構(gòu)建釀酒酵母細(xì)胞工廠從頭合成倍半萜類化合物α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯

李曉東，楊成帥，王平平，嚴(yán)興，周志華

（1 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049； 3 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，中國(guó)科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055）

人參為五加科人參屬植物人參（Panax ginseng）的根莖部分，是我國(guó)以及東亞、東南亞地區(qū)一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有較高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值。在我國(guó)，人參用于強(qiáng)身、保健、抗癌和抗衰老已有超過(guò)2000 年的歷史［1］。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，人參“補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目開(kāi)心益智，久服身輕延年”。對(duì)人參的化學(xué)研究表明，其主要有效活性成分有人參皂苷、多糖類、人參炔醇、氨基酸和人參揮發(fā)油等［2］。其中，人參揮發(fā)油類組分有著不可或缺的作用。人參揮發(fā)油可以通過(guò)破壞菌體細(xì)胞壁、影響細(xì)菌物質(zhì)和能量代謝來(lái)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)［3］；同時(shí)可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用［4］；在心血管保護(hù)方面，人參揮發(fā)油還能顯著抑制心肌缺血損傷，改善人體微循環(huán)［5］。

α-新丁香三環(huán)烯（α-neoclovene）和β-石竹烯（β-caryophyllene）是人參揮發(fā)油的主要成分之一［6］，它們對(duì)于人參獨(dú)特的藥理功效有一定的貢獻(xiàn)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。β-石竹烯的生物活性研究表明，其具有抗癌［7］、抗炎、抗氧化及保護(hù)神經(jīng)等多種生理活性［8］。β-石竹烯不僅自身具有抗癌活性而且還可以通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性來(lái)顯著提高其他化療藥物的抗癌活性。例如，β-石竹烯可以增加紫杉醇對(duì)細(xì)胞膜的通透性［9］，使其對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞DLD-1 的抑制活性提高10 倍。基于β-石竹烯的生物活性及其對(duì)人體的安全性，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)β-石竹烯作為食品添加劑使用［8］。但目前對(duì)α-新丁香三環(huán)烯的生物活性研究還非常少。

α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯在生物能源方面的應(yīng)用前景最近受到了廣泛關(guān)注。從萜類化合物衍生而來(lái)的烷烴類化合物的結(jié)構(gòu)與石油餾分燃料中化合物的結(jié)構(gòu)相似，并具有與化石燃料相似的燃燒特性［10］。目前廣泛使用的生物燃料主要以醇類分子為主，例如乙醇與丁醇，它們一般具有較高的含氧量，這不僅會(huì)影響燃料的能量密度（energy density），其在化石燃料中的添加還會(huì)加速設(shè)備的老化。與含醇生物燃料相比，倍半萜類生物燃料含氧量極低或不含氧，更適合作為化石燃料的替代品。近期有研究表明，在合成支鏈烷烴（synthetic ranched paraffins）中添加α-新丁香三環(huán)烯、β-石竹烯等倍半萜類化合物可以提高生物燃料的十六烷值（cetane number），降低燃料黏度，使其能夠滿足航空燃料的需求［11］?；谝陨咸匦裕?新丁香三環(huán)烯等倍半萜類化合物燃料一度被認(rèn)為是三大最具發(fā)展?jié)摿Φ母吣芰棵芏群娇杖剂现弧?/p>

人參揮發(fā)油在人參中的含量?jī)H占干重的0.081%～0.223%［12］，且組成成分非常復(fù)雜，含有多種萜類、醇類、酮類、酚類和烷烴類等化合物，因此，僅通過(guò)植物提取與純化的生產(chǎn)方式將難以滿足α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯在生物醫(yī)藥、保健食品及生物燃料等領(lǐng)域的應(yīng)用需求。植物天然產(chǎn)物合成生物學(xué)的發(fā)展為人們提供了一種利用微生物細(xì)胞工廠定向合成稀有植物天然化合物的新策略［13］。通過(guò)解析目標(biāo)化合物的生物合成途徑，人們可以在微生物細(xì)胞中重構(gòu)與優(yōu)化合成途徑，然后通過(guò)微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的定向合成及規(guī)?；a(chǎn)。近年來(lái)，這種新型的植物天然產(chǎn)物制備模式已被成功應(yīng)用于多種萜類［14-15］、生物堿類［13，16］、黃酮類［17］等化合物的合成與應(yīng)用中，該方法不僅能快速、大量地獲得特定化合物單體用于其活性篩選，還能大幅降低化合物開(kāi)發(fā)成本，保護(hù)珍稀植物資源。

