Ⅱ型細胞色素P450酶氧化β-香樹脂醇的選擇性調(diào)控研究

孫文濤，張昕哲，萬盛通，王茹雯，李春，

（1 清華大學(xué)化工系，北京 100084；2 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 100101）

細胞色素P450 酶（P450）可催化碳氫鍵氧化、脫甲基、脫飽和等二十余類反應(yīng)，在植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成中扮演著重要的角色，是萜烯化合物、生物堿及黃酮等多種天然產(chǎn)物合成中的關(guān)鍵修飾酶［1-2］，在高價值天然產(chǎn)物的異源合成中被廣泛研究和應(yīng)用［3-7］，比如重要保肝護肝藥物甘草次酸的合成過程中，CYP88D6 與CYP72A154 對骨架分子β-香樹脂醇C-11 與C-30 進行連續(xù)氧化最終將其轉(zhuǎn)化成甘草次酸［8-9］。

P450 是一種含血紅素蛋白，利用分子氧及NAD（P）H 對底物進行加氧反應(yīng)，根據(jù)P450 酶從NAD（P）H 獲取電子的方式不同可將其分為4 種類型：Ⅰ型P450酶的氧化還原伴侶需要一個包含F(xiàn)AD的還原酶以及一個鐵氧還蛋白構(gòu)成；Ⅱ型P450酶的氧化還原伴侶為一個同時包含F(xiàn)MN和FAD結(jié)構(gòu)域的單一蛋白又稱P450還原酶（CPR）；Ⅲ型P450酶為自給自足的蛋白，其實質(zhì)為P450酶與氧化還原伴侶形成的多結(jié)構(gòu)域蛋白；Ⅳ型P450 酶可以直接從NAD（P）H中獲取電子，不需要額外的氧化還原伴侶蛋白或結(jié)構(gòu)域。其中細菌等原核生物來源的P450酶多為Ⅰ型和Ⅲ型，且通常為游離蛋白，動物、植物等來源的P450酶多為Ⅱ型，且通常為膜蛋白，具有N端跨膜結(jié)構(gòu)域，比如甘草來源的CYP88D6 與CYP72A154［10］。

由于Ⅱ型P450 酶難以純化，因此目前對于其反應(yīng)特性調(diào)控的研究較少?；谕唇５确椒?，張學(xué)禮課題組通過對來自于犁頭霉菌的CYP5311B2底物通道進行改造提高其催化活性，使工程菌的氫化可的松產(chǎn)量提高了3倍［11］。Schele等通過同源建模和定點突變對鐵銹醇合酶CYP76AH1 以及11-羥基鐵銹醇合酶 CYP76AH4、 CYP76AH22、CYP76AH23、 CYP76AH24 進 行 改 造 發(fā) 現(xiàn) 301、303以及478的氨基酸是決定11-羥基鐵銹醇合酶選擇性氧化鐵銹醇的關(guān)鍵氨基酸位點［12］。當(dāng)前對于P450 催化特性調(diào)控的相關(guān)研究主要集中于可溶性的P450酶，如來自巨大芽孢桿菌的P450BM3［13-15］。研究人員通過對其活性口袋進行重塑實現(xiàn)了其區(qū)域和立體選擇性的調(diào)控，可控合成了對苯二酚、2β-羥基睪丸酮等化合物，并進一步拓寬了P450 酶催化反應(yīng)的范疇，成功實現(xiàn)了S—N 鍵、C—Si鍵、C—B 鍵的形成以及芳基烯烴的氮雜環(huán)丙烷化、卡賓向炔烴的轉(zhuǎn)移反應(yīng)等一系列新型反應(yīng)［16-19］。

