外泌體靶向給藥系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀

張靖悅，李 云，楊 翀

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300350）

外泌體（exosome）是一種直徑在30～150 nm范圍內(nèi)的細(xì)胞外囊泡，可有效避免單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，自由穿過血管壁和細(xì)胞外基質(zhì)，在生理和病理?xiàng)l件下幾乎可以由所有細(xì)胞類型分泌，被認(rèn)為是優(yōu)良的藥物傳遞載體［1］。與體外合成的脂質(zhì)體和其他納米遞送系統(tǒng)相比，外泌體來源于人體，所攜帶的蛋白質(zhì)、miRNA或mRNA等多種成分使其具有介導(dǎo)細(xì)胞間通信和相互作用的獨(dú)特性［2］。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是外泌體與靶組織之間信息交流的主要方式之一，優(yōu)化外泌體的內(nèi)吞過程，促進(jìn)包封藥物的內(nèi)化，有利于血液中內(nèi)容物的持續(xù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)運(yùn)，提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率。此外，外泌體的膜有多種具有特定功能的膜蛋白，具有很強(qiáng)的靶向性和穿透生物屏障的能力，是非常有前景的靶向載藥系統(tǒng)，可用于遞送基因藥物、化學(xué)藥物、中藥成分等。然而，天然外泌體可能存在靶向性弱、易在體內(nèi)快速清除等問題，導(dǎo)致治療效果不佳，因此常將天然外泌體修飾形成工程外泌體，提高靶向性和穩(wěn)定性。本文將從外泌體分類、制備、儲存、載藥類型、載藥方式和表面修飾的角度解釋外泌體靶向給藥系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀。

1 外泌體分類

外泌體根據(jù)是否經(jīng)過人工修飾分為天然外泌體和工程外泌體。天然外泌體分為動物源性外泌體和植物源性外泌體。由于外泌體是在正常和腫瘤條件下產(chǎn)生的，因此動物源性外泌體可進(jìn)一步分為正常外泌體和腫瘤外泌體。

幾乎所有類型的正常細(xì)胞都可以產(chǎn)生外泌體，如間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）、巨噬細(xì)胞、星狀細(xì)胞（stellate cells，SC）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞等［3］。MSC是能夠自我更新和多向分化的多能干細(xì)胞，不僅能適應(yīng)腫瘤微環(huán)境，還具有強(qiáng)大的旁分泌活性，能分泌大量外泌體。研究表明［4］，載紫杉醇（paclitaxel,PTX）的外泌體在體外對人胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1的增殖具有顯著的抑制作用，具有作為藥物載體的潛力。巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞，在炎癥、免疫調(diào)節(jié)、傷口愈合和血管生成中發(fā)揮作用。通常巨噬細(xì)胞在體內(nèi)分布廣泛，可極化為M1或M2巨噬細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)［5］，巨噬細(xì)胞來源的外泌體可以通過影響炎癥信號和免疫功能來影響肺組織微環(huán)境。此外，Exo-PTX在Lewis肺癌轉(zhuǎn)移模型中具有顯著的抗腫瘤作用。通過呼吸途徑傳遞的巨噬細(xì)胞來源的外泌體幾乎完全與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移共同定位，這表明巨噬細(xì)胞來源的外泌體可能具有特定的表面蛋白，并傾向于優(yōu)先在癌細(xì)胞中積累，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究［6］。外泌體能夠從親本細(xì)胞中繼承許多特定的生物分子，這是其異質(zhì)性的原因之一。不僅如此，不同來源的外泌體在產(chǎn)量、含量、功能、載藥量方面也存在一定差異，可能產(chǎn)生不同的治療效果。Kanchanapally等［7］使用共孵育成功將阿霉素加載到胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSC）、胰腺癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞衍生的外泌體上。相比之下，PSCs來源的外泌體產(chǎn)量最高，載藥率高，而巨噬細(xì)胞來源的外泌體抗腫瘤活性最強(qiáng)，表明不同來源的外泌體具有特異性。此外，上述正常外泌體可以廣泛存在于生物體液中，例如唾液、血漿、尿液、腹水、牛奶和膽汁。目前，乳源性外泌體已成功用于遞送化療藥物－PTX，其生物利用度、穩(wěn)定性、安全性和毒性均已通過測試符合標(biāo)準(zhǔn)［8］。

