生物標(biāo)志物檢測中藥注射劑抑制血小板活化作用研究

華曉東，徐 琳，稅鳳春

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

中藥質(zhì)控研究，尤其是針對高風(fēng)險(xiǎn)的中藥注射劑，由于中藥成分復(fù)雜，理化檢測選擇的一些指標(biāo)成分并不一定就是其有效成分，因此可以建立一種直接與其臨床效應(yīng)相關(guān)的生物活性質(zhì)控方法來解決這一問題?；钛鲱愔兴幣R床功效和作用機(jī)制明確，適宜建立這樣一個(gè)簡單易行的生物活性測定質(zhì)量控制方法［1］，來更好地控制其臨床應(yīng)用的有效性和安全性。

CD62p是一種血小板活化依賴性的膜糖蛋白，是公認(rèn)的血小板活化的特異性生物標(biāo)志物［2-3］。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD62p來反映血小板活化情況，方法穩(wěn)定快捷，與活血化瘀藥物的臨床功效相關(guān)性好，并且適合進(jìn)行藥物的高通量篩選。本研究通過觀察幾種常用的活血化瘀中藥注射劑對血小板活化生物標(biāo)志物（CD62p）表達(dá)的抑制作用，以確定該方法用于評價(jià)藥物活血化瘀生物活性的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器及試劑 Attune NxT流式細(xì)胞儀（ThermoFisher SCIENTIFIC）。單克隆抗體（Anti-Mouse/Rat CD62p PE/Cy7（批號B223759）、Anti-Mouse/Rat CD61 PE，批號（B216420），Biolegend；Rat IgG2a-PE/Cy7（批號4290714）、Rat IgG-PE（批號4281135），eBioscience。ADP（批號SLBP6247V，SIGMA）；氯化鈉注射液（批號9B82J1，中國大冢制藥有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級，體重200～300 g，雌雄兼用。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0001。

1.3 供試品 舒血寧注射液（批號160118C1，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；喜炎平注射液（批號2016042403，江西青峰藥業(yè)有限公司）；痰熱清注射液（批號20150911，上海凱寶藥業(yè)股份有限公司）；血必凈注射液（批號1703141，天津紅日藥業(yè)股份有限公司）；注射用紅花黃色素（批號1601215，浙江永寧藥業(yè)股份有限公司）。以上樣品均由天津市藥品檢驗(yàn)研究院提供，臨用前分別按照各個(gè)供試品的臨床使用濃度，用氯化鈉注射液將其配制成所需濃度溶液備用，室溫保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，對藥物作用前后數(shù)據(jù)進(jìn)行配對資料t檢驗(yàn)。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 抗凝血的采集和分組 取SD大鼠8只，200～300g，雌雄各半。禁食16 h后每只動(dòng)物分別眼眶取血0.5ml，置于預(yù)置有3.8%枸櫞酸鈉抗凝（9∶1）的EP管中。將每只動(dòng)物采集的抗凝血分成3份，每份50μl，一份為空白血樣，一份為基礎(chǔ)血樣，一份為加藥血樣。

2.2 加藥血樣的處理和分析 取抗凝血50μl，加入適宜濃度供試品溶液50μl，輕輕搖勻，37℃作用5min，作為加藥血樣。各加入100μl濃度為20 UM的ADP激活，使得ADP的終濃度為10 UM，渦旋混勻1 s，反應(yīng)2 min。分別加入CD62p PE-Cy7和CD61 PE各2.0μl進(jìn)行抗體標(biāo)記，避光4℃孵育20 min。加4%多聚甲醛0.5 ml固定20 min。加入適量稀釋液后靜置2 min，溶液澄清后準(zhǔn)備上機(jī)分析。

采用488 nm氬離子激光，在以CD61-PE-H/SSC-H為坐標(biāo)的圖中，圈定血小板，收集5 000個(gè)血小板。在已確定的血小板細(xì)胞群中，以CD61-PE-H/CD62-PECY7-H為坐標(biāo)系劃分活化的（CD61、CD62p雙陽性）和未活化的血小板。以活化細(xì)胞占所有血小板細(xì)胞數(shù)的百分比來反映血小板的活化率并計(jì)算藥物的抑制率。見圖1。