α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯的生物合成途徑目前已得到解析（圖1）。倍半萜類化合物在生物體內(nèi)的共同前體為法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP），由甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑合成（圖 1）。2016 年 Wu 等［18］在大腸桿菌底盤中對(duì)來(lái)源于4 種植物內(nèi)生真菌的共26 個(gè)萜烯合酶（terpene synthase）進(jìn)行了功能表征，其中的EC38-CS 是目前唯一被證實(shí)可以將FPP 轉(zhuǎn)化為α-新丁香三環(huán)烯的倍半萜合酶（圖1）。但是EC38-CS 的產(chǎn)物除了α-新丁香三環(huán)烯之外，還有α-芹子烯（α-selinene）、葎草烯（humulene）和β-石竹烯（β-caryophyllene）等，并且α-新丁香三環(huán)烯占其總產(chǎn)物的比例僅為4.76%。β-石竹烯的合成途徑也已在2002年［19］得到解析，研究者在黃花蒿（Artemisia annua）中成功克隆得到倍半萜合酶元件QHS1，通過(guò)體外催化證實(shí)其可以高效催化FPP生成β-石竹烯且產(chǎn)物非常單一。

圖1 α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯的生物合成途徑及化學(xué)轉(zhuǎn)化Fig.1 Biosynthetic pathway and chemical conversion of α-neoclovene and β-caryophyllene

為了實(shí)現(xiàn)α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯的高效合成，本工作在前人研究的基礎(chǔ)上：①通過(guò)對(duì)釀酒酵母內(nèi)源MVA 途徑的全面強(qiáng)化，構(gòu)建了高產(chǎn)倍半萜類化合物前體FPP的酵母底盤菌株，其前體產(chǎn)量比野生型菌株提高了458倍，可用于后續(xù)各種倍半萜類化合物細(xì)胞工廠的構(gòu)建；②在FPP底盤菌株的基礎(chǔ)上，通過(guò)異源表達(dá)植物內(nèi)生真菌Hypoxylonsp. EC38 來(lái)源的倍半萜合酶基因ec38-cs，首次在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了α-新丁香三環(huán)烯的高效從頭合成，其發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到了487.1 mg/L；③在FPP 底盤菌株的基礎(chǔ)上，通過(guò)異源表達(dá)黃花蒿來(lái)源的倍半萜合酶基因QHS1，在釀酒酵母中從頭合成了β-石竹烯，其發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到了2949.1 mg/L，可用于β-石竹烯的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、基因及引物

本研究所涉及的菌株列于表1。本研究中用于途徑構(gòu)建與過(guò)表達(dá)的基因信息列于表2。本研究中涉及的寡核苷酸引物由生工生物工程（上海）股份有限公司、北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司和鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

表1 本研究所涉及的菌株信息Tab.1 Strains used in this study

表2 本研究所涉及的基因Tab.2 Genes used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

SC 固體篩選培養(yǎng)基（100 mL）：0.67 g 無(wú)氨基酸酵母氮源［生工生物工程（上海）股份有限公司］，2.2 g D（＋）-葡萄糖一水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），2 g 瓊脂粉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

YPD固體篩選培養(yǎng)基（100 mL）：1 g酵母提取物（OXOⅠD），2 g 細(xì)菌源蛋白胨No.2 （OXOⅠD），2.2 g D（＋）-葡萄糖一水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），2 g瓊脂粉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

YPD 發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：1 g 酵母提取物（OXOⅠD），2 g 細(xì)菌源蛋白胨 No.2（OXOⅠD），2.2 g D（＋）-葡萄糖一水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2×YPD 培養(yǎng)基（100 mL）：2 g 酵母提取物（OXOⅠD），4 g 細(xì)菌源蛋白胨 No.2（OXOⅠD），4.4 g D（＋）-葡萄糖一水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 試劑

