瓜子金及其提取物改善阿爾茲海默癥的研究進展

趙豫菀，李陳版

（1.洛陽濟世堂生物科技有限公司，河南 471000；2.河南科技大學第二附屬醫(yī)院，河南 471023）

阿爾茲海默?。ˋD）作為中樞神經系統(tǒng)（CNS）最常見的一種退行退化性疾病，其臨床表現較為典型，尤以記憶力減退、進行性的學習認知功能障礙最為常見。目前全世界已經有近4 680萬AD患者，預計2050年這個數字將翻兩倍，可能達到1.3億［1］。但對于AD的診療一直缺少有效的方法，主要是其發(fā)病機理復雜，除了衰老這一自然因素外，目前學者比較認可的AD主要發(fā)病機制有：氧化應激、神經炎癥、Aβ蛋白聚集、tau蛋白過度磷酸化、神經遞質紊亂以及線粒體結構功能異常和腸道菌群紊亂等［2］。目前臨床治療AD仍以促腦細胞代謝類藥物和改善膽堿神經傳遞類藥物為主［3］。雖可一定程度改善病情，但存在療程長、毒副作用大等缺點。中醫(yī)藥在多靶點治療上有獨特優(yōu)勢，對于阿爾茲海默癥的診治應逐漸受到重視。中醫(yī)認為，阿爾茨海默病屬于“健忘”、“呆病”的范疇，屬本虛標實之證，其中標實是指水蘊內停、濕聚生痰、痰濁阻竅、氣郁血瘀、心肝火盛等，本虛是指髓海不足，肝脾腎五臟皆虛，氣血虧損無力上行不能上榮于腦竅，瘀閉清竅，最終導致阿爾茨海默病的發(fā)生［4］。中醫(yī)治療阿爾茨海默病強調標本同治，臨床治療大致可分為四類，即化痰開竅類、活血化瘀類、瀉火解毒類、疏肝理氣類。

瓜子金（Polygala japonicaHoutt）又名瓜子草、來麻回、散血丹、小遠志、金鎖匙、地藤草等。在東漢時期《神農本草經》中就有記載，主咳逆，傷中，補不足，除邪氣，利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強志倍力。久服，輕身不老。藥材瓜子金為2015年版《中國藥典》一部收載用藥，是遠志科（Polygalaceae）遠志屬（pclygala）植物瓜子金的干燥全草，該藥性溫，味苦，因其作用廣、副作用小，臨床使用廣泛，目前臨床多用于治療骨髓炎、關節(jié)炎、瘧疾、月經不調、神經衰弱、失眠癥、上呼吸道感染等療效顯著［5］。近年來通過對瓜子金的主要化學成分的研究發(fā)現，其包含的主要成分有皂苷類、山酮類、寡糖酯類、生物堿類、多糖類、黃酮類［6］等，這些成分可通過改善膽堿能系統(tǒng)功能、抗炎、抗氧化、抗抑郁、清除自由基、保護神經元等多途徑對神經系統(tǒng)產生廣泛的藥理作用，尤其是對阿爾茨海默病，可以控制神經炎癥的發(fā)生發(fā)展，改善學習、記憶功能減退等。本文綜述了瓜子金通過多通路多靶點治療阿爾茲海默癥的作用機制和研究進展，為神經退行性疾病多靶點、多組合的診斷治療提供參考。

1 瓜子金在CNS中抗氧化性

1.1 抗氧化應激和清除氧自由基 氧化應激不僅是腦損傷的重要機制，同時更是AD的主要病因之一，其在肌體的學習記憶障礙中起著很重要的作用。正常腦組織一般需氧量就比較高，在肌體不斷衰老的過程中，對外界氧化應激刺激敏感性會不斷提高，尤其如果合并腦血管疾病，在腦缺血后血流重建時氧化應激損害會尤為明顯。因為隨著肌體需氧量的升高，會產生較多的氧自由基。自由基在腦組織中不斷堆積，加之腦組織缺及時有效的清除方法，會導致神經元及神經干細胞遭到嚴重損傷，最終引起學習記憶障礙等一系列問題。傅晶［7］發(fā)現，從瓜子金的根部分離出多種黃酮類化合物，都具有抗氧化活性。其中瓜子金根經95%乙醇回流提取后，篩選出氯仿、乙酸乙酯-丙酮（1∶1）、乙酸乙酯-丙酮（1∶3）和丙酮4個洗脫部分，都具有較好改善小鼠學習記憶障礙的作用。其中部分在體外抑制H2O2氧化酚紅試驗中，顯示較強活性。瓜子金根粗提物的體外抑制H2O2氧化酚紅試驗，在8個樣品部位清除自由基模型中，抑制率平均達到80%以上。同時又一項研究發(fā)現，瓜子金皂苷己（Polygalasaponin F，PGSF）對H2O2氧化應激損傷的神經細胞同樣也具有較強的保護作用［8］。石瑞麗等［9］研究發(fā)現，PGSF對大鼠原代皮層神經細胞和PC12細胞具有保護作用，其作用機制仍與PGSF可調節(jié)凋亡相關蛋白的表達以及抗氧化應激功能有關。同時，瓜子金的乙酸乙酯部位和由此得到地單體化合物-瓜子金皂苷XXV，同樣也在氧化應激模型試驗中，被證明對PC12細胞具有較強的保護作用［10］。

