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    肺癌患者術(shù)后血液高凝狀態(tài)與外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)性分析

    2021-11-29 01:49:50王曉康袁錦權(quán)
    中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥 2021年29期
    關(guān)鍵詞:高凝緩沖液外周血

    王曉康 袁錦權(quán)

    廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院胸心外科,廣東東莞 523000

    近幾十年來(lái),隨著人們生活方式的改變、環(huán)境污染和吸煙人數(shù)的增加,肺癌患者的發(fā)病率和死亡率逐年增高[1-2]。肺癌患者在患病期間以及手術(shù)前后往往伴隨一系列的并發(fā)癥,其中靜脈血栓栓塞在肺癌活動(dòng)期的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[3-5]。研究表明,血液的高凝狀態(tài)是靜脈血栓形成的直接因素,出現(xiàn)靜脈血栓的患者生存期明顯縮短,同時(shí)血液的高凝狀態(tài)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[6]。而外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTC)是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要前提條件,目前有關(guān)血液高凝狀態(tài)與外周血CTC 之間的關(guān)系研究較少,因此本研究通過(guò)對(duì)120 例經(jīng)肺癌切除術(shù)的患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析,以分析血液高凝狀態(tài)與外周血CTC 之間的關(guān)系及其對(duì)肺癌患者術(shù)后恢復(fù)的影響。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    回顧性選取2015年2月至2017年5月松山湖中心醫(yī)院胸外科收治的120 例肺癌患者為研究對(duì)象,根據(jù)外周血CTC 的檢測(cè)結(jié)果分為CTC 陽(yáng)性組(42 例)和CTC 陰性組(78 例)。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)醫(yī)院病理學(xué)檢驗(yàn)確診為原發(fā)性肺癌;②接受肺癌根治術(shù)治療;③卡氏評(píng)分≥60 分[7];④未接受過(guò)其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①不能接受肺癌切除手術(shù)治療;②合并患有其他部位腫瘤;③合并患有靜脈栓塞疾病;④合并患有其他肺部疾病的患者;⑤手術(shù)前使用過(guò)抗凝或止血類藥物;⑥嚴(yán)重肝、腎功能不足者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

    1.2 方法

    于手術(shù)后48 h 采集患者空腹?fàn)顟B(tài)下的靜脈血,分別采用全自動(dòng)血凝分析儀(貝克曼ACL7000)和血細(xì)胞分析儀(貝克曼LH750)對(duì)患者外周血中的D-二聚體(D-dimer,D-D)、纖維蛋白原(fibrinogen,F(xiàn)IB)因子和血小板(platelet,PLT)水平,同時(shí)檢測(cè)外周血CTC。實(shí)驗(yàn)操作如下: 取無(wú)菌的PBS 緩沖液5 ml 與采集的血液充分混勻,加入等體積的Ficoll 分離液,1500 r/min離心20 min,離心完畢小心吸取中間乳白色的單核細(xì)胞層,轉(zhuǎn)移至新的15 ml 離心管中,加入5 倍體積的PBS 緩沖液與細(xì)胞充分混勻,室溫下以轉(zhuǎn)速2000 r/min離心15 min,離心結(jié)束后棄掉上清,然后加入10 ml無(wú)菌PBS 緩沖液將細(xì)胞重懸,同樣轉(zhuǎn)速離心10 min。棄掉上清,用100 μl 磁珠緩沖液將細(xì)胞重懸,加入15 μl CD45 抗體溶液,輕吹混勻后,于4℃靜置孵育20 min。孵育的過(guò)程中取出免疫磁珠,用磁珠緩沖液清洗一遍,然后用2 ml 磁珠緩沖液重懸備用。抗體孵育完畢后,加入10 ml 磁珠緩沖液,室溫下2000 r/min離心5 min,舍棄上清液。用準(zhǔn)備好的磁珠緩沖液將細(xì)胞重懸,用混勻儀室溫充分混勻15 min?;靹蚝笥靡埔簶寣⒓?xì)胞轉(zhuǎn)移至美天旎磁珠分選柱,常壓過(guò)柱子,待液體流動(dòng)完畢加入500 μl 緩沖液沖洗2 次,合并收集流穿液。將收集的細(xì)胞懸液于2000 r/min 離心10 min,棄上清,輕彈細(xì)胞團(tuán)至散開(kāi),然后將其取出均勻的涂抹在載玻片上,采用4%多聚甲醛在室溫下將細(xì)胞固定10 min,用PBS 洗滌三次,加入抗廣譜角蛋白抗體于2~8℃孵育30 min,然后用PBS 洗滌一次,加入二抗孵育30 min。最后采用HE 染色5 min,風(fēng)化脫水至透明狀態(tài),以中性樹(shù)膠封片,方法參考文獻(xiàn)[20]。