在酵母菌株構(gòu)建中用于基因片段擴(kuò)增的高保真 PCR 酶 ： PrimerSTAR Max DNA Polymerase（Takara）；用于酵母菌株菌落PCR 驗(yàn)證的PCR 酶：ExTaqDNA Polymerase（Takara）；用于酵母菌株菌落PCR 驗(yàn)證的裂解液：Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（Takara）；用于酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)物萃取的正十二烷： Dodecane（Sigma）；β-石竹烯標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于南通飛宇生物科技有限公司。

1.2 釀酒酵母感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化及菌株構(gòu)建方法

1.2.1 釀酒酵母感受態(tài)制備方法

首先，用無(wú)菌牙簽從YPD 平板中挑取培養(yǎng)好的釀酒酵母菌株，接種于含有4 mL YPD 培養(yǎng)基的試管中，置于30 ℃，250 r/min 搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間16 h 左右；測(cè)定試管中酵母細(xì)胞的濃度，吸取適量菌體進(jìn)行稀釋，用分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值，含有1×106細(xì)胞/mL 稀釋液OD600值為0.1；接下來(lái)，吸取2.5×108細(xì)胞接種到含50 mL 2×YPD 培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于30 ℃、250 r/min 搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，至OD600達(dá)到2.0（大約需要4 h）；然后，用50 mL 無(wú)菌離心管在室溫、3000g條件下離心5 min 收集菌體，并用25 mL 無(wú)菌水重懸、收集菌體兩次；再次在室溫、3000g條件下離心5 min收集菌體，并用1 mL無(wú)菌水重懸菌體，將其轉(zhuǎn)移到1.5 mL 無(wú)菌離心管，13 000g離心1 min 收集菌體；最后，用1 mL 1 mol/L 山梨醇重懸菌體，以100 μL/管進(jìn)行分裝，凍存于-80 ℃以備后用，完成酵母感受態(tài)制備［20］。

1.2.2 釀酒酵母轉(zhuǎn)化方法

從-80 ℃冰箱取出制作好的感受態(tài)細(xì)胞，置于室溫環(huán)境中10 min，待融解后12 000g、1 min離心，吸去上層山梨醇，保留菌體待轉(zhuǎn)化使用；同時(shí)，將配制好的ssDNA 用PCR 儀進(jìn)行變性處理，99 ℃，5 min 后立即埋入冰盒中進(jìn)行冷卻，待轉(zhuǎn)化時(shí)使用；配制360 μL 轉(zhuǎn)化體系，其中PEG3350（0.5 kg/L）240 μL、ssDNA 50 μL、1 mol/L LiAc 36 μL、待轉(zhuǎn)化 DNA 片段 34 μL；然后，將360 μL 轉(zhuǎn)化體系加入到感受態(tài)細(xì)胞中并進(jìn)行重懸，置于42 ℃水浴鍋中熱激40 min；之后，12 000g離心1 min 收集菌體，吸去上層轉(zhuǎn)化體系，加入1 mL YPD 進(jìn)行重懸，并置于30 ℃，200 r/min 搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇3 h（如果是營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記可省略此步驟）；最后，12 000g離心1 min 收集菌體，吸去上層培養(yǎng)基/轉(zhuǎn)化液，用適量無(wú)菌水對(duì)菌體進(jìn)行重懸，并涂布于含有相應(yīng)抗生素的YPD 或營(yíng)養(yǎng)缺陷型的SC 平板中，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后便可對(duì)平板上的菌落進(jìn)行相應(yīng)驗(yàn)證。

1.2.3 釀酒酵母菌株構(gòu)建方法

首先，設(shè)計(jì)引物，對(duì)釀酒酵母轉(zhuǎn)化片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段包括：插入位點(diǎn)上游同源臂、啟動(dòng)子、基因片段、終止子、篩選標(biāo)記和插入位點(diǎn)下游同源臂。相鄰片段之間含有約70 bp 左右同源臂，用于酵母體內(nèi)同源重組；然后，將PCR片段進(jìn)行混合，片段加入量為1000 ng/kb，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的釀酒酵母菌株，并對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。最后，挑選10 個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，選取目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量最高的菌株進(jìn)行保存并命名。