1.2 抗細胞凋亡 細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，這其實是細胞接受某種信號或受到某種刺激后，經過一系列內部機制，而主動發(fā)生細胞死亡的過程，其中caspase-3是作為細胞凋亡的重要執(zhí)行蛋白之一。吳苗苗等［11］發(fā)現，PC12細胞被魚藤酮損傷后，細胞中caspase-3的活性顯著升高，而PGSF能夠濃度依賴性地降低PC12細胞中caspase-3的活性，同時顯著增加CREB的表達，減少魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡數量。石瑞麗等［12］通過建立體外氧糖剝奪/復供模型，研究PGSF對缺血再灌注細胞的影響。結果與正常對照組相比，OGD/R模型組可使PC12細胞的凋亡/壞死率增高，凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax的比值明顯降低，而分別加入PGSF（10.00、1.00和0.10μmol/L）的治療組，可使細胞晚期凋亡/壞死率由模型組原來的28.24%下降至10.07%、10.42%和16.74%，而對凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax的比值，則使其回升至模型組的2.6倍、2.4倍和2.3倍。通過試驗不難發(fā)現，PGSF對缺血再灌注損傷引起的PC12細胞的凋亡具有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性，不僅可明顯改善細胞形態(tài)，同時可降低細胞受損和凋亡百分率，抑制MMP水平的降低，增加Bcl-2／Bax表達比值等。由此可見，PGSF可以通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達，抑制神經元的凋亡和促進細胞的修復，發(fā)揮神經保護的作用。

1.3 抗神經毒性，穩(wěn)定線粒體正常膜電位 線粒體的膜電位的正常分布以及在體內的動力學平衡，直接影響到神經細胞的突觸形態(tài)與功能維持以及神經元的能量代謝平衡。如果神經毒性物質干擾線粒體的正常膜電位，會引發(fā)活性氧釋放增多，從而導致神經元損傷。ROS對神經的損害主要從兩個方面，一方面其會損壞膜蛋白，造成Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，最終導致神經元凋亡或死亡。另一方面其會釋放大量的自由脂酸，使得PGE2途徑活化以及Tau蛋白的異常聚合，從而造成神經元的死亡［13］。而越來越多研究表明，線粒體動力學失衡是阿爾茲海默綜合征早期病理進程中的關鍵事件之一。

吳苗苗等［11］研究顯示，在MPP+誘導的PC12細胞凋亡試驗中，經MPP+處理后模型組凋亡率在54.81%，經過PGSF（0.10、1.00、10.00μmol/L）濃度給藥后，PGSF治療組的早期凋亡率呈劑量依賴性降低，分別為39.04%、33.43%和29.73%，這表明試驗濃度的PGSF能在一定程度上，抑制MPP+誘導細胞發(fā)生早期凋亡，使活細胞的比例增加，保護PC12細胞，維持線粒體正常膜電位，穩(wěn)定線粒體功能。同時發(fā)現MPP+作用于PC12細胞后，Caspase-3激活率增加，同時給予PGSF后，發(fā)現PGSF可以抑制Caspase-3的激活，有明顯的量效關系。在熒光顯微鏡下觀察可見，經MPP+處理后，紅色熒光強度減弱，綠色熒光增強，線粒體受損，細胞線粒體膜電位降低，而加入不同濃度的PGSF，紅色熒光逐漸增強，綠色熒光減弱，PGSF能夠濃度依賴性抑制線粒體膜電位降低。這說明PGSF可以有效減少MPP+誘導PC12細胞的凋亡數量，機制與其可以維持線粒體功能，抑制Caspase-3的激活有關。

