 純化的 PacB 蛋白的緩沖體系（Tirs-HCl pH 8.0）中，隨后加入1～2 mmol/L DTH 在室溫中放置 10～15 min，最后加入 500 μmol/L SAM 到反應(yīng)體系中，進(jìn)行反應(yīng)的引發(fā)。反應(yīng)體系一般為100～200 μL，在室溫孵育2～5 h 后從手套箱中取出反應(yīng)，加入體積量為反應(yīng)體系5%的TFA 對(duì)反應(yīng)進(jìn)行猝滅。12 000 r/min 高速離心10 min 后，棄掉沉淀，上清直接進(jìn)行HPLC 及LC-HRMS 分析，或者-20 ℃進(jìn)行凍存以便繼續(xù)分析。反應(yīng)中的對(duì)照組，使用煮沸失活的PacB 上清或者加入5% TFA失活的PacB上清。

2 結(jié)果與分析

2.1 前體肽基因pacA 和 rSAM 酶基因pacB 共表達(dá)

根據(jù)分析，3-CyFEs 在進(jìn)化上和大多功能解析清楚的RiPPs環(huán)化合成酶的距離很遠(yuǎn)，表明其具有特殊的功能和催化機(jī)制。通過(guò)基因組挖掘，發(fā)現(xiàn)Photorhabdus australisDSM 17 609 基因組中含有一個(gè)尚未被報(bào)道的新型Xye類核糖體肽基因簇。為了將其與同一家族的其他基因簇區(qū)分開(kāi)來(lái)，在此將其稱為pac。其含有前體肽基因pacA和rSAM 酶基因pacB［圖2（a）］。為了驗(yàn)證前體肽和修飾酶基因的功能，把前體肽基因pacA的N 端組合六組氨酸（6xHis）和麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)簽，并在MBP 和前體肽PacA 之間引入蛋白酶TEV 限制性位點(diǎn)，這樣pacA和pacB共同構(gòu)建入表達(dá)載體pRSFDuet 中在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)。為了獲得序列較短的多肽以便于后續(xù)的質(zhì)譜分析，對(duì)非核心肽區(qū)域進(jìn)行了突變，將-5 位點(diǎn)的Gln 替換為L(zhǎng)ys從而引入胰蛋白酶酶切位點(diǎn)。利用鎳親和色譜純化前體肽后，通過(guò)TEV 蛋白酶消化，獲得經(jīng)過(guò)PacB 修飾的一段多肽pacpeptide。對(duì)pacA+pacB共表達(dá)的純化產(chǎn)物進(jìn)行了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析，結(jié)果顯示修飾后的PacA 與未修飾比分子量明顯減少（減少了6）［圖2（b）］，表明可能在前體肽上形成了3 個(gè)C－C 鍵。進(jìn)一步的串聯(lián)質(zhì)譜分析證實(shí)，這3 個(gè)鍵發(fā)生在C 端核心肽內(nèi)的WVN、YAR 和 WTN 基序上，這與 Morinaka 等［22］報(bào)道的其他Xye家族的核糖體肽的翻譯后修飾方式一致。胰蛋白酶消化共表達(dá)產(chǎn)物獲得的肽pacpeptide，觀察到［M+8H］8+為996.4891，分子量損失為6的片段1（殘基-4至12）作為C端肽的主要片段［圖2（c）］。串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)到碎片離子y12的［M+2H］2+為 789.3711，y9的［M+2H］2+為590.7846，y5的［M+2H］2+為721.3398（表4），表明分別在WVN（環(huán)A）和YAR（環(huán)B）間發(fā)生了脫氫環(huán)化，WTN（環(huán)C）之間的環(huán)化也在后續(xù)的天冬酰胺突變?yōu)楸彼岷罄^續(xù)發(fā)生環(huán)化的實(shí)驗(yàn)中被進(jìn)一步證實(shí)；同時(shí)串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)中，未發(fā)現(xiàn)Arg7 和Trp8 之間的肽鍵水解片段，表明YAR 環(huán)烷（環(huán)B）的形成改變了肽段的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)從而干擾了胰蛋白酶的水解。在串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了少量的分子量損失為2 的片段2（殘基-4 至7），以及分子量損失為2的片段3（殘基8至12）。片段2的串聯(lián)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)分析y7'的［M+1H］1+為877.4315，y4'的［M+1H］1+為480.2569（表4）；表明分子量損失源自WVN 環(huán)烷（環(huán)A）的形成［圖2（c）］。這兩個(gè)片段的存在表明PacB 對(duì)部分前體肽的后修飾中未生成環(huán)B，這也解釋了胰蛋白酶對(duì)片段2 和3 之間肽鍵的良好水解效率的原因。