1.3 釀酒酵母菌株發(fā)酵及倍半萜產(chǎn)物抽提方法

用牙簽在篩選平板上挑取陽(yáng)性單克隆于5 mL YPD 試管中，30 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng) 24 h；將培養(yǎng)好的菌體以1∶100 的比例接種于含有10 mL YPD 液體培養(yǎng)基的50 mL 錐形瓶中，并加入1 mL十二烷萃取劑，30 ℃、250 r/min 搖床發(fā)酵培養(yǎng)96 h；將發(fā)酵液連同萃取劑置于15 mL 離心管，3000g離心5 min；吸取上層十二烷有機(jī)相，用于后續(xù)定性或定量分析。

1.4 角鯊烯、羊毛甾醇抽提方法

將菌株發(fā)酵液離心收集菌體；配制裂解液，50%乙醇和20% KOH 裂解液；用等體積裂解液懸菌體，置于沸水中裂解30 min，加入等體積正己烷混勻抽提1 h；離心取100 μL 上層正己烷有機(jī)相蒸干，加100 μL 乙醇溶解，用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 釀酒酵母倍半萜代謝物的GC和GC-MS分析方法

使用島津GC-2010Pro 氣相色譜儀進(jìn)行倍半萜檢測(cè)，采用氫火焰離子（FⅠD）檢測(cè)器。GC 分析條件如下：熱電TG-5MS 型毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為200 ℃。

升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min 升溫至220 ℃并保持10 min，最后以30 ℃/min降溫至50 ℃。

載氣為高純氮?dú)猓髁繛?2 mL/min；分流比為40∶1；檢測(cè)器溫度為250 ℃。

使用安捷倫GC-MS 7890-5977 進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)，分析條件：離子源為EⅠ，溫度為230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度為250 ℃；溶劑延時(shí)2 min；倍增器電壓為1.165 kV；掃描范圍30～550 ainu。根據(jù)NⅠST 2011 質(zhì)譜庫(kù)搜索質(zhì)譜成分，質(zhì)譜匹配因子（mass spectra match factor）＞85%的成分可初步鑒定為該化合物。

1.6 釀酒酵母代謝物角鯊烯、羊毛甾醇的高效液相色譜（HPLC）分析方法

使用島津LC20A XR高效液相色譜進(jìn)行角鯊烯和羊毛甾醇的檢測(cè)，分析條件如下：液相色譜柱為月旭Boltimate EXT-C18核殼柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為水（A）和乙腈（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；流速為0.45 mL/min；流動(dòng)相梯度程序：0～2.00 min 60%B，2.00～5.00 min 60%～100%B，5.00～17.00 min 100%B，17.00～20.00 min 60%B。

1.7 倍半萜細(xì)胞工廠發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵方法

使用 1.3 L DASGⅠP 生物反應(yīng)器（Eppendorf，Germany）對(duì)NCVBY01和CPLBY01進(jìn)行批次補(bǔ)料發(fā)酵。采用合成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵且培養(yǎng)基成分與之前報(bào)道［21］的一致。發(fā)酵過(guò)程中，溫度保持30 ℃，pH 通過(guò)流加氨水控制在5.0，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度和通氣量將溶氧控制在30%以上。通過(guò)調(diào)節(jié)補(bǔ)料速度使發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量低于0.5 g/L。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同酵母出發(fā)菌株合成萜類前體化合物的潛能比較