Aβ神經元毒性介導的神經細胞線粒體功能障礙是影響AD發(fā)病的重要原因之一，Aβ由淀粉樣前體蛋白（APP）經BACE1與γ-分泌酶切割形成，APP在BACE1作用下產生sAPPβ和C99，C99在γ-分泌酶作用下生成Aβ，其中BACE1對Aβ的生成起關鍵作用，是Aβ生成的限速酶。高衛(wèi)真等［14］在小鼠的抗淀粉樣蛋白損傷的研究中發(fā)現，在Morris水迷宮定位航行試驗中，Aβ模型組與空白對照組對比，小鼠尋找平臺的時間顯著長于對照組，在目標象限的游泳時間則明顯低于對照組，空間學習記憶明顯受到損害。而PGSF（20 mg/kg）劑量組及多萘哌齊組和石杉堿甲組的游泳時間與模型組相比，小鼠的潛伏期則顯著縮短，目標象限的游泳時間顯著延長。這說明高劑量PGSF（20 mg/kg）對小鼠的學習記憶障礙的改善具有明顯作用。同時，在細胞試驗中，與模型組相比，PGSF（0.1～10μmol/L）治療組的24 h細胞存活率顯著性增加，且具有明顯的劑量依賴性?；钚匝鯔z測，可以明顯看出PGSF（1μmol/L）與模型組相比，治療組細胞的綠色熒光顯著減弱，ROS的水平顯著下降，表明PGSF能明顯抑制和改善Aβ引起的細胞內ROS的堆積。同時PGSF能夠顯著逆轉模型組腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）的蛋白水平，以及受體酪氨酸激酶和GSK3 216位磷酸化水平的降低，BDNF表達的上調，同時PGSF可促進p-TrkB的磷酸化，促進其信號傳導，進而反饋激活BDNF/TrkB/MAPK級聯通路。由此可見，PGSF能夠減輕Aβ對神經細胞的損傷，穩(wěn)定線粒體功能，從而改善學習記憶。

2 改善學習記憶障礙

在李廷釗［15］的研究中發(fā)現，瓜子金皂苷XXI、瓜子金皂苷V及瓜子金皂苷庚都能逆轉髓磷脂的抑制活性，顯著地促進神經元細胞的分化和突起的生長，是瓜子金改善學習記憶功能的途徑之一。張衛(wèi)東等［16］證明所分離得到的瓜子金皂苷類化合物及苷元，總皂苷及總皂苷元對東莨菪堿誘導的小鼠記憶損傷均有明顯的改善作用；張東明等［17］證明瓜子金根提取物有較好的改善小鼠學習記憶障礙的作用；PGSF可促進海馬齒狀回突觸傳遞，這可能是瓜子金改善AD認知功能障礙的又一個重要的作用機制。孫鳳等［18］在分子水平上通過電生理實驗，以及對大鼠的海馬組織內的信號蛋白檢測，發(fā)現PGSF能夠激活與LTP的誘導和維持密切相關的NR2B、CaMKⅡ、ERK、CREB等分子，可通過激活NMDA受體，促進麻醉大鼠海馬齒狀回突觸傳遞，增強突觸可塑性。

BDNF是神經營養(yǎng)因子，是一類對神經有特異性的蛋白質，BDNF具有促進和維持神經細胞分化、生長、存活的作用，在改善認知功能方面有重要作用。有研究表明Tau蛋白的活化及Aβ含量的增加會分別抑制BDNF的表達和BDNF在海馬神經元中的膜泡運輸。瓜子金提取物能明顯改善D-半乳糖所致癡呆模型小鼠的學習記憶能力；明顯升高小鼠海馬組織BDNF含量［19］。以上這些都證實了瓜子金是具有治療AD潛能的重要化合物，可以通過促進神經元細胞的分化、突起的生長以及增強海馬齒狀回突觸傳遞與突觸可塑性，減輕細胞損傷等方面，改善AD小鼠的學習認知功能障礙。

3 瓜子金在CNS中抑制神經炎癥作用

神經炎癥是AD發(fā)病的重要原因之一，近年來，隨著研究的深入，發(fā)現在大腦中出現較典型的β-淀粉樣蛋白沉積改變的老年人，在實際臨床中反而并不會出現失智癥狀，因此有越來越多的人又將研究的重點放在中樞神經系統(tǒng)的炎癥上，尋求突破。小膠質細胞與神經退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其不僅是神經炎癥損傷的標志，更是多種神經退行性疾病的治療靶標[20-21］。在疾病的整個過程中，小膠質細胞的功能調節(jié)對疾病的預后有十分重要的影響。石瑞麗等［22］通過建立LPS誘導的BV-2小膠質細胞神經炎癥模型，與LPS模型組相比，發(fā)現PGSF治療組可以顯著提高PC12細胞存活率，同時可以抑制小膠質細胞的激活，從而抑制炎癥因子對神經細胞的損傷。趙清超等［23］通過采用體外炎癥模型研究瓜子金有效部位群抗炎作用機制，研究發(fā)現瓜子金有效部位群能顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞NO，IL-6及TNF-ɑ的釋放，控制炎癥的發(fā)生。龍倩等［24］發(fā)現與模型組相比，PGSF可以有效抑制LPS誘導BV-2細胞炎癥反應，減少炎性因子IL-1β的釋放量，下調NLRP3炎性小體、抑制caspase-11的激活等。目前，比較少PGSF抗神經炎的體內研究試驗。