表4 修飾后產(chǎn)物串聯(lián)質(zhì)譜碎片信息Tab.4 MS/MS information of products

2.2 rSAM酶PacB的體外功能研究

為了進(jìn)一步研究PacB功能和催化機(jī)制，rSAM酶PacB 在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，在厭氧條件下純化后進(jìn)行［4Fe-4S］簇的重構(gòu)，然后進(jìn)行脫鹽得到體外測(cè)活所用蛋白。通過(guò)表達(dá)純化NHis6-MBP-PacA，經(jīng)TEV 蛋白酶消化樣品和高溫?zé)嶙冃院?，離心去除MBP 標(biāo)簽，得到前體肽PacA。然后進(jìn)行體外活性測(cè)定，在厭氧條件下，反應(yīng)體系中加入前體肽PacA、PacB酶以及還原劑和SAM情況下，未檢測(cè)到PacA 的環(huán)化，可能的原因是高溫可能破壞了前體肽的一些獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，從而使PacB 不能底物識(shí)別而催化形成環(huán)化。進(jìn)一步使用帶有MBP 標(biāo)簽的前體肽作為底物。在相同的厭氧條件下與PacB 反應(yīng)約2 h 后，將反應(yīng)體系用TEV蛋白酶消化，加熱并離心。觀察到與未反應(yīng)的肽相比分子量損失僅為2 的新產(chǎn)品［圖3（a）］。在胰蛋白酶消化后觀察到片段4［圖3（b）］，而不是片段3［圖2（c）］，表明沒(méi)有C 環(huán)形成。同時(shí)，串聯(lián)質(zhì)譜證明片段2 和A 環(huán)的存在［圖3（b）］。為了獲得更多環(huán)化的產(chǎn)物，將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至過(guò)夜。盡管幾乎看不到分子量損失為4 的產(chǎn)物，但觀察到分子量損失為6 的產(chǎn)物［圖3（a）］，揭示了PacB 酶的確具有催化3 個(gè)C－C 鍵形成的完整體外生物活性。

圖3 PacB體外活性測(cè)定Fig.3 Characterization of the bioactivity of PacB in vitro

2.3 rSAM酶PacB的底物選擇性研究

酶的底物多樣性是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的源泉，PacB 催化芳香氨基酸的sp2碳和相鄰第3 位氨基酸側(cè)鏈的sp3碳之間形成C－C 鍵；首先將提供 sp3碳的 3 個(gè)氨基酸 Asn3、Arg7 和 Asn10 分別替換為側(cè)鏈上只有1 個(gè)甲基的Ala；相對(duì)應(yīng)的突變基因ΔpacA分別與pacB共表達(dá)。LC-MS 分析表明，與計(jì)算值相比，所有3 種產(chǎn)物的分子量損失仍為6［圖4（a）］，表明Ala 突變未能阻止任何環(huán)番的形成。這一結(jié)果揭示了PacB 對(duì)相關(guān)氨基酸殘基側(cè)鏈的高度底物耐受性，顯示出巨大的基因工程改造的潛力。上面提到的3 個(gè)位點(diǎn)分別替換為Gly 后。由于側(cè)鏈上沒(méi)有碳原子，預(yù)測(cè)應(yīng)該不能形成環(huán)化。共表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)3 個(gè)突變位點(diǎn)（N3G、R7G、N10G）導(dǎo)致相應(yīng)A、B、C 位置的環(huán)不能生成，而所有3 個(gè)突變中都觀察到了4 的分子量減少［圖4（b）］，串聯(lián)質(zhì)譜也證明除了突變位點(diǎn)的環(huán)化受到影響，其他2 個(gè)環(huán)化未受影響，表明3 個(gè)環(huán)化是相互獨(dú)立催化完成的。

