補(bǔ)腎止痛膠囊定性定量方法研究

劉學(xué)杰，李俊強(qiáng)，牛家豐

（1.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 264000；2.棗莊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 277000）

補(bǔ)腎止痛膠囊是由鹿角膠、燙狗脊、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、桑葚、女貞子、醋乳香、醋沒(méi)藥、黃連、皂角刺共同組成的中藥復(fù)方制劑，是煙臺(tái)某中醫(yī)院根據(jù)中醫(yī)理論在大量臨床基礎(chǔ)上研制而成，具有補(bǔ)腎溫陽(yáng)、行氣止痛之功效，臨床上主要用于骨痹之陽(yáng)虛寒凝癥，如骨痛如折，遇寒加重等癥。處方中的君藥鹿角膠具有溫補(bǔ)肝腎，益精養(yǎng)血的功效［1］；補(bǔ)骨脂亦具有溫腎助陽(yáng)之功效［2］；醋乳香具有活血生肌，消腫生肌之功［3］；黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒之功［4］。對(duì)上述藥材進(jìn)行鑒別及含量測(cè)定能夠初步有效的對(duì)補(bǔ)腎止痛膠囊的質(zhì)量進(jìn)行控制，本文以期對(duì)此藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 1260）；色譜柱為Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）柱；電子天平（TB-215D，EL204）；KQ-300DE型數(shù)控超聲儀；硅膠板均購(gòu)自青島基億達(dá)硅膠試劑有限公司。

1.2 試藥 甘氨酸對(duì)照品（批號(hào)110735-200102）、補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材（批號(hào)121056-201605）、乳香對(duì)照藥材（批號(hào)120970-201305）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201212）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，補(bǔ) 腎 止 痛 膠 囊（批 號(hào)190901、190902、190903、190904、190905、190906、190907、190908、190909、190910）及各陰性樣品均由制劑室自制；乙腈為色譜純（Thermo Fisher）；水為超純水（Milipore制水機(jī)制備）。

2 薄層色譜鑒別

2.1 鹿角膠 取本品內(nèi)容物5 g，加鹽酸-水（1∶1）溶液20 ml，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)由倭考状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，吸取1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液［5］。按照處方比例和制法制成缺鹿藥材的陰性樣品，同法制成缺鹿角膠的陰性供試品溶液。另取甘氨酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取上述供試品及陰性供試品溶液各5μl、對(duì)照品溶液2μl，置于同一硅膠G薄層板（薄層板預(yù)飽和30 min），以正丁醇-冰醋酸-乙醇-水（4∶1∶1∶1）為展開(kāi)劑，噴以0.2%茚三酮試液在105℃加熱至斑點(diǎn)顏色清晰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 鹿角膠鑒別TLC圖譜

2.2 補(bǔ)骨脂 取本品內(nèi)容物5 g，加乙酸乙酯20 ml，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液［6］。按照處方比例和制法制成補(bǔ)骨脂藥材的陰性樣品，同法制成補(bǔ)骨脂的陰性供試品溶液。另取補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取上述供試品及陰性供試品溶液及對(duì)照品溶液各4μl，置于同一硅膠G薄層板（薄層板預(yù)飽和30 min），以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液置紫外燈365 nm下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂鑒別TLC圖譜

2.3 醋乳香 取本品內(nèi)容物6 g，加乙醇30 ml，超聲處理1 h，放冷，濾過(guò)，濾液濃縮至5 ml，作為供試品溶液［7］。按照處方比例和制法制成醋乳香藥材的陰性樣品，同法制成醋乳香的陰性供試品溶液。另取乳香對(duì)照藥材0.2 g，加乙醇20 ml，同法制成對(duì)照藥材溶液。取上述供試品及陰性供試品溶液各4μl、對(duì)照品溶液2μl，置于同一硅膠G薄層板（薄層板預(yù)飽和30 min），以石油醚（60～90℃）-環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（10∶30∶15∶1）為展開(kāi)劑，噴以5%香草醛硫酸溶液在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 醋乳香鑒別TLC圖譜

3 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈-0.4%磷酸（28∶72）為流動(dòng)相；進(jìn)樣量10μl，柱溫：30℃，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

3.2 溶液的制備

3.2.1 供試品溶液的制備 取本品約2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100）50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用鹽酸-甲醇（1∶100）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 ml，濃縮至近干，用鹽酸-甲醇（1∶100）適量使溶解并轉(zhuǎn)移至2 ml量瓶中，加鹽酸-甲醇（1∶100）至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得［6］。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品