腫瘤細(xì)胞可以分泌大量外泌體，其表面的特異性抗原可以反映供體細(xì)胞的性質(zhì)。因此，腫瘤外泌體在癌癥研究中備受關(guān)注。腫瘤外泌體不僅在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，而且還監(jiān)測疾病的發(fā)展并作為疾病的診斷標(biāo)志物。Wu等［9］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CAPS1的結(jié)直腸癌細(xì)胞來源的外泌體可以增強(qiáng)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞的遷移。因此，抑制腫瘤外泌體的分泌是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的治療選擇。

此外，食品來源的外泌體也具有良好的發(fā)展前景。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物來源的外泌體樣納米微粒（exosome-like nanoparticles,ELN）具有與哺乳動物外泌體相似的結(jié)構(gòu)。生姜來源的微粒可以預(yù)防肝臟相關(guān)疾病的發(fā)展，葡萄、胡蘿卜、柚子和生姜來源的ELN具有抗炎作用，可以維持腸道穩(wěn)態(tài)［10］。

2 外泌體制備

隨著外泌體研究的深入，其潛在應(yīng)用價值不斷被挖掘。外泌體的可重復(fù)分離和富集有助于評估其生物學(xué)功能。然而，由于外泌體在大小、內(nèi)容、功能和來源方面存在差異性，使得分離變得困難［11］。而且目前大多數(shù)分離技術(shù)無法將外泌體與具有相似生物特性的脂蛋白和來自非內(nèi)體途徑的細(xì)胞外囊泡完全分離，導(dǎo)致外泌體純度較低。因此，如何高效富集外泌體是當(dāng)前的重要課題，對于外泌體的下游分析至關(guān)重要。針對不同的目的和應(yīng)用，選擇不同的分離方法，其中最常用的方法包括超速離心技術(shù)、基于尺寸的分離技術(shù)、聚合物沉淀技術(shù)、免疫親和色譜技術(shù)。

2.1 超速離心技術(shù) 超速離心（ultracentrifugation,UC）是目前應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)，也被稱為外泌體提取和分離的金標(biāo)準(zhǔn)。UC主要根據(jù)原溶液中各組分的大小和密度差異來獲得所需組分，因此適用于沉降系數(shù)差異顯著的大劑量樣品組分的分離。UC主要分為兩步：首先是連續(xù)多次的低中速離心去除死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大尺寸的細(xì)胞外囊泡，然后以100 000×g的離心力分離外泌體，并用磷酸緩沖鹽溶液洗滌外泌體以去除雜質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)離心時間、離心力、轉(zhuǎn)子類型以及參數(shù)都會影響目標(biāo)外泌體的產(chǎn)量和純度［12］。該方法不需要標(biāo)記外泌體，可以避免交叉污染，但其耗時長、成本高、并且容易造成結(jié)構(gòu)破壞、聚集成塊、脂蛋白共分離，不利于下游分析［13］。