為實現(xiàn)Ⅱ型P450 酶催化特性的調(diào)控，解決甘草次酸合成關(guān)鍵酶，來源于蒺藜狀苜蓿的CYP72A63（AB558146.1）催化的底物選擇性、區(qū)域選擇性以及氧化進程不可控的問題，提高甘草次酸合成特異性與合成效率。課題組前期通過計算機輔助的理性設(shè)計與釀酒酵母驗證平臺，重塑了CYP72A63 的催化口袋，獲得高活性突變體CYP72A63（T338S）可對 11-氧-β-香樹脂醇 C-30 特異性的連續(xù)氧化，實現(xiàn)甘草次酸的可控合成。然而仍然無法解決其底物選擇性差的問題，CYP72A 63（T338S）可同時對β-香樹脂醇以及 11-氧-β-香樹脂醇的C-30 進行氧化，導(dǎo)致副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成。在酶改造過程中我們發(fā)現(xiàn)，除了活性口袋重塑外，Ⅱ型P450 酶與其氧化還原伴侶CPR之間的相互作用可改變其催化活性以及選擇性，影響工程菌甘草次酸產(chǎn)量及產(chǎn)物譜［20］。這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在Ⅰ型P450 酶中，李盛英等通過重構(gòu)P450酶MycG與氧化還原伴侶的組合，重建了其催化功能，實現(xiàn)了4種新產(chǎn)物的合成［19］，這說明P450酶催化系統(tǒng)組成成分之間的相互作用會對P450的催化特性產(chǎn)生顯著影響。由于Ⅱ型P450酶多定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，除CPR外，P450、CPR與膜之間的相互作用都可能對P450 酶催化特性產(chǎn)生影響［21］。為實現(xiàn)CYP72A63（T338S）底物選擇性的調(diào)控，本文對于跨膜域、膜組分代謝等因素對P450酶催化特性調(diào)控的影響進行了研究，以期獲得能夠調(diào)控其底物選擇性的新方法，以CYP72A63（T338S）為對象，開發(fā)Ⅱ型細胞色素P450酶催化選擇性調(diào)控的新策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與Ⅱ型P450酶突變體

1.2 基因克隆與表達質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究中利用諾唯贊Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase 進 行 PCR 擴 增 ， PCR 產(chǎn) 物 用Thermo Scientific GeneJET 膠回收試劑盒進行純化。通過吉布森組裝將啟動子、基因、終止子、同源臂等按照需求進行多片段組裝（成分如表1所示），構(gòu)建含有目標(biāo)表達盒的質(zhì)粒，隨后利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)并涂布到含有100 mg/L 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，置于37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。通過PCR驗證，獲得條帶正確的質(zhì)粒由擎科生物技術(shù)有限公司進行測序驗證后備用。

表1 本研究所涉及的菌種信息Tab.1 Strains used in this study

（1）5×ⅠSO緩沖液配制（表2）

表2 5×ⅠSO緩沖液組分Tab.2 Components of the 5×ⅠSO buffer

（2）Gibson反應(yīng)液配制（表3）

表3 Gibson反應(yīng)液組分Tab.3 Components of Gibson reaction solution

1.3 蛋白跨膜域預(yù)測

使用跨膜域預(yù)測軟件TMHMM對蛋白質(zhì)跨膜域進行預(yù)測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）［22］。

1.4 酵母轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)

酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將新鮮酵母宿主細胞接入2 mL YPD 培養(yǎng)基中，在30 ℃下200 r/min 過夜培養(yǎng)后，以10%的接種量接入新鮮YPD 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，至細胞濃度大約為2×107cells/mL。吸取適量菌液到無菌的1.5 mL離心管中，5000 r/min 離心2 min 后水洗一次并收集細胞。用1 mL 濃度100 mmol/L 的醋酸鋰溶液將細胞重懸并靜置5 min，隨后4000 r/min 離心3 min棄上清。依次在菌體中加入適量DNA 片段、10 μL ssDNA、240 μL 500 g/L PEG3350、36 μL 1 mol/L 醋酸鋰，加水至總體積360 μL。渦旋振蕩充分混勻，依次30 ℃保溫30 min、42 ℃水浴20～30 min，4000 r/min 離心3 min 收集沉淀隨后用1 mL 無菌水清洗菌體。取適量菌液涂平板，30 ℃培養(yǎng)2～4天，PCR驗證正確后進行發(fā)酵驗證［23］。