與大腸桿菌等原核生物相比，釀酒酵母在萜類化合物的合成中具有一定的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠浜袃?nèi)源的MVA 途徑（圖1），可以合成倍半萜類化合物的共同前體FPP。BY4742 與CEN.PK2-1 為目前合成生物學(xué)中常用的兩種釀酒酵母出發(fā)菌株，其在萜類化合物的合成與積累方面表現(xiàn)出不同特性［22］，因此首先需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩種出發(fā)菌株的FPP生產(chǎn)潛能進(jìn)行比較與評(píng)估。受限于目前的化合物檢測(cè)手段，對(duì)FPP進(jìn)行定量的檢測(cè)依然難以實(shí)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，酵母內(nèi)源的磷酸化酶可以將FPP轉(zhuǎn)化為其去磷酸化的衍生物法尼醇（farnesol，F(xiàn)OH）［23］，而 FOH 的檢測(cè)方法相對(duì)成熟［23］，因此通過(guò)對(duì)酵母發(fā)酵液中FOH 的定量檢測(cè)來(lái)間接反映菌株中FPP的合成與積累，這成為目前對(duì)FPP檢測(cè)的重要手段。

首先，通過(guò)對(duì)兩種野生型釀酒酵母菌株發(fā)酵液中的FOH 進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果如圖2（a）、（b）所示，BY4742菌株中FOH的積累量為0.177 mg/L，是CEN.PK2-1 菌株的4 倍多（表3）。同時(shí)通過(guò)對(duì)FPP 下游產(chǎn)物角鯊烯（squalene）與羊毛甾醇（lanosterol）進(jìn)行檢測(cè)［圖2（c）］，其結(jié)果表明：BY4742 菌株角鯊烯產(chǎn)量為0.50 mg/L，為CEN.PK2-1 菌株的1.7 倍（表3）；但是在羊毛甾醇產(chǎn)量上 BY4742 菌 株 卻 略 低 于 CEN. PK2-1 菌株（表3）。

圖2 用GC-FⅠD和HPLC分別檢測(cè)菌株中FOH和角鯊烯、羊毛甾醇的積累量Fig.2 Analysis of FOH and squalene,lanosterol accumulated in engineered yeast strains by GC and HPLC

為了進(jìn)一步評(píng)估這2個(gè)出發(fā)菌株合成萜類前體化合物的潛能，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)利用強(qiáng)啟動(dòng)子提高了它們各自 MVA 途徑中的ERG8、EGR10和tHMGR基因的表達(dá)水平，分別構(gòu)建了菌株SQTBY01 和SQTCEN01。對(duì)這兩個(gè)工程菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2 所示。在產(chǎn)物凈積累量方面，由BY4742 為出發(fā)菌株構(gòu)建的菌株SQTBY01 合成FOH、角鯊烯和羊毛甾醇的產(chǎn)量均要高于菌株CEN.PK2-1 來(lái)源的SQTCEN01，分別為后者的9.0 倍、1.6 倍和 1.7 倍 （表 3）；在 3 種產(chǎn)物提高量方面，SQTBY01 菌株相較于其出發(fā)菌株分別提高了 25.7 倍、102 倍和 14.8 倍，SQTCEN01 菌株相較于其出發(fā)菌株則分別提高了11.5 倍、107 倍和7.6 倍（表3）。以上結(jié)果表明，不論是萜類前體化合物的凈積累量還是總產(chǎn)量提高的幅度，BY4742菌株均要優(yōu)于CEN.PK2-1，因此BY4742 被選定為出發(fā)菌株用于后續(xù)倍半萜類化合物的底盤細(xì)胞與細(xì)胞工廠的構(gòu)建。

表3 FOH、角鯊烯和羊毛甾醇在菌株中的積累量Tab.3 Production of FOH,squalene and lanosterol in different yeast strains

2.2 高產(chǎn)FPP的釀酒酵母底盤菌株的構(gòu)建

2.2.1 GAL80敲除菌株的構(gòu)建

釀酒酵母半乳糖利用相關(guān)基因（GALgenes）的啟動(dòng)子（例如GAL1p、GAL7p和GAL10p等）具有較強(qiáng)的啟動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄的能力［24］，在構(gòu)建釀酒酵母細(xì)胞工廠中具有十分廣泛的應(yīng)用。GAL80基因是參與抑制GAL系列基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在半乳糖不存在的條件下，通過(guò)與GAL系列基因啟動(dòng)子結(jié)合從而阻遏GAL基因的轉(zhuǎn)錄［25］。因此，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中利用GAL系列基因的啟動(dòng)子首先需要敲除釀酒酵母內(nèi)源的GAL80基因，以解除其對(duì)GAL系列啟動(dòng)子的阻遏。