2.2 基于尺寸的分離技術(shù) 基于尺寸的分離技術(shù)主要是指超濾和尺寸排阻色譜（size-exclusion chromatography,SEC），根據(jù)外泌體與生物樣品中其他成分的大小差異進(jìn)行分離。超濾方法通常使用不同孔徑的超濾膜來選擇性分離樣品，在外泌體研究中經(jīng)常起到輔助分離的作用。超濾法通常采用超濾管分離外泌體，其成本低，富集效率高，且不影響外泌體的活性。然而，外泌體和超濾膜存在純度低和非特異性結(jié)合降低回收率的問題，使超濾法的使用受到限制。SEC的分離原理是大分子不能進(jìn)入凝膠孔，其與流動相沿著多孔凝膠之間的間隙被洗脫，而小分子留在凝膠孔中并最終被洗脫通過流動相。目前，基于SEC原理的qEV分離柱、EVSecond純化柱、Exo-spin外泌體純化柱已上市。SEC的應(yīng)用快速、簡單且成本低。分離出來的外泌體結(jié)構(gòu)完整、大小均勻，對其生物學(xué)特性沒有明顯的不利影響，但可能摻雜了其他類似大小的微粒，導(dǎo)致純度降低［14］。

2.3 聚合物沉淀技術(shù) 聚合物沉淀技術(shù)通常以聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）為介質(zhì)，通過降低外泌體的溶解度，在離心條件下收獲外泌體。這種方法最初是用來分離病毒的。由于外泌體和病毒具有相似的生物物理特性，因此在科學(xué)研究中經(jīng)常使用這種方法來分離和純化外泌體。Rider等［15］比較了超速離心、改性聚合物共沉淀（modified polymer co-precipitation,ExtraPEG）和市售商品試劑盒3種技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前兩種方法優(yōu)于市售商品試劑盒，且ExtraPEG更具成本效益，在純度和回收率方面均優(yōu)于超速離心。ExtraPEG操作相對簡單，分析時間短，適合處理大劑量樣品，但純度和回收率較低，容易產(chǎn)生假陽性，產(chǎn)生的聚合物難以去除，不利于后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)分析。

2.4 免疫親和色譜技術(shù) 免疫親和色譜（polymer precipitation，IAC）是一種基于抗體和配體特異性結(jié)合的分離純化技術(shù)，可將所需物質(zhì)從混合物中分離出來。結(jié)合效率與生物親和力、洗脫條件和基質(zhì)載體密切相關(guān)。原則上，該方法應(yīng)用的生物標(biāo)志物（抗原）應(yīng)是外泌體膜表面的高豐度蛋白，如四跨膜蛋白超家族、內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體相關(guān)蛋白等。靶蛋白可以是外泌體表面的一種常見成分，也可以是促進(jìn)IAC識別特定細(xì)胞來源外泌體的特殊成分。與超速離心相比，IAC可以用更少的樣品體積產(chǎn)生相似的結(jié)果［16］。此外，IAC還可以用于外泌體的定性和定量測定。例如，基于微孔板的酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)用于富集血清、血漿和尿液等體液中的外泌體，定量檢測分析發(fā)現(xiàn)，該方法收獲的外泌體產(chǎn)量與超速離心相當(dāng)，但對樣品的需求量要更小，從400μl血漿中提取的RNA量與2.5 ml樣品超速離心得到的量相同，因此相比超速離心具有一定優(yōu)勢［17］。然而，免疫親和層析獲得的外泌體的儲存條件相對苛刻，不適合大規(guī)模分離外泌體，基質(zhì)的非特異性吸附會產(chǎn)生干擾蛋白，使該方法難以推廣。

3 外泌體儲存

外泌體是一種無細(xì)胞療法，但其難以長期儲存。因此，有必要研究外泌體的保存技術(shù)，以保護(hù)其生物學(xué)活性，方便運(yùn)輸和臨床應(yīng)用。目前，應(yīng)用的儲存技術(shù)主要有冷凍保存、冷凍干燥和噴霧干燥。

3.1 冷凍保存 冷凍保存是一種將溫度降低到生化反應(yīng)所需溫度以下以維持生物微粒功能穩(wěn)定性的儲存方法，通常在4、-80和-196℃的溫度下應(yīng)用。但是這種保存方式容易出現(xiàn)“凍傷”。這里所說的“凍傷”，主要與冷凍過程中滲透作用不平衡以及生物微粒內(nèi)部形成冰晶有關(guān)。為了克服這一不足，通常有選擇地添加一種或多種適當(dāng)濃度的防凍液以延長保質(zhì)期［18］。