挑取少量PCR 驗證正確的菌體接入適量新鮮YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h制備種子液，以10%接種量接入新鮮YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5天后提取發(fā)酵產(chǎn)物。

1.5 基因表達水平檢測

將工程釀酒酵母接在YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板利用FastStart Essential DNA Green Master 試劑盒（Roche）通過實時熒光定量PCR 對基因轉(zhuǎn)錄進行相對定量。管家基因ACT1為內(nèi)參基因。

1.6 酵母RNA-Seq

工程酵母接在YPD 培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)30 h后，5000 r/min 離心2 min 收集菌體，并用無菌水洗滌菌體3 次后轉(zhuǎn)入-80 ℃短暫保存，隨后由北京博云華康基因科技有限公司完成RNA-seq。

1.7 工程酵母代謝產(chǎn)物的樣品處理

酵母發(fā)酵結(jié)束后，取60 mL 菌液用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3 以下，對其進行超高壓破碎。取2 mL 超高壓破碎的勻漿，加入等體積乙酸乙酯，渦旋振蕩10 min。將勻漿12 000 r/min離心10 min，吸取上清并轉(zhuǎn)移至液相小瓶。在真空干燥儀中60 ℃干燥至乙酸乙酯完全揮發(fā)。加入100μL吡啶與100μLN，O-雙（三甲基硅基）三氟代乙酰胺，混勻后80 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入200μL套管后置于液相小瓶中，準(zhǔn)備上機檢測。

1.8 GC-MS產(chǎn)物鑒定

使用島津GCMS-QP2010 Ultra，配備低流失色譜柱SH-Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm，島津，日本）。進樣口溫度250 ℃，分流比5∶1，進樣1 μL，載氣氦氣的流速為1.2 mL/min。升溫程序：80 ℃保持 1 min，以 20 ℃/min 升至 290 ℃，保持38 min；色譜質(zhì)譜接口溫度為290 ℃。質(zhì)譜掃描范圍為m/z50～700。使用外標(biāo)法對其進行定性定量［24-25］。

2 結(jié)果與討論

2.1 跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化特性的影響

Ⅱ型細胞色素P450 酶的跨膜結(jié)構(gòu)對于酶的催化活性具有重要影響［26-27］。在大腸桿菌中表達時，增溶修飾（N 端融合增溶序列，截除跨膜域等）可以提高Ⅱ型P450 酶的溶解性，但是酶與膜相互作用的破壞會對其活性產(chǎn)生顯著的抑制作用，CYP11B1 的N 端突變甚至?xí)ζ溥x擇性產(chǎn)生影響［26-27］。為進一步探究在酵母體內(nèi)表達時跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化特性的影響，本研究將酵母內(nèi)源細胞色素P450 酶ERG11（YHR007C）、ERG5（YMR015C）與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白ERG1（YGR175C）、ERG2（YMR202W）、NTE1（YML059C）的 N 端跨膜域，以及 GPⅠ8（YDR331W）、KAR1（YNL188W）的C 端跨膜域，直接融合在突變體CYP72A63（T338S）的 N 端以對其 跨 膜域進行改造。

利用TMHMM 對改造后的嵌合蛋白跨膜域結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖1 所示。其中紅色柱狀區(qū)域出現(xiàn)的次數(shù)代表跨膜螺旋的數(shù)量，橫坐標(biāo)代表氨基酸位點，融合ERG5N（ERG5 的N 端跨膜域）、GPⅠ8C（GPⅠ8 的 C 端跨膜域）后仍為單跨膜域蛋白，跨膜域由29 個氨基酸分別延長為69 個和43 個氨基 酸 ；融 合 ERG2N（ERG2 的 N 端 跨 膜 域 ）、KAR1C（KAR1 的C 端跨膜域）后，由單跨膜域改變?yōu)殡p跨膜域蛋白；融合ERG11N（ERG11 的N 端跨膜域）與NTE1N（NTE1 的N 端跨膜域）后則變?yōu)槿缒び虻鞍?，這說明內(nèi)源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白跨膜域的融合顯著改變了CYP72A63（T338S）的跨膜結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 跨膜域改造后CYP72A63（T338S）的TMHMM預(yù)測結(jié)果Fig.1 TMHMM prediction for the transmembrane-domain-modified CYP72A63(T338S)