    1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

    外周血D-D 的正常范圍為0~0.55 mg/L,F(xiàn)IB 正常范圍為1.8~3.5 g/L,PLT 正常范圍為(125~350)×109/L。CTC 陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞呈圓形或橢圓形,可見(jiàn)完整細(xì)胞膜和清晰的細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞平均直徑大于10 μm;細(xì)胞質(zhì)染色陽(yáng)性,呈藍(lán)黑色或褐色;核質(zhì)比異常[19]。

    收集并對(duì)比所有患者的臨床資料,依據(jù)外周血CTC 的檢測(cè)結(jié)果將患者分為CTC 陽(yáng)性組和CTC 陰性組。同時(shí)分析所有患者的臨床資料以及D-D、FIB和PLT 等凝血指標(biāo)進(jìn)行分析對(duì)比。在手術(shù)結(jié)束后至2020年5月,定期對(duì)患者進(jìn)行電話或門診隨訪,患者死亡則終止隨訪,根據(jù)死亡和存活情況將患者分組,并分析術(shù)后預(yù)后的危險(xiǎn)影響因素。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);單因素分析采用χ2檢驗(yàn),單因素分析中,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量,納入多因素logistic 回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組患者臨床資料的比較

    CTC 陽(yáng)性組術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率及TMN 分期為Ⅲ期的占比高于CTC 陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

    表1 兩組患者臨床資料的比較[n(%)]

    2.2 兩組患者凝血指標(biāo)的比較

    CTC 陽(yáng)性組患者的外周血中D-D、FIB 及PLT 水平均高于CTC 陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

    表2 兩組患者凝血指標(biāo)的比較(±s)

    表2 兩組患者凝血指標(biāo)的比較(±s)

    組別 D-D(mg/ml) FIB(g/L) PLT(×109/L)CTC 陽(yáng)性組(n=42)CTC 陰性組(n=78)t 值P 值3.42±0.54 0.75±0.66 16.710<0.001 4.01±0.98 0.98±1.02 13.452<0.001 366.75±35.63 231.41±52.13 9.665<0.001

    2.3 肺癌患者術(shù)后預(yù)后的影響因素分析

    從隨訪開(kāi)始到隨訪結(jié)束,所有患者的平均隨訪時(shí)間為(31.35±2.95)個(gè)月,其中5 例患者脫落,115 例患者中,死亡35 例,3年的存活率為69.57%(80/115)。單因素分析顯示,死亡組患者TMN 分期為Ⅲ期、CTC為陽(yáng)性的患者比例均高于存活組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。由于性別、年齡、吸煙史、TMN 分期、病理分型、CTC、手術(shù)切除方式都可能影響預(yù)后,為了明確是否有混雜因素,故均納入多因素分析,結(jié)果顯示,TMN 分期及CTC 是患者死亡的獨(dú)立影響因素(P<0.05)(表4)。

    表3 影響肺癌患者術(shù)后預(yù)后的單因素分析[n(%)]