防凍液通常分為滲透性和非滲透性兩種。其中，滲透性防凍液分子量小，能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，防止冰晶的形成，如二甲基亞砜、乙二醇等。從形態(tài)學(xué)角度講，直接冷凍會影響外泌體膜的穩(wěn)定性并促進(jìn)其降解，而在冷凍保存中添加二甲基亞砜的外泌體則可保持與新鮮外泌體相似。非滲透性防凍液可以與水形成氫鍵，主要包括海藻糖、蔗糖和其他碳水化合物。糖的玻璃基質(zhì)可以防止囊泡聚集，減少冰晶造成的傷害?？紤]到穩(wěn)定性，雙糖防凍液是外泌體的最佳選擇，其中海藻糖被列為最有效的雙糖防凍劑［19］。但使用前應(yīng)檢查防凍液的濃度，使其保持適當(dāng)?shù)臐舛?，以維持平衡狀態(tài)，防止不必要的損失。

3.2 冷凍干燥 冷凍干燥是將含有水分的物料預(yù)先冷卻到冰點(diǎn)以下凍結(jié)成固體，在真空下直接使冰升華并以水蒸氣的形式除去，從而滿足儲存要求的技術(shù)。冷凍干燥技術(shù)主要分為三個階段：預(yù)冷凍階段、升華干燥階段和分析干燥階段。在低溫、真空條件下完成脫水干燥，可以保持原有的活性，減少對生物組織和細(xì)胞體的損傷。而在冷凍干燥過程中產(chǎn)生的冷凍和脫水壓力，可能會造成生物分子的分子結(jié)構(gòu)被破壞。因此，還需要選擇性地添加防凍液來保護(hù)生物材料。Charoenviriyakul等［20］將B16BL6黑色素瘤的外泌體分成三份，一份直接保存在-80℃，一份加入海藻糖凍干，一份直接凍干，并比較了外泌體的形態(tài)、蛋白質(zhì)含量以及藥代動力學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海藻糖的加入可有效防止凍干過程中外泌體的聚集，增加穩(wěn)定性，且不會改變外泌體的形態(tài)。而且室溫保存的凍干外泌體的蛋白含量與-80℃相似，對藥代動力學(xué)的影響很小。

3.3 噴霧干燥 噴霧干燥是一種系統(tǒng)地應(yīng)用于材料干燥的技術(shù)。外泌體溶液在干燥室霧化后，水分與熱空氣接觸后迅速蒸發(fā)，得到干粉。在此過程中，霧化壓力和出口溫度是影響外泌體穩(wěn)定性的主要因素。與凍干相比，噴霧干燥是一個連續(xù)的過程，可以實(shí)現(xiàn)一步粉碎，并且可以調(diào)節(jié)干粉的粒度，更經(jīng)濟(jì)［21］。

4 載藥類型

4.1 化學(xué)藥物 長久以來，癌癥的病死率居高不下，開發(fā)高效的癌癥治療策略一直是研究熱點(diǎn)?；瘜W(xué)藥物通過外泌體載藥可以在癌癥、炎癥等多種病理過程中發(fā)揮作用。阿霉素，一種兩性藥物，可以抑制微管生成，控制腫瘤生長，屬于廣譜抗腫瘤藥物。Yang T等［22］使用斑馬魚模型來檢查腦內(nèi)皮衍生的外泌體通過血腦屏障遞送阿霉素的功效，圖像結(jié)果顯示，外泌體成功將阿霉素負(fù)載通過血腦屏障，并且腫瘤抑制作用明顯。此外，卟啉、替拉扎明、多西紫杉醇和順鉑等抗癌藥物也可以通過外泌體發(fā)揮作用［23-24］。