為確定跨膜域改造對CYP72A63（T338S）催化特性的影響，所獲得的嵌合蛋白突變體均在釀酒酵母底盤GA0-1 體內(nèi)進行功能驗證。結(jié)果表明，跨膜域的改造對CYP72A63（T338S）的催化特 性 影 響 顯 著（ 圖 2）。 ERG5N、 KAR1C、ERG2N 對其活性有顯著的抑制作用，KAR1C、ERG2N 直接導(dǎo)致其失活，這也說明這些雙跨膜域的結(jié)構(gòu)對該酶活性有顯著的抑制作用，其可能原因為改造后的跨膜域無法在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上正確定位與折疊從而導(dǎo)致了該酶的失活，在改造過程中應(yīng)避免這種結(jié)構(gòu)的形成。但是融合NTE1N 后降低了CYP72A63（T338S）對底物β-香樹脂醇選擇性，顯著抑制了其氧化β-香樹脂醇的能力，降低甘草次酸合成過程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成。而 GPⅠ8C 進一步提高了 CYP72A63（T338S）對底物β-香樹脂醇的選擇性，促進了甘草次酸合成過程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成（圖2）。這一結(jié)果說明，跨膜域的改造對于細胞色素P450酶的催化特性具有顯著的影響，通過對跨膜區(qū)域進行改造是一種調(diào)控Ⅱ型P450 酶底物選擇性的有效策略。

圖2 不同跨膜結(jié)構(gòu)對CYP72A63（T338S）底物選擇性的影響Fig.2 Ⅰnfluence of the transmembrane structures on the substrate selectivity of CYP72A63(T338S)

2.2 細胞膜組分對CYP72A63（T338S）底物選擇性的影響

脂質(zhì)是生物膜的主要組成成分，細胞中脂質(zhì)組分的調(diào)整對于維持膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用［28］，膜結(jié)構(gòu)為膜蛋白發(fā)揮功能的支架，也會對膜結(jié)合的P450 酶與CPR 之間的相互作用產(chǎn)生影響，從而影響P450 的催化活性［29］。研究表明，在蛋白與蛋白以及蛋白與脂質(zhì)之間的相互作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上能夠形成富含甾醇以及鞘脂的脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域，這些微結(jié)構(gòu)域是P450 以及CPR 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位的重要場所，鞘脂分子結(jié)構(gòu)以及種類的改變可能會重塑這些微結(jié)構(gòu)域，影響定位其中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間的相互作用，進而影響P450 酶的催化特性［30-31］。

在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，相同的P450 酶在不同的宿主中表達時，其活性差異較大。以Sgib［32］以及與SynV［33］為宿主，利用 CYP72A63（T338S）在胞內(nèi)重構(gòu)甘草次酸的合成途徑時，在相同條件下，底物11-氧-β-香樹脂醇有大量剩余時，其甘草次酸產(chǎn)量差異顯著，分別為8 mg/L 與30 mg/L，這說明兩種宿主中P450的活性存在差異。

本研究對兩種工程菌進行轉(zhuǎn)錄組分析時發(fā)現(xiàn)，參與鞘脂合成的FAA1以及SUR2在Sgib 中顯著高表達（表4），為驗證這些差異對CYP72A63（T338S）催化特性的影響，本研究在GA160 中對其進行了敲除，結(jié)果表明SUR2的敲除顯著改變了CYP72A63（T338S）的催化底物選擇性。該基因敲除雖然降低了甘草次酸的合成能力，但是顯著提高了 CYP72A63（T338S）對底物 11-氧-β-香樹脂醇的選擇性，抑制了甘草次酸合成過程中β-香樹脂醇氧化導(dǎo)致的副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成，使甘草次酸所占比例由82.9%提高至97.6%（圖3）。SUR2敲除抑制了神經(jīng)酰胺向植物神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化過程，造成神經(jīng)酰胺的積累，從而改變了膜結(jié)構(gòu)中鞘脂的組成成分，這說明膜結(jié)構(gòu)中鞘脂結(jié)構(gòu)的改變對膜結(jié)合的Ⅱ型細胞色素P450 酶的催化特性具有顯著的影響。