圖1 CD61標(biāo)記的所有血小板細(xì)胞（A）和CD61標(biāo)記的血小板細(xì)胞中CD62p陽性表達(dá)的比例（B）

2.3 基礎(chǔ)血樣的制備 取抗凝血50μl，加入氯化鈉注射液50μl，同上制備基礎(chǔ)血樣。ADP激活后同法處理，記錄藥物作用前血小板活化率。

2.4 空白血樣的制備 另取抗凝血50μl，加入氯化鈉注射液50μl，輕輕搖勻，37℃作用5 min，作為空白血樣。除不加ADP外同法處理后上機(jī)分析，記錄空白血樣的血小板活化率?？瞻籽獦友“寤罨示鶓?yīng)小于1.5%，否則該動(dòng)物血樣不得用于檢測和結(jié)果判定。抑制率（%）

2.5 結(jié)果 具有活血化瘀作用的3種中藥注射劑以及銀杏達(dá)莫注射液都可明顯抑制ADP引起的血小板活化，而喜炎平注射液則無此作用。結(jié)果見表1。

表1 幾種中藥注射劑對血小板表面CD62p表達(dá)的抑制作用比較

3 討論

中藥成分復(fù)雜，理化檢測選擇的指標(biāo)性成分往往并非是主要有效成分，因此檢測結(jié)果與臨床功效也沒有密切的相關(guān)性?！吨袊幍洹?010年版中明確引入了中藥生物活性測定的指導(dǎo)原則，為解決中藥質(zhì)量控制中檢測指標(biāo)與臨床功效的相關(guān)性問題提供了一個(gè)思路。即可以通過選擇一種公認(rèn)的、特異性良好的生物標(biāo)記物作為檢測指標(biāo)來反映中藥在某一方面的生物活性，這種檢測方法與其臨床使用的效果有更好的相關(guān)性，更適合將該方法引入質(zhì)量控制中。

血小板活化依賴性膜糖蛋白CD62p因其只能在活化的血小板表面表達(dá)，因而被公認(rèn)為是血小板活化的特異性生物標(biāo)志物，已廣泛的應(yīng)用于與血小板功能相關(guān)的臨床研究中［4］。中醫(yī)血瘀證患者普遍存在血小板活化現(xiàn)象［5］，而活血化瘀類中藥的抗血小板活化作用是評價(jià)其臨床功效的重要指標(biāo)。其作用主要的表現(xiàn)就是抑制血小板的釋放反應(yīng)，進(jìn)而抑制了血小板上CD62p的表達(dá)。冠心病患者具有明顯的血瘀證癥狀，研究顯示這些患者均存在CD62p的高表達(dá)，而且其CD62p的表達(dá)程度與冠心病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［6-7］。因此患者用藥后療效的評估也可以通過檢測CD62p的表達(dá)來進(jìn)行監(jiān)測。

本研究采用CD62p作為生物標(biāo)志物，以流式法檢測血小板活化水平，進(jìn)而評價(jià)藥物的活血化瘀活性。具有活血化瘀作用的藥物可以明顯抑制ADP造成的血小板活化。血必凈注射液主要成分為紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸；注射用紅花黃色素的主要成分是紅花黃色素；舒血寧注射液主要成分是銀杏葉提取物，三者的功能主治中均具有活血化瘀作用。銀杏達(dá)莫注射液是由銀杏總黃酮和雙密達(dá)莫組成的復(fù)方制劑，其中雙密達(dá)莫具有明確的抑制血小板活化的作用，因此在本研究中被作為陽性對照品。而喜炎平注射液主要用于清熱解毒。在本研究中凡是功能主治中具有活血化瘀作用的中藥注射劑，以及含明確血小板活化抑制劑雙嘧達(dá)莫的中藥復(fù)方制劑，在采用FCM進(jìn)行的生物標(biāo)志物檢測中均表現(xiàn)為陽性結(jié)果，而在無此類作用的喜炎平注射液檢測中為陰性結(jié)果，表明該方法對于檢測藥物的血小板活化抑制作用有明確的適用性，可以用于評價(jià)中藥注射劑的活血化瘀活性。