過氧化氫酶（catalase，CAT）是最有效的抗氧化劑之一，可以有效抑制炎癥，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，用于治療神經(jīng)退行性疾病。在研究CAT對帕金森病的治療效果時，Haney M J等［25］發(fā)現(xiàn)，采用外泌體包裹CAT不僅可以保持生物活性，增強(qiáng)穩(wěn)定性，降低免疫原性，延長血液循環(huán)時間，而且還可以有效降低氧化應(yīng)激，提高帕金森病體內(nèi)和體外模型中神經(jīng)元的存活率?？傊?，Exo-CAT制劑有望成為治療神經(jīng)退行性疾病的通用策略。

4.2 中藥成分 中藥，包括單體活性成分和復(fù)方制劑，因其較低的毒副作用，已被廣泛用于外泌體遞送系統(tǒng)的研究。PTX對多種惡性腫瘤均具有良好的治療作用，但因其高度疏水性，生物利用低，且毒副作用呈劑量依賴性，限制了臨床應(yīng)用［8］。近年，使用外泌體遞送PTX的研究已被廣泛報(bào)道。Wang P等［26］選擇經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞衍生的外泌體作為載體遞送PTX，可以降低PTX的毒性并提高生物利用度。PTX不僅成功遞送至小鼠腫瘤組織，而且還通過激活NFκB通路建立促炎環(huán)境增強(qiáng)PTX的治療效果。姜黃素是一種親脂多酚化合物，溶解度低、穩(wěn)定性差、代謝快、半衰期短、生物利用度較低，難以在臨床廣泛使用。Sun D等［27］將姜黃素裝載到外泌體上形成復(fù)合物，通過提高姜黃素的溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度，使姜黃素的抗炎活性增強(qiáng)，并且這種復(fù)合物還可以抵抗小鼠脂多糖誘導(dǎo)的感染性休克。此外，關(guān)于外泌體裝載中藥成分增強(qiáng)療效、改善耐藥性的研究還有很多。例如，裝載花青素的外泌體對卵巢癌細(xì)胞的增殖具有良好的抑制活性，裝載梓醇的外泌體可以加強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用，外泌體裝載β-欖香烯不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，還可以改善耐藥性［28-29］。

5 載藥方式

根據(jù)治療藥物是否直接裝載在外泌體上，載藥類型主要分為兩類：分泌前載藥和分泌后載藥。分泌前藥物裝載是指治療藥物直接裝載在親代細(xì)胞上以分泌工程外泌體。此類操作簡單，但無法控制載藥效率，并可能破壞膜蛋白的天然生理功能。分泌后載藥是指將治療藥物以某種方式直接添加到外泌體中，但可能存在外泌體聚集、膜損傷和產(chǎn)率低等問題［24，30］。電穿孔和超聲波處理是最常用的載藥方法。而外泌體的載藥率可能與藥物的疏水性、載藥方法、外泌體的脂質(zhì)組成等有關(guān)［23］。因此，在實(shí)際研究中，主要根據(jù)藥物的理化特性選擇合適的載藥方法。

5.1 電穿孔 電穿孔是將外泌體和治療劑藥物的懸浮液暴露在電場中，外泌體膜在短暫的高壓脈沖下產(chǎn)生臨時孔，治療藥物將滲透到外泌體中。電穿孔是一種相對成熟的方法，簡單省時，可用于將核苷酸、阿霉素等藥物裝載到外泌體中［31］。外泌體濃度會影響電穿孔的效率。Wahlgren J等［32］使用來自外周血的外泌體作為載體通過電穿孔傳遞治療性siRNA，實(shí)驗(yàn)中研究了外泌體濃度、siRNA濃度和電穿孔參數(shù)對電穿孔效率的影響，發(fā)現(xiàn)siRNA和電容的變化不影響電穿孔效率，當(dāng)外泌體濃度在0.25～1 mg/ml范圍時，電穿孔效率最高。電穿孔載藥方法容易破壞膜結(jié)構(gòu)完整性、降低加載效率、加載速率低，并且使用高壓脈沖會導(dǎo)致外泌體聚集，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響外泌體活性。