2.4 PacB 介導(dǎo)的前體肽PacA 翻譯后修飾順序

上述的研究結(jié)果已證明PacB 的確能夠催化前體肽3 個(gè)環(huán)番結(jié)構(gòu)的形成，點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)也表明PacB對(duì)底物具有一定的寬泛性，3個(gè)位點(diǎn)環(huán)化可以獨(dú)立催化完成，而不是互為先決條件。盡管如此，PacB 介導(dǎo)的前體肽PacA 翻譯后修飾的體內(nèi)共表達(dá)和體外活性重建實(shí)驗(yàn)中，均發(fā)現(xiàn)部分修飾的產(chǎn)物［圖 2（c）、圖 3（a）和圖 4（b）］，這些結(jié)果可以推斷出3 種環(huán)化效率之間的明顯差異，A 環(huán)的形成效率最高，B 環(huán)的形成效率最低。因此，對(duì)3 個(gè)環(huán)番結(jié)構(gòu)形成順序做了初步推定：首先形成環(huán)A，然后是形成C環(huán)，最后形成B環(huán)。

圖4 高分辨質(zhì)譜分析點(diǎn)突變前體肽ΔpacA+pacB共表達(dá)產(chǎn)物Fig.4 HR-MS analysis of pacA variants coexpressed with pacB

3 結(jié) 論

通過(guò)基因組挖掘方法從Photorhabdus australisDSM 17609的基因組挖掘到一個(gè)新的Xye類核糖體肽基因簇pac，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)鑒定了rSAM 酶PacB催化前體肽后修飾過(guò)程中的3個(gè)環(huán)番結(jié)構(gòu)的生成，PacB 屬于一類新穎的三殘基環(huán)番合成酶。將PacB底物即前體肽PacA中提供環(huán)番sp3碳的氨基酸替換為Ala的突變株能夠正常發(fā)生3個(gè)環(huán)化，初步證明了PacB對(duì)底物有較高的容忍性，預(yù)示著具有通過(guò)基因工程改造核心肽氨基酸生成結(jié)構(gòu)多樣性的化合物的巨大潛力。前體肽中一個(gè)環(huán)番sp3碳供體氨基酸突變成Gly后，能夠形成2個(gè)環(huán)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)環(huán)番可以相互獨(dú)立形成，不互為先決條件，但仍然能夠通過(guò)這些體內(nèi)外數(shù)據(jù)推斷出環(huán)A和環(huán)B的形成分別具有最高和最低的形成效率，因此，初步假設(shè)首先形成環(huán)A，然后是形成C 環(huán)，最后形成B 環(huán)。與其他報(bào)道的Xye簇類似，pacA+pacB共表達(dá)產(chǎn)品pacpeptide對(duì)大腸桿菌或金黃色葡萄球菌沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抗菌活性。然而，因?yàn)榻陙?lái)發(fā)現(xiàn)的核糖體肽類天然產(chǎn)物darobactin已被證明是一種針對(duì)革蘭氏陰性病原體的強(qiáng)效抗生素，不能忽視這類酶修飾的新型RiPPs 化合物潛在的藥學(xué)活性。對(duì)Xye 類核糖體肽生物合成中三殘基環(huán)番合成酶催化功能的研究將為此類化合物的深入挖掘和合成生物制造奠定基礎(chǔ)。