4 影響脂代謝，改善腦血流量

中藥瓜子金在2015年版《中國藥典》中，屬于37味平性活血化瘀中藥之一，而血瘀與阿爾茲海默病的發(fā)生密切相關。正常人隨著年齡增加，血液外周微循環(huán)和血液流變性都會產生改變，血液凝固性會增高，會誘發(fā)血小板聚集、血栓形成，從而激活炎癥反應，謝紀文等［25］通過長期大量的老年病例的總結分析發(fā)現，血凝是導致中樞神經系統(tǒng)發(fā)病的重要機制。尤其是在老年AD患者中，腦動脈微栓子的出現，會對神經損傷產生疊加作用，使得臨床癥狀加重［26］，這也是中醫(yī)常說的血不上行，瘀閉清竅。同時，脂質代謝的紊亂也是引起神經病變的重要因素，與其發(fā)生和發(fā)展有緊密聯系，脂質代謝有可能是炎癥發(fā)生與發(fā)展中的重要載體。

瓜子金參與脂質和脂蛋白代謝、細胞增殖和分化的基因表達和炎癥的調節(jié)，具有多種生物功能，在一定程度上可通過抑制NF-kB的核移位和激活IkBɑ的下調，抑制TNF-ɑ對PI3K/Akt通路的激活，從而減弱炎癥的發(fā)生和發(fā)展，影響脂質的代謝。董晶晶等［27］通過在體外肝細胞LO2實驗中發(fā)現，瓜子金通過作用于SREBP-2/HMG-COA/LXRa通路，降低細胞中HMG-COA還原酶蛋白及SREBP-2的表達，影響細胞的脂代謝，調節(jié)體內膽固醇和甘油三酯合成與釋放。

5 其他

多項臨床試驗證明，瓜子金有疏肝理氣的功效，不僅可以緩解小鼠抑郁樣行為，同時可顯著影響其記憶和學習能力。在體外實驗中，與模型組相比，瓜子金水提物治療組能顯著降低小鼠海馬DG區(qū)Cleaved Caspase-3的表達水平，抑制細胞凋亡、促進BDNF的表達，促進其產生抗抑郁的效應［28］，之前的研究顯示瓜子金正丁醇部位的化學成分不僅具有較強的抗炎作用同樣也具有顯著抗抑郁活性［29］。禤璇等［30］使用Aβ1-40結合束縛法建立肝郁證AD大鼠模型，通過改善模型動物的抑郁狀態(tài)，發(fā)現可以顯著影響其記憶和學習能力，這同樣也證實疏肝解郁法在治療AD肝郁證型中的有效性。

在人口老齡化日趨嚴重的背景下，AD患者地逐年增加已成為必然趨勢，在針對AD缺乏有效地治療手段的情況下，過于龐大的患者基數的背后，必將是更加沉重的社會經濟負擔。因此，該病的防治更應引起各界更多的關注和重視。瓜子金對AD的治療是多靶點、多信號通路、多藥理作用的，其涉及肌體的多個系統(tǒng)，符合中藥藥理譜云學說：即“點（多靶點）-線（多信號通路）-面（藥理作用譜）-體（復雜易變的藥效云）”。但是，關于AD的具體的發(fā)病機制尚未完全闡明，且中藥瓜子金在抗AD的靶點治療上臨床試驗甚少，沒有具體的試驗可以驗證瓜子金對治療人類中樞神經系統(tǒng)疾病是否同樣有效。人類的AD病變是一個較為長期的病理過程。而動物實驗則多是模擬AD的發(fā)病誘因，由基因突變或是用蛋白短暫誘導形成的，因此，瓜子金抗AD的研究不僅需要更多的動物模型證據，而且需要大范圍長期臨床試驗來探索。瓜子金因其在對AD的預防治療中顯露出較好地臨床價值與應用前景，以及在我國南方較為豐富的儲備資源，進一步研究其對AD的預防改善作用機制，加速中藥臨床應用轉化將更有意義。深入研究以期將來瓜子金對于神經退行性疾病多靶點、多組合的診斷治療有更多地啟發(fā)意義。