面膜類化妝品微生物檢查方法學(xué)研究

杭 婧

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 223300）

面膜是當(dāng)今社會(huì)最常見的日用化妝品之一，尤其受愛美女士的喜愛。不同功能的面膜有不同的功效，如深層清潔、淡斑祛痘、補(bǔ)水保濕、改善暗沉膚色等。化妝品成份中含豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素、無機(jī)鹽和水分，pH值約4～7，極利于微生物的生長(zhǎng)和繁殖，導(dǎo)致化妝品腐敗變質(zhì)，嚴(yán)重影響化妝品的衛(wèi)生質(zhì)量與使用的安全性，對(duì)人們的健康造成危害［1］。面膜類化妝品一旦受到微生物污染，就會(huì)引起皮膚感染或者過敏。為了抑制面膜內(nèi)微生物的生長(zhǎng)，商家在面膜產(chǎn)品中添加了多種類別的防腐劑，有的是單一防腐劑，有的是聯(lián)合添加不同類別的防腐劑以達(dá)到更好的抑菌效果。由于面膜類產(chǎn)品中防腐抑菌劑存在實(shí)際添加與標(biāo)簽不一致的情況［2］，防腐劑的濫用容易出現(xiàn)樣品陽性菌檢出率低甚至“全部合格”的情況。本文參考《中國(guó)藥典》2020年版微生物限度檢查方法進(jìn)行方法驗(yàn)證，以消除產(chǎn)品抑菌物質(zhì)的影響，提高陽性檢出率，真實(shí)地反應(yīng)樣品受微生物污染的程度。

1 儀器與材料

1.1 儀器 潔凈工作臺(tái)（BCM-1600A，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-3，上海躍進(jìn)有限公司）；SPX-350型生化培養(yǎng)箱；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3781L-PC型，松下）；生物安全柜（BSC-1304IIA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電子天平（PL6001，梅特勒公司）。

1.2 試驗(yàn)樣品 樣品A：Dr.magic黑金備長(zhǎng)炭控油凈致面膜（批號(hào)WR022D，科絲美詩廣州化妝品有限公司）；樣品B：SKIN Advanced卓沿白金水耀肌光感晶潤(rùn)煥采面膜（批號(hào)202309010I01，華安堂生物科技集團(tuán)有限公司）；樣品C：御泥坊清爽平衡泥漿面膜（批號(hào)N352G11F，湖南歐標(biāo)化妝品有限公司）；樣品D：紐西之謎南極冰藻清爽保濕面膜（批號(hào)LC082201BB，上海利萊日化有限公司）；樣品E：歐束夢(mèng)幻臻顏修護(hù)面膜（批號(hào)20190902，廣東巧巧生物科技有限公司）。以上樣品均來自2021年國(guó)家監(jiān)督抽檢。

1.3 菌株 枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基與試劑 卵磷脂-吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)1090181），孟加拉紅（虎紅）瓊脂（批號(hào)1096661）、SCDLP液體培養(yǎng)基（批號(hào)1087061），雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基（批號(hào)1080131）、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)（批號(hào)1092405）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)1081171）、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)1091601），以上培養(yǎng)基規(guī)格均為250 g，均來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；卵黃亞碲酸鉀增菌液（批號(hào)6108128），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。無菌氯化鈉注射液（250 ml∶2.25 g，批號(hào)200514 2C），江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 菌液制備 選取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的三代新鮮培養(yǎng)物，用無菌氯化鈉注射液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。

2.2 供試液制備 按照2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》［3］進(jìn)行供試液（1∶10和1∶100）制備。

2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 常規(guī)法 ①試驗(yàn)組：取供試液1 ml加入“2.1”項(xiàng)下制備的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液，混勻，傾注卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，霉菌和酵母菌傾注虎紅培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，同時(shí)均設(shè)空白對(duì)照。②菌液組：取稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。③供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。參考《中國(guó)藥典》2020年版四部，5種試驗(yàn)菌回收率在50%～200%，符合方法適用性試驗(yàn)要求。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)的50%，可采用稀釋法、薄膜過濾法等方法。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 試驗(yàn)組：分別取1∶10供試液0.5 ml/皿和1∶100供試液1 ml/皿加入5種試驗(yàn)菌液，混勻，其余操作同常規(guī)法。

2.4 控制菌方法適用性試驗(yàn)

2.4.1 常規(guī)法 ①耐熱大腸菌群（10 ml/管）：取1∶10樣品供試液10 ml，分別接種于2管10 ml雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基，其中一管不加菌作為陰性對(duì)照組，另一管加入不大于100 cfu的大腸埃希菌作為試驗(yàn)組。②銅綠假單胞菌（90 ml/瓶）：取1∶10樣品供試液10 ml，分別接種于90 ml的SCDLP培養(yǎng)基中，其中一瓶不加菌作為陰性對(duì)照組，另一管加入不大于100 cfu的銅綠假單胞菌作為試驗(yàn)組。③金黃色葡萄球菌（90 ml/瓶）：取1∶10樣品供試液10 ml，分別接種于90 ml的SCDLP培養(yǎng)基中，其中一瓶不加菌作為陰性對(duì)照組，另一瓶加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)組。