5.2 共孵育 共孵育主要有兩種形式。一種是將治療藥物與親本細(xì)胞共孵育，通過親本細(xì)胞的內(nèi)吞作用將細(xì)胞質(zhì)中的部分治療藥物裝載到分泌的外泌體中。另一種是外泌體和治療藥物在適當(dāng)條件下直接混合共孵育。加載效率主要取決于溶液中藥物的濃度梯度及其疏水性。高濃度的疏水性藥物通常具有較高的負(fù)載效率［25］。該方法操作簡單，重現(xiàn)性強(qiáng)，不影響外泌體膜結(jié)構(gòu)的完整性，但加載效率低，需要大量治療劑。此外，還需要研究治療劑是否對親本細(xì)胞有毒副作用，并通過改變外泌體的表面電荷來影響穩(wěn)定性。

5.3 超聲波處理 超聲波處理載藥方法效率高，可以持續(xù)釋放藥物，尤其是疏水性藥物，可以防止蛋白酶的破壞。但這種方法可能會導(dǎo)致外泌體聚集，影響其免疫活性，不僅對儀器要求高，而且可能會破壞外泌體的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致藥物滲漏，使載藥量不理想。超聲處理可能會改變膜的高剛性，外泌體膜的重組導(dǎo)致高裝載效率和持續(xù)的藥物釋放。Kim M S等［6］比較了共孵育、電穿孔和超聲處理三種裝載方式的裝載率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲處理的外泌體裝載能力最高，證實(shí)了上述假設(shè)。同樣，Salarpour S等［33］關(guān)于37℃共孵育和超聲處理對疏水性藥物PTX包封率的影響進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲處理的負(fù)載量［（9.21±0.41）ng/μg］高于共孵育的負(fù)載量［（7.40±0.40）ng/μg］。

6 表面修飾

表面修飾是將外泌體表面蛋白作為錨定裝置或親和標(biāo)簽，將符合要求的蛋白質(zhì)或肽成分通過一定的手段修飾到顆粒表面的過程。天然外泌體如果由于穩(wěn)定性差、消除快等缺點(diǎn)而無法有效遞送藥物或靶向應(yīng)用，則需要進(jìn)行表面修飾［34］。外泌體的最大優(yōu)勢之一是內(nèi)源性，可以避免引起免疫反應(yīng)等不良表現(xiàn)。然而，外泌體遞送的效率受親代細(xì)胞和受體細(xì)胞的影響，不同來源的外泌體產(chǎn)量存在顯著差異，天然外泌體存在靶向性差的問題。為了滿足實(shí)驗(yàn)需要，通過表面修飾制造工程化外泌體是一種具有實(shí)際應(yīng)用價值的方式。對具有靶向配體的外泌體表面工程化可以幫助其選擇性遞送至靶細(xì)胞，使外泌體在產(chǎn)量和靶向治療方面達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，從而實(shí)現(xiàn)外泌體的精準(zhǔn)治療，加速外泌體的臨床應(yīng)用。

為了使治療藥物可以精確到靶向病灶，近年來常用的方法包括靶向肽的化學(xué)連接、基因工程修飾外泌體膜、磁性納米粒子技術(shù)、靜電相互作用和后插入。表面修飾的外泌體具有一定的優(yōu)勢，但也有一定的局限性。首先，外泌體的表面修飾不能改變外泌體的結(jié)構(gòu)和表面分子，而化學(xué)連接的靶向肽有可能改變外泌體的表面結(jié)構(gòu)。其次，轉(zhuǎn)基因親代細(xì)胞操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)染效率低，容易影響膜蛋白原有的生物活性。當(dāng)外泌體用病毒來源的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行修飾時，需要評估對自身是否有不良反應(yīng)。此外，用于靜電相互作用的陽離子納米材料可能會引起細(xì)胞毒性并且負(fù)載效率相對較低。