圖3 敲除FAA1及SUR2的工程菌株產(chǎn)物分布Fig.3 Product profile of the strains with FAA1or SUR2 knock out

表4 不同宿主中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄豐度Tab.4 Transcription levels of genes associated to lipid metabolism in different strains

2.3 調(diào)節(jié)鞘脂合成途徑調(diào)控CYP72A63（T338S）底物選擇性

SUR2的敲除對CYP72A63（T338S）的底物選擇性產(chǎn)生了顯著的影響，這表明脂質(zhì)成分的改變，尤其鞘脂的成分和結(jié)構(gòu)的改變對于P450 酶的催化特性影響顯著。鞘脂由神經(jīng)酰胺骨架、極性頭和超長鏈脂肪酸（C18～C26）構(gòu)成，鞘脂分子中超長鏈脂肪酸的長度的改變會對生物膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，同時游離超長鏈脂肪酸的含量的改變對細胞膜結(jié)構(gòu)也有一定的影響［34-35］。

在釀酒酵母中，脂肪酸碳鏈的延長由elo1p、elo2p、elo3p 三種酶催化，其中C18CoA 主要由elo1p 與 elo2p 合成，C26CoA 主要由 elo2p、elo3p 合成。因此，本研究對工程菌中編碼這三種蛋白的基因ELO1、ELO2、ELO3基因進行了過表達，促進超長鏈脂肪酸合成。結(jié)果表明，三個基因的過表達對于CYP72A63（T338S）的底物選擇性沒有顯著影響，11-脫氧甘草次酸和甘草次酸的產(chǎn)量沒有產(chǎn)生顯著變化，但是這些基因的過表達顯著促進了其前體物質(zhì)β-香樹脂醇的積累，其可能原因為鞘脂結(jié)構(gòu)的改變提高了膜結(jié)構(gòu)對于無羧基三萜產(chǎn)物的容納能力（圖4）。

圖4 過表達ELO1、ELO2、ELO3工程菌中三萜化合物的產(chǎn)量Fig.4 Production of triterpenoids in the engineered strains overexpressing ELO1,ELO2 and ELO3

植物來源的酶在酵母中進行異源表達時，活性低、特異性差是一種常見現(xiàn)象。由于細胞色素P450 酶為膜蛋白，影響其活性的原因之一可能為植物與酵母細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)成分的不同。

葡萄糖神經(jīng)酰胺是植物鞘脂的主要成分之一，由鞘氨醇和脂酰-CoA經(jīng)葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶催化合成［36］，通過對釀酒酵母基因組進行檢索發(fā)現(xiàn)，其基因組中不存在葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶及其同工酶，對釀酒酵母代謝組進行檢索也未發(fā)現(xiàn)葡萄糖神經(jīng)酰胺［37］，該差異可能為導(dǎo)致植物來源的酶在釀酒酵母中催化特性差的原因。為驗證葡萄糖神經(jīng)酰胺對三萜合成的影響，本研究在釀酒酵母工程菌GA160的YPRCtau3位點中引入的來源于苜蓿（Mt）、畢赤酵母（Pa）以及解脂酵母（Ya）的葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶（GCS）。結(jié)果表明，來自于畢赤酵母的葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶PaGCS2提高了CYP72A63（T338S）對底物β-香樹脂醇選擇性，顯著促進了11-脫氧甘草次酸的合成（圖5）。綜合以上結(jié)果，調(diào)節(jié)酵母鞘脂代謝，改變其組成對P450酶的催化特性具有顯著的影響，通過控制鞘脂合成可實現(xiàn)對Ⅱ型P450酶底物選擇性的調(diào)控。