首先GAL80基因通過(guò)移除整個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）實(shí)現(xiàn)敲除［圖3（a）］，PCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示［圖3（b）］，GAL80基因已在目標(biāo)菌株中成功敲除。此菌株被命名為BY4742Δ。

圖3 BY4742Δ菌株的構(gòu)建與PCR驗(yàn)證Fig.3 Construction and PCR verification of the strain BY4742Δ

2.2.2 高產(chǎn)FPP的倍半萜底盤菌株的構(gòu)建

Acetyl-CoA經(jīng)釀酒酵母MVA途徑轉(zhuǎn)化為FPP的過(guò)程，共有8個(gè)關(guān)鍵內(nèi)源基因參與，依次為ERG10、ERG13、tHMGR、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1和ERG20［26］（圖1）。上述基因被劃分為兩個(gè)模塊［圖4（a）］，依次在敲除菌株BY4742Δ中進(jìn)行強(qiáng)化。

圖4 強(qiáng)化MVA途徑的菌株構(gòu)建與相應(yīng)的FOH產(chǎn)量Fig.4 Construction of strains with an enhanced MVA pathways and their FOH production

首先，ERG10、ERG13、tHMGR、ERG12和ERG8五個(gè)基因與相應(yīng)啟動(dòng)子、終止子進(jìn)行連接，組成表達(dá)盒后，串聯(lián)整合到BY4742Δ 菌株基因組的多拷貝delta位點(diǎn)［圖4（a）］，構(gòu)建了菌株SQTBY02。檢測(cè)SQTBY02 菌株的發(fā)酵產(chǎn)物表明，其發(fā)酵液中FOH 含量達(dá)到了15.44 mg/L，與出發(fā)菌株 BY4742Δ 相比有了 86 倍的提高［圖 4（b）］。在SQTBY02 菌株的基礎(chǔ)上，繼續(xù)整合第2 個(gè)強(qiáng)化模塊，即，將ERG19、IDI1和ERG20三個(gè)基因組成表達(dá)盒進(jìn)行串聯(lián)，同時(shí)再串聯(lián)一個(gè)拷貝的tHMGR表達(dá)盒［圖4（a）］，共同整合到SQTBY02菌株基因組的多拷貝rDNA位點(diǎn)，構(gòu)建了菌株SQTBY03。對(duì)SQTBY03 菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)，其發(fā)酵液中FOH 含量達(dá)到了82.36 mg/L，比SQTBY02 菌株進(jìn)一步提高了5.3 倍，與出發(fā)菌株BY4742Δ 相 比有了 458 倍 的提高 ［圖 4（b）］。SQTBY03 菌株可作為通用底盤細(xì)胞用于后續(xù)各種倍半萜細(xì)胞工廠的構(gòu)建。

2.3 α-新丁香三環(huán)烯細(xì)胞工廠的構(gòu)建

真菌Hypoxylonsp.EC38來(lái)源的ec38-cs是目前唯一報(bào)道可以合成α-新丁香三環(huán)烯的倍半萜合酶基因［18］，將其用于α-新丁香三環(huán)烯細(xì)胞工廠的構(gòu)建（圖1）。為了提高ec38-cs在釀酒酵母中的表達(dá)水平，ec38-cs基因的全序列根據(jù)釀酒酵母密碼子偏好性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因被命名為synec38-cs。