適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml含90μg的溶液，即得。

3.2.3 缺黃連空白溶液的制備 按照處方比例取缺黃連之外的其他藥材，按照補(bǔ)腎止痛膠囊的制備工藝制備黃連陰性樣品，并按照“3.2.1”項(xiàng)下方法制成黃連陰性供試品溶液。

3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、供試品溶液與缺黃連陰性供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，在345 nm處測(cè)定。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液和供試品溶液在該波長(zhǎng)處均有最大吸收峰，而缺黃連陰性供試品溶液在該波長(zhǎng)處未見(jiàn)明顯色譜峰出現(xiàn)，表明本測(cè)定無(wú)明顯干擾，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4對(duì)照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）HPLC色譜圖

3.4 線性關(guān)系考查 分別精密吸取相當(dāng)鹽酸小檗堿對(duì)照品0.093、0.265、0.464、0.619、0.795和0.93μg的對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值。以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果進(jìn)樣量在0.093～0.930μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y=485.45X-184.68（r=0.999 2）。

3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液5μl，按上述色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果6次測(cè)定RSD為0.19%，表明精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5μl，按上述色譜條件測(cè)定，每隔2 h測(cè)定1次，共測(cè)定5次，其峰面積積分值在測(cè)定時(shí)間8 h內(nèi)基本不變，供試品5次測(cè)定的RSD為0.28%，表明穩(wěn)定性良好。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)為190901）6份，按“3.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果6次測(cè)定的平均含量為0.175mg/g，其RSD為1.92%，表明重復(fù)性良好。

3.8 回收率試驗(yàn) 取同批（批號(hào)為190901）已知含量的樣品約1 g，精密稱(chēng)定，共取6份，分別加入鹽酸小檗堿0.178 mg（準(zhǔn)確加入0.178 mg/ml的鹽酸小檗堿溶液1.0 ml），按供試品溶液制備的方法制成回收率各試驗(yàn)溶液，并按照上述測(cè)定方法進(jìn)樣10μl測(cè)定各樣品中鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.06%，RSD為0.69%。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.9 樣品的測(cè)定 取不同批號(hào)的樣品制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液5μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，共測(cè)定10批本制劑樣品的鹽酸小檗堿含量，結(jié)果平均含量為75μg/粒。見(jiàn)表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果

由表2可知，每粒膠囊中鹽酸小檗堿的含量范圍為63～91μg/粒，考慮到黃連藥材的質(zhì)量差異，按照平均含量60%定為每粒鹽酸小檗堿的最低含量，故規(guī)定每粒含黃連以鹽酸小檗堿（C20H17NO4·HCl）計(jì)，不得少于45μg。

4 討論

4.1 鹿角膠的鑒別 此次試驗(yàn)過(guò)程中，作者曾嘗試用《中國(guó)藥典》方法對(duì)鹿角膠進(jìn)行鑒別，但是操作過(guò)于繁瑣，故參考文獻(xiàn)中阿膠檢驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行鑒別，此方法操作簡(jiǎn)便，且重現(xiàn)性較好。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相的選擇 本文取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描（200～600 nm）發(fā)現(xiàn)橙皮苷在345.2 nm處有最大吸收，結(jié)合《中國(guó)藥典》黃連項(xiàng)下鹽酸小檗堿含量測(cè)定，故確定本文含量測(cè)定的波長(zhǎng)為345 nm。本文嘗試用黃連項(xiàng)下流動(dòng)相進(jìn)行流動(dòng)相乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 ml中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0），結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)干擾較多，小檗堿分離度未能達(dá)到要求，故選用本文流動(dòng)相。

4.3 含量測(cè)定提取條件的選擇

4.3.1 提取方式的選擇 本文比較了超聲和回流兩種不同的提取方式，兩種提取方式效果相近，但超聲操作更簡(jiǎn)便，故本文采用超聲提取方式。

4.3.2 提取時(shí)間的選擇 本文比較了超聲提取20、30和40 min的提取效率，結(jié)果30 min基本可以將鹽酸小檗堿提取完全，因此本文確定超聲提取的時(shí)間為30 min。

本文采取TLC法對(duì)處方中鹿角膠、補(bǔ)骨脂和醋乳香進(jìn)行了鑒別，用HPLC對(duì)處方黃連中的鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量測(cè)定，此方法基本能夠?qū)ρa(bǔ)腎止痛膠囊的質(zhì)量進(jìn)行控制，為制定此制劑的標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。