圖5 過表達外源葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶工程菌的三萜產(chǎn)量Fig.5 Production of triterpenoids in the engineered strains overexpressing heterogenous GCSs

2.4 調(diào)控雙步氧化比例提高CYP72A63（T338S）反應(yīng)特異性

甘草次酸合成過程中，中間產(chǎn)物11-氧-β-香樹脂醇以及副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成前體均為β-香樹脂醇，因此催化11-氧-β-香樹脂醇合成的Uni25647 以及催化副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸合成的CYP72A63（T338S）之間存在底物競爭關(guān)系，通過提高Uni25647的活性，增強其競爭底物β-香樹脂醇的能力，有望削弱CYP72A63（T338S）氧化β-香樹脂醇合成11-脫氧甘草次酸的能力。強化酶的表達是提高酶催化能力的一種直接有效的方式，因此本研究在GA160基礎(chǔ)上，將Uni25647基因的啟動子更換成表達強度更高的Gal7啟動子，構(gòu)成菌株GA180-1。結(jié)果表明，更換強度更高的Gal啟動子后對甘草次酸的合成無顯著的促進作用，但顯著促進了CYP72A63（T338S）對底物 11-氧-β-香樹脂醇的特異性氧化，完全抑制了甘草次酸合成過程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成，甘草次酸產(chǎn)量為（31.6 ±2.2）mg/L相比于對照（30.3±1.7）mg/L沒有顯著變化（圖 6）。通 qPCR 對菌株 GA160 與 GA180-1 中Uni25647及CYP72A63（T338S）基因轉(zhuǎn)錄水平進行測定發(fā)現(xiàn)，在GA180-1中Uni25647基因轉(zhuǎn)錄水平提高了18.8倍，Uni25647與CYP72A63（T338S）轉(zhuǎn)錄豐度的比例由1∶24.5提高至1∶1.5。Uni25647表達水平的提高，強化了其對于β-香樹脂醇的競爭力，導(dǎo)致β-香樹脂醇代謝流均流向Uni25647 催化的11-oxo-βamyrin合成反應(yīng)從而抑制了11-脫氧甘草次酸的合成，使工程菌11-氧-β-香樹脂醇產(chǎn)量由（51.0±2.4）mg/L提高至（67.9±7.4）mg/L，由于CYP72A63（T338S）催化活性沒有得到顯著的促進，因此甘草次酸的產(chǎn)量并未獲得顯著的提高。這一結(jié)果說明通過調(diào)節(jié)具有底物競爭關(guān)系的催化酶比例的策略可實現(xiàn)對其反應(yīng)、特異性的控制（圖6）。

圖6 Uni25647表達強化后工程菌的產(chǎn)物的分布（a）及P450酶的相對轉(zhuǎn)錄豐度（b）Fig.6 Product profile(a)and the relative transcription abundance of P450 enzymes after up-regulating Uni25647 expression(b)

3 討論

相比于化學(xué)催化，P450 酶是一種高選擇性的催化劑，具有更強的區(qū)域和立體選擇性，但是許多P450 酶催化仍然具有一定的雜泛性，比如CYP72A63 可以氧化β-香樹脂醇的 C-30 與 11-氧-β-香樹脂醇的C-29和C-30兩個位點，合成11-脫氧甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛、29-羥-11-氧-β-香樹脂、甘草次酸五種產(chǎn)物，其突變體CYP72A63（T338S）雖然可以實現(xiàn)良好的C-30區(qū)域選擇性，但是可以同時氧化β-香樹脂醇和11-氧-β-香樹脂醇導(dǎo)致合成甘草次酸過程中同時合成副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸，即導(dǎo)致底物的消耗也增加了目標(biāo)產(chǎn)物分離純化的難度［18］。