為了增強(qiáng)菌株的穩(wěn)定性，將synec38-cs基因在底盤菌株SQTBY03 基因組的X-4單拷貝位點(diǎn)進(jìn)行了整合，并利用強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1p控制該基因的轉(zhuǎn)錄［圖5（a）］，構(gòu)建了菌株NCVBY01。在搖瓶發(fā)酵后，對(duì)NCVBY01 菌株產(chǎn)物進(jìn)行了GC/MS檢測(cè)與鑒定。與ec38-cs在大腸桿菌底盤中合成倍半萜的文獻(xiàn)報(bào)道相比可以發(fā)現(xiàn)，NCVBY01 菌株（即ec38-cs在酵母底盤內(nèi)）也合成了多種不同的倍半萜類化合物（表4），但是產(chǎn)物的比例發(fā)生了很大的變化，其中變化最為顯著的是α-新丁香三環(huán)烯的含量從文獻(xiàn)報(bào)道的4.76%增加到了39.9%（表4），這很可能是因?yàn)楸栋胼坪厦窫C38-CS 在不同底盤細(xì)胞中催化活性發(fā)生變化造成的。α-新丁香三環(huán)烯在細(xì)胞工廠NCVBY01 的搖瓶產(chǎn)量為25.8 mg/L。接著在1 L 發(fā)酵罐中對(duì)NCVBY01 菌株進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，在發(fā)酵140 h 時(shí)，菌株OD600值達(dá)到了450，其α-新丁香三環(huán)烯產(chǎn)量達(dá)到了487.1 mg/L，實(shí)現(xiàn)了較為高效的異源合成（表5）。

表4 GC/MS分析對(duì)NCVBY01菌株發(fā)酵副產(chǎn)物的鑒定Tab.4 GC/MS analysis for identification of by-products produced by NCVBY01

圖5 NCVBY01和CPLBY01菌株的構(gòu)建示意圖及其發(fā)酵產(chǎn)物GC檢測(cè)Fig.5 Construction of NCVBY01 and CPLBY01 and GC analysis of their α-neoclovene and β-caryophyllene productions

2.4 β-石竹烯細(xì)胞工廠的構(gòu)建

為了構(gòu)建β-石竹烯酵母細(xì)胞工廠，選擇了黃花蒿來(lái)源的QHS1作為倍半萜合酶元件，它可以高效催化FPP且產(chǎn)物主要為β-石竹烯。首先，根據(jù)釀酒酵母密碼子的偏好性對(duì)黃花蒿來(lái)源的石竹烯合酶QHS1基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因命名為synQHS1。然后，與α-新丁香三環(huán)烯細(xì)胞工廠的構(gòu)建類似，從倍半萜通用底盤菌株SQTBY03 出發(fā)，將synQHS1基因整合到底盤菌株SQTBY03 基因組的X-4單拷貝位點(diǎn)［圖5（b）］，構(gòu)建了菌株CPLBY01。CPLBY01 菌株的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物中成功檢測(cè)到了β-石竹烯［圖5（b）］，其產(chǎn)量達(dá)到了250.4 mg/L，且產(chǎn)物中幾乎沒(méi)有其他倍半萜類副產(chǎn)物。在1 L 發(fā)酵罐中對(duì)CPLBY01 菌株進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，在發(fā)酵140 h 時(shí)，菌株OD600值達(dá)到了446，其β-石竹烯產(chǎn)量達(dá)到了2949.1 mg/L（表5），唯一可以檢測(cè)到的倍半萜副產(chǎn)物為α-humulene（表5）。

表5 NCVBY01和CPLBY01菌株倍半萜產(chǎn)物的發(fā)酵罐產(chǎn)量Tab.5 Yield of sesquiterpenes in NCVBY01 and CPLBY01 by fed-batch fermentation.

3 結(jié) 論

倍半萜類化合物具有多種多樣的生理學(xué)功能，一直以來(lái)都是植物天然藥物開(kāi)發(fā)的重要源泉。然而由于其在植物中的含量往往極其稀少且成分復(fù)雜，要獲得足夠多、純度高的化合物單體往往十分困難，這嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。本項(xiàng)研究以α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯為例，利用合成生物學(xué)的原理與方法，成功構(gòu)建了倍半萜通用的釀酒酵母底盤菌株及α-新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯兩種細(xì)胞工廠，為規(guī)?；苽洇?新丁香三環(huán)烯和β-石竹烯及其他倍半萜類天然化合物奠定了重要基礎(chǔ)。