    表4 影響肺癌患者術(shù)后預(yù)后的多因素分析

    3 討論

    血液高凝是由多種疾病原因引起的血液中促凝血因子增加、抗凝血因子水平下降的一種狀態(tài),患者往往會(huì)出現(xiàn)纖溶功能受損、靜脈瘀血、高脂血癥、低蛋白血癥和血液黏滯度增加等臨床癥狀,而且激素和利尿劑的使用都會(huì)引起血漿FIB 水平及其降解產(chǎn)物的增高,從而產(chǎn)生血液高凝狀態(tài)[8-9]。最初這種現(xiàn)象是在腎病綜合征病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn),血液高凝的發(fā)生和發(fā)展貫穿在許多慢性疾病中比如心腦血管疾病、 糖尿病、高血脂和血栓性疾病中,后來(lái)的臨床觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤患者術(shù)后同樣容易發(fā)生血液的高凝狀態(tài),而且這種狀態(tài)會(huì)對(duì)腫瘤患者術(shù)后的預(yù)后產(chǎn)生極大的影響[10-12]。

    臨床研究發(fā)現(xiàn),90%以上發(fā)生腫瘤惡性轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)都存在血液高凝狀態(tài),包括急性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肺癌、胰腺癌等[13]。其中肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤,也是最容易轉(zhuǎn)移的腫瘤,其致死率在所有癌癥中居首位[14]。腫瘤利用多重手段打破了機(jī)體的凝血和抗凝系統(tǒng)的平衡,手術(shù)切除、放療和化療等一些治療手段會(huì)加重這種失衡的狀態(tài),從而使機(jī)體血液處于高凝狀態(tài),而這種高凝狀態(tài)對(duì)于腫瘤的惡化具有促進(jìn)作用,并且能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[15]。因此,臨床醫(yī)生越來(lái)越關(guān)注腫瘤患者血液高凝狀態(tài)的機(jī)制研究,并在發(fā)生早期采取一定的干預(yù)手段,這對(duì)于腫瘤患者的治療、術(shù)后良好的預(yù)后和生存期的提高具有積極的指導(dǎo)意義[16]。

    血液高凝狀態(tài)是靜脈血栓發(fā)生發(fā)展的初期階段,在這個(gè)過(guò)程中,D-D、FIB 和PLT 等因子發(fā)揮著重要的作用,臨床上常作為血栓形成和高凝狀態(tài)診斷的指標(biāo)[17]。D-D 是血液中FIB 經(jīng)過(guò)纖溶酶活化和分解后的降解產(chǎn)物,其水平升高說(shuō)明機(jī)體的FIB 溶解過(guò)度并存在高凝狀態(tài),因此血液中D-D 的水平對(duì)于血栓性疾病的診斷和療效評(píng)估具有一定的指導(dǎo)意義[18]。FIB 是血液中含量最豐富的凝血因子,其在凝血過(guò)程中在凝血酶作用下降解為單體蛋白質(zhì)而發(fā)揮凝血功能,其在感染過(guò)程和腫瘤患者體內(nèi)水平明顯升高,是血栓發(fā)生的危險(xiǎn)因素[19];PLT 是參與凝血的重要組分之一,在腫瘤患者體內(nèi),PLT 被腫瘤細(xì)胞分泌的凝血活性因子黏附聚集在腫瘤表面,同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速轉(zhuǎn)移和發(fā)展[20-21]。

    本研究發(fā)現(xiàn),CTC 陽(yáng)性組患者在術(shù)后發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例高于CTC 陰性組患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),同時(shí)CTC 陽(yáng)性組患者中TMN分期為Ⅲ期的比例高于CTC 陰性組患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示CTC 的存在促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和惡性發(fā)展。對(duì)患者外周血檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CTC 陽(yáng)性組患者的外周血中D-D、FIB 和PLT 的水平均高于CTC 陰性組的患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明外周血中CTC 的存在與腫瘤患者的血液高凝狀態(tài)具有一定相關(guān)性。CTC 的存在是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的早期現(xiàn)象,同時(shí)腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌一些促凝因子激活外周血中的凝血酶原,促進(jìn)凝血,從而提高了腫瘤細(xì)胞在組織靶器官的黏附,促進(jìn)其轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生和發(fā)展。

    綜上所述,CTC 陽(yáng)性的肺癌患者在根治術(shù)后容易發(fā)生血液高凝狀態(tài),并伴隨著腫瘤的術(shù)后轉(zhuǎn)移,可對(duì)肺癌患者的臨床診斷和病情評(píng)估提供參考依據(jù),對(duì)患者的術(shù)后預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

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