要實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效選擇性合成，需要進一步增強P450 酶的催化選擇性。酶催化口袋的幾何結(jié)構(gòu)、化學(xué)環(huán)境等因素是決定其催化特性的關(guān)鍵，通過對P450 酶活性口袋進行重塑，獲得了多種具有良好區(qū)域選擇性、立體選擇性等催化特性的突變體［14，34］。同時，研究發(fā)現(xiàn)與P450 酶存在蛋白與蛋白之間相互作用的氧化還原伴侶也會對P450 的催化特性產(chǎn)生顯著影響。在Ⅱ型P450 酶中，除了CPR 與P450 酶的相互外，還存在膜、P450 酶和CPR 三者之間的相互作用。這些相互作用同樣對P450 的催化特性具有顯著影響，研究表明，膜組分磷脂酰膽堿是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中促進CPR 與P450 相互作用的主要成分，除此之外，另外一種組分磷脂酰乙醇胺能夠促進CPR 與CYP2B4 之間的電子傳遞效率從而提高其催化活性［31］。為進一步探索膜對P450 酶的影響，本研究中對連接膜與蛋白的跨膜域以及膜組分鞘脂合成的關(guān)鍵途徑進行了改造，發(fā)現(xiàn)跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化的底物選擇性具有顯著的影響，本研究中利用該特性開發(fā)了一種通過改造CYP72A63（T338S）跨膜域控制其底物選擇性的策略。通過對鞘脂合成途徑的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，改變鞘脂成分也是一種實現(xiàn)對P450 催化底物選擇性的調(diào)控的有效方法，然而鞘脂成分改變以及跨膜域改造對酶活性的調(diào)控機制并不清晰，在后期的研究中，通過蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析、分子動力學(xué)模擬等方法，闡明膜結(jié)構(gòu)以及P450 跨膜域結(jié)構(gòu)變化對其催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的影響將會促進鞘脂成分改變以及跨膜域改造對P450酶活性調(diào)控機制的解析。

除了改變催化劑本身的催化特性外，從化合物合成過程的角度出發(fā)，也可以為我們提供反應(yīng)調(diào)控的新思路。在天然產(chǎn)物的生物合成過程中，由于酶的雜泛性，導(dǎo)致下游反應(yīng)的酶可以催化上游酶的底物，在兩種酶之間形成底物競爭關(guān)系，從而導(dǎo)致副產(chǎn)物的合成。這種情況下提高上游酶的催化活性，強化其底物競爭能力會顯著降低甚至消除下游酶對上游底物的消耗，起到抑制副產(chǎn)物合成的作用。在本研究中，通過強化甘草次酸合成過程中的上游P450 酶Uni25647 的催化活性，增強其競爭底物β-香樹脂醇的能力，完全消除了下游酶CYP72A63（T338S）對于β-香樹脂醇的氧化，這也進一步說明，調(diào)控合成途徑中具有底物競爭關(guān)系的酶的表達比例，也是一種改變酶催化的底物選擇性、消除副產(chǎn)物產(chǎn)生的有效策略。

不同于傳統(tǒng)的P450 酶催化結(jié)構(gòu)域改造以及還原伴侶工程來調(diào)控P450 酶的催化特性，本研究通過改造P450 酶的跨膜結(jié)構(gòu)域以及調(diào)控膜組分的代謝實現(xiàn)了Ⅱ型P450 酶催化的底物選擇性的調(diào)控，改變了CYP72A63（T338S）對于兩種底物β-香樹脂醇以及11-氧-β-香樹脂醇的氧化選擇性；同時本研究發(fā)現(xiàn)，通過改變具有底物競爭關(guān)系的酶的表達比例，是一種消除級聯(lián)反應(yīng)過程中由于上下游酶均可氧化同一種底物而導(dǎo)致的副產(chǎn)物的有效方法，為Ⅱ型P450 酶催化特異性的調(diào)控提供了更加豐富的策略，然而跨膜域結(jié)構(gòu)以及膜組分代謝對于P450催化特性影響的機制仍需更加深入的研究。