2016年，Yang等［27］通過(guò)在大腸桿菌中強(qiáng)化乙酸利用元件、整合外源MVA 途徑及異源表達(dá)石竹烯合酶基因QHS1，成功以乙酸為唯一碳源合成了β-石竹烯，其搖瓶產(chǎn)量為106 mg/L。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，該菌株在發(fā)酵罐中合成β-石竹烯的產(chǎn)量達(dá)到了 1.05 g/L。2018 年，Wu 等［28］同樣嘗試了在大腸桿菌中合成多種倍半萜類化合物，其中，β-石竹烯的產(chǎn)量為100 mg/L。本研究通過(guò)對(duì)比兩種釀酒酵母工程菌株BY4742 和CEN.PK2-1 在生產(chǎn)倍半萜類化合物方面的潛能，以菌株BY4742 為出發(fā)菌株，構(gòu)建了生產(chǎn)倍半萜類化合物的通用底盤菌株SQTBY03，其MVA途徑的整體代謝流量比出發(fā)菌株增強(qiáng)了458倍。在此底盤菌株中異源表達(dá)密碼子優(yōu)化的黃花蒿石竹烯合酶基因QHS1，獲得的β-石竹烯細(xì)胞工廠CPLBY01，其搖瓶產(chǎn)量達(dá)到了250.4 mg/L，發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到了2949.1 mg/L，為目前大腸桿菌報(bào)道最高水平的2.5 倍以上，該菌株有望應(yīng)用于β-石竹烯的工業(yè)生產(chǎn)中。

目前尚沒(méi)有從頭生物合成α-新丁香三環(huán)烯的報(bào)道，在功能鑒定真菌Hypoxylonsp.EC38 來(lái)源的倍半萜合酶基因synec38-cs時(shí)，研究者在大腸桿菌中搭建MVA 途徑并異源表達(dá)該基因，鑒定到產(chǎn)物中有α-新丁香三環(huán)烯，但含量極低［18］。本研究中，在底盤菌株SQTBY03 中異源表達(dá)密碼子優(yōu)化的倍半萜合酶基因synec38-cs，獲得的釀酒酵母細(xì)胞工廠NCVBY01，其α-新丁香三環(huán)烯的搖瓶產(chǎn)量為25.8 mg/L，發(fā)酵罐產(chǎn)量為487.1 mg/L，是目前首次報(bào)道的在微生物細(xì)胞工廠中合成α-新丁香三環(huán)烯，但與細(xì)胞工廠CPLBY01 的β-石竹烯產(chǎn)量相比，NCVBY01 菌株的α-新丁香三環(huán)烯產(chǎn)量相對(duì)較低，不到β-石竹烯產(chǎn)量的六分之一，這表明NCVBY01 菌株在α-新丁香三環(huán)烯產(chǎn)量方面還有較大的提升空間。其中限制其產(chǎn)量的關(guān)鍵因素在于目前采用的倍半萜合酶EC38-CS 并非最優(yōu)元件，其催化活性及產(chǎn)物專一性方面皆有待改善。接下來(lái)可以通過(guò)對(duì)新合酶元件的挖掘或?qū)ΜF(xiàn)有EC38-CS元件進(jìn)行改造，在提高底物FPP的轉(zhuǎn)化率的同時(shí)，減少產(chǎn)物譜中副產(chǎn)物所占的比例，將有望進(jìn)一步提高α-新丁香三環(huán)烯細(xì)胞工廠的產(chǎn)量。另外，已有文獻(xiàn)報(bào)道，以濃硫酸為酸性試劑對(duì)同為倍半萜類化合物的β-石竹烯進(jìn)行酸處理，可以在體外經(jīng)過(guò)一步簡(jiǎn)單的化學(xué)重排反應(yīng)生成α-新丁香三環(huán)烯［29］，其轉(zhuǎn)化率高達(dá)75%［30］，而本研究中構(gòu)建的β-石竹烯菌株其產(chǎn)量已接近3 g/L，這也為α-新丁香三環(huán)烯的制備提供了一條生物與化學(xué)結(jié)合的新合成途徑。

致謝：本工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFA09 04300）和國(guó)家自然科學(xué)基金（31921006）的支持。感謝中科院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心胡文利老師在GC-MS分析上給予的幫助。