2.4.2 稀釋法 銅綠假單胞菌（200 ml/瓶）：取1∶10樣品供試液10 ml，分別接種于200 ml的SCDLP培養(yǎng)基中，其中一瓶不加菌作為陰性對(duì)照組，另一瓶加入不大于100 cfu的銅綠假單胞菌作為試驗(yàn)組，置36℃培養(yǎng)24 h，劃線于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基，置36℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 微生物限度回收率 以《中國(guó)藥典》2020年版中各試驗(yàn)菌回收率在50%～200%為參考標(biāo)準(zhǔn)，樣品C采用常規(guī)法檢驗(yàn)的枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌均小于50%，采用1∶100供試液1 ml/皿稀釋法時(shí)，枯草芽孢桿菌回收率達(dá)到60%，銅綠假單胞菌達(dá)到83%，采用1∶10供試液0.5 ml/皿稀釋法時(shí)，白色念珠菌回收率達(dá)到77%。樣品D采用常規(guī)法檢驗(yàn)時(shí)銅綠假單胞菌小于50%，直到采用1∶100供試液1 ml/皿稀釋法時(shí)，回收率達(dá)到62%。樣品A、B、E采用常規(guī)法檢驗(yàn)時(shí)各試驗(yàn)菌回收率均達(dá)到要求（大于50%），結(jié)果見表1。

表1 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)回收率 %

3.2 控制菌檢查方法適用性 Dr.magic黑金備長(zhǎng)炭控油凈致面膜（樣品A）、SKIN Advanced卓沿白金水耀肌光感晶潤(rùn)煥采面膜（樣品B）、御泥坊清爽平衡泥漿面膜（樣品C）和歐束夢(mèng)幻臻顏修護(hù)面膜（樣品E）采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌（耐熱大腸菌群10 ml/管、金黃色葡萄球菌90 ml/瓶、銅綠假單胞菌90 ml/瓶）方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)，試驗(yàn)菌均可檢出，陰性對(duì)照組均無菌生長(zhǎng)，可見樣品A、B、C和E可采用常規(guī)法進(jìn)行試驗(yàn)。紐西之謎南極冰藻清爽保濕面膜（樣品D）采用90 ml/瓶進(jìn)行銅綠假單胞菌進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)菌未生長(zhǎng)，培養(yǎng)基體積增加至200 ml/瓶時(shí)，檢出銅綠假單胞菌，陰性對(duì)照組均未長(zhǎng)菌?？梢姌悠稤可采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)。見表2-4。

表2 耐熱大腸菌群方法學(xué)研究結(jié)果

表3 金黃色葡萄球菌方法學(xué)研究結(jié)果

表4 銅綠假單胞菌方法學(xué)研究結(jié)果

4 討論

4.1 包文君［4］對(duì)臺(tái)州市1 978份化妝品進(jìn)行微生物檢查，合格率為98.43%。李海芳等［5］對(duì)新疆2016—2018年度進(jìn)行541批化妝品微生物指標(biāo)檢測(cè)，總合格率為95.7%。由此可見，化妝品微生物合格率存在普遍偏高的現(xiàn)象，論其原因：一方面是生產(chǎn)廠家對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量把控嚴(yán)格，產(chǎn)品質(zhì)量過硬。另一方面就是產(chǎn)品內(nèi)存在抑制微生物生長(zhǎng)的成分，使得產(chǎn)品基質(zhì)不適合微生物生長(zhǎng)，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)的概率很小或者完全不生長(zhǎng)?；瘖y品中防腐劑可以抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，雖然化妝品培養(yǎng)基中吐溫80和卵磷脂起到一定的中和作用，但是不能完全中和產(chǎn)品內(nèi)所有的抑菌成分，故建議對(duì)現(xiàn)有化妝品微生物檢驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)，增加供試品陽性對(duì)照。面膜類化妝品尤其是需要長(zhǎng)期開口的面膜，開口使用之后應(yīng)注意存放條件，以免因儲(chǔ)存不當(dāng)造成微生物的入侵，引起皮膚感染。

4.2 對(duì)于霉菌和酵母菌檢測(cè)，因考慮到霉菌孢子的生長(zhǎng)特點(diǎn)，建議放培養(yǎng)箱之后逐天觀察，以免按規(guī)定溫度培養(yǎng)之后出現(xiàn)霉菌成片狀生長(zhǎng)、無法計(jì)數(shù)或者造成計(jì)數(shù)減少的情況；對(duì)于測(cè)定耐熱大腸菌群的雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）發(fā)酵管，由于部分面膜類化妝品基質(zhì)黏稠，與培養(yǎng)基液體不融合甚至出現(xiàn)分層的現(xiàn)象，化妝品基質(zhì)沉淀覆蓋住產(chǎn)氣的小導(dǎo)管，進(jìn)而導(dǎo)致觀察發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣較為困難，因此檢測(cè)耐熱大腸的培養(yǎng)基以及檢測(cè)方法有待改進(jìn)。

4.3 5種面膜類化妝品采用常規(guī)法檢驗(yàn)時(shí)，一部分試驗(yàn)菌回收率低于50%，如御泥坊清爽平衡泥漿面膜（樣品C）和紐西之謎南極冰藻清爽保濕面膜（樣品D），若參照現(xiàn)行化妝品安全技術(shù)規(guī)范中微生物檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)，則會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，這樣很容易給市場(chǎng)監(jiān)管起到誤導(dǎo)的作用。在微生物方法適用性檢查中，對(duì)抑菌含量低的供試品，可通過培養(yǎng)基稀釋法減少供試品抑菌物質(zhì)的濃度，從而消除其對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響［6］。御泥坊清爽平衡泥漿面膜（樣品C）采用稀釋法（1∶100供試液1 ml/皿）進(jìn)行需氧菌試驗(yàn)，稀釋法（1∶10供試液0.5 ml/皿）進(jìn)行酵母菌試驗(yàn)，可以真實(shí)反應(yīng)樣品的微生物污染情況，使之更符合化妝品質(zhì)量控制的要求。