基于目前流行的表面修飾方法的局限性，尹教授團(tuán)隊(duì)［35］篩選出噬菌體CP05偶聯(lián)靶向分子（M12、RVG、SP94）形成嵌合肽，然后與外泌體表面的CD63結(jié)合，對外泌體進(jìn)行表面修飾。該方法不僅可以提高對外泌體的捕獲量，而且還可以增強(qiáng)靶向性，使修飾后的外泌體分別富集在肌肉、腦和皮下腫瘤中。CP05修飾的外泌體在生理特性上沒有明顯變化，沒有改變外泌體的結(jié)構(gòu)和表面分子，有望用于臨床癌癥的快速檢測和治療藥物的有效載體。此外，Tamura R等［36］利用陽離子化支鏈淀粉修飾外泌體，使其具有靶向肝細(xì)胞去唾液酸糖蛋白受體的能力，有助于實(shí)現(xiàn)外泌體的精準(zhǔn)治療，提高治療效果。Lee J等［24］還優(yōu)化了化學(xué)連接和靶向肽的方法，用疊氮化物-膜融合脂質(zhì)體（membrane-fused liposomes，MFL）處理親代細(xì)胞以產(chǎn)生疊氮化物-外泌體，然后通過生物正交反應(yīng)將其與腫瘤靶向肽偶聯(lián)物DBCO-CGKPK連接。這種工程化的外泌體可用于在內(nèi)部和外部的加載治療，并可進(jìn)行多種功能修改。用于表面修飾的MFL的外源性摻入不會影響在外泌體的生物學(xué)功能中起決定性作用的膜蛋白。

工程外泌體在藥物遞送應(yīng)用中并不具有絕對優(yōu)勢。有研究發(fā)現(xiàn)，用相同的加載方法加載膽固醇修飾的siRNA，分別制備工程化外泌體和陰離子融合脂質(zhì)體，比較其遞送能力，結(jié)果顯示，工程外泌體無法在功能上傳遞相關(guān)的siRNA，而陰離子融合脂質(zhì)體則可以誘導(dǎo)siRNA介導(dǎo)的靶基因敲除［37］。因此，在考慮是否應(yīng)用工程外泌體時，需要結(jié)合實(shí)際情況，深入了解分子轉(zhuǎn)移機(jī)制和特異性，選擇合適的遞送方式。

近年，在外泌體靶向給藥方面取得的突破引起了全世界研究人員的廣泛關(guān)注。越來越多的證據(jù)證明外泌體是可靠的藥物遞送系統(tǒng)。與脂質(zhì)體、納米顆粒、微球、微乳等合成載藥系統(tǒng)相比，外泌體載藥系統(tǒng)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢，包括降低免疫原性、增強(qiáng)組織滲透性、可變形的細(xì)胞骨架以及與細(xì)胞膜的相似性。然而，外泌體亦存在免疫抑制和逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生等相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，因此，對外泌體進(jìn)行修飾，探索安全有效的工程化外泌體是必經(jīng)的途徑。對于外泌體的靶向遞送，目前仍然缺乏對導(dǎo)致外泌體選擇性細(xì)胞攝取的決定因素和影響其細(xì)胞內(nèi)分布的因素的全面了解，未來仍需要廣泛的研究來優(yōu)化外泌體作為藥物遞送載體的靶向性。此外，還需要注意的是，外泌體載藥系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床產(chǎn)業(yè)化研究之間存在顯著性差異，實(shí)驗(yàn)室成果如何進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)換亦是研究難題。相信隨著工程外泌體的發(fā)展以及載藥輸運(yùn)機(jī)制的完善，外泌體載藥系統(tǒng)將在臨床上得到廣泛應(yīng)用。