骨髓間充質(zhì)干細胞治療卵巢早衰的研究進展

施嵐 吳曉瑜 鄧妙 張治芬*

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）又稱為原發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI），是指女性青春期后至40歲之前卵巢功能的減退，主要表現(xiàn)為血清高促性腺激素、低雌激素、月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、生育能力減退等［1］。目前，POF的具體發(fā)病機制仍不明確，針對其卵巢組織結(jié)構(gòu)受損、儲備功能減退尚無有效的恢復措施。研究認為，恢復POF患者的卵巢功能和提高生殖能力是治療的關鍵環(huán)節(jié)。已有研究證實，具有多向分化潛能和自我更新能力的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）及其分泌的多種細胞因子和外泌體在各種退行性病變中可發(fā)揮積極治療作用［2］。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）是當前組織器官修復工程和再生醫(yī)學最常用的干細胞來源，促進器官修復的潛力巨大，可能對受傷卵巢組織的結(jié)構(gòu)和生育能力的恢復具有重要作用，是臨床上治療POF的潛在方法［3］。本文通過對BM-MSCs的特性及其在提高卵巢儲備功能和生育能力方面的作用進行總結(jié)，對BM-MSCs治療POF的可能作用機制、出現(xiàn)的問題以及相應的解決方法進行了闡述。

1 BM-MSCs的生物學特性

MSC是一種具有較強增殖、修復潛能同時能夠分化成多種細胞系，且廣泛存在于各種組織的多能干細胞［4］。BMMSCs與其他體細胞來源的干細胞不同，既可以分化為相同中胚層來源的細胞系，也能夠分化成不同胚層起源的其他功能細胞系，能夠?qū)⑵鋪碓唇M織的造血環(huán)境轉(zhuǎn)移至異位部位并存活發(fā)揮作用，因此在臨床應用中具備巨大潛能［5］。研究表明，在化療誘導的POI大鼠模型卵巢內(nèi)移植BM-MSCs，可以有效恢復化療后POI大鼠的生育能力［6］。此外，BM-MSCs還具有基因表達譜，是組織工程和再生醫(yī)學的最佳干細胞來源［7］，可在體外分化成骨、軟骨、脂肪細胞等許多不同的組織細胞［8］。移植后的BM-MSCs能夠在某些因素的誘導下遷移至損傷組織部位中，進而分化為修復損傷組織所需的特定細胞類型，使得受損組織局部微環(huán)境得以重建，通過調(diào)節(jié)免疫反應參與損傷組織的修復，因此BM-MSCs移植對臨床治療POI具有重要意義［9］。

2 BM-MSCs改善卵巢功能

POF患者因卵巢儲備功能喪失繼而竇性卵泡和顆粒細胞活性降低導致雌激素水平缺乏，引發(fā)閉經(jīng)、月經(jīng)過少、潮熱盜汗、反復感染、情緒不穩(wěn)定等癥狀［9］，發(fā)生心血管疾病、癡呆、認知能力下降、帕金森病、青光眼、骨質(zhì)疏松癥等的風險增加，總死亡率升高［10］。BM-MSCs在多種因素作用下，直接遷移到損傷的組織中并存活，調(diào)節(jié)免疫反應，促進卵巢儲備功能的恢復［11］。動物實驗研究表明，POI大鼠模型靜脈注射BM-MSCs可遷移至卵巢受損的卵巢間質(zhì)并存活，改善模型大鼠的激素功能、促進卵泡生成、修復受損的卵巢組織結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)恢復POI大鼠模型卵巢儲備功能、改善生育結(jié)局的目標［12］。

3 BM-MSCs治療卵巢早衰的作用機制

3.1 分泌細胞因子 BM-MSCs通過分泌趨化因子、生長因子、激素等多種細胞因子影響鄰近細胞，旁分泌信號在血管生成、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡、抗纖維化等方面發(fā)揮重要作用，能夠改善局部微環(huán)境，到達組織損傷部位間接或直接產(chǎn)生保護和修復作用。LIU等［13］研究表明，在順鉑誘導的POI大鼠模型尾部靜脈移植BM-MSCs后，在大鼠卵巢門和卵巢髓質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量BM-MSCs，卵巢皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)少量BM-MSCs，卵泡和黃體中則沒有發(fā)現(xiàn)移植的BM-MSCs，分布于卵巢門和髓質(zhì)的BM-MSCs通過旁分泌作用促進竇卵泡數(shù)和雌二醇水平的增加，使得POI大鼠模型的受損卵巢結(jié)構(gòu)和功能得到有效修復。已有研究證實，BM-MSCs受PI3K/ALK 通路調(diào)控，通過對卵巢內(nèi)皮細胞的旁分泌作用，可刺激卵巢微血管內(nèi)皮細胞增殖、增加卵巢微血管內(nèi)皮細胞中血管生成標記基因的表達，從而促進卵巢血管生成、刺激輸卵管形成、增加新生血管的密度，有效恢復了POI大鼠的卵巢功能［14］。WANG等［15］報道，通過移植人臍帶血MSC，臍帶血MSC能夠分泌一系列參與DNA修飾表觀遺傳通路、轉(zhuǎn)錄通路、蛋白質(zhì)修飾通路和細胞信號轉(zhuǎn)導通路的細胞因子和生長因子，使得POI大鼠模型卵巢顆粒細胞凋亡減少，損傷卵巢迅速修復，提示BM-MSCs可通過旁分泌途徑刺激顆粒細胞生長，從而有效恢復損傷卵巢的組織結(jié)構(gòu)和儲備功能。綜上研究可知，BM-MSCs能夠通過分泌細胞因子來促進卵泡發(fā)育、減少顆粒細胞的凋亡，促進血管重生、重建卵巢組織微環(huán)境，有效修復受損卵巢組織提高卵巢儲備功能。

3.2 抗炎癥反應和減少氧化應激 研究表明，環(huán)磷酰胺處理的POI大鼠模型受損卵巢中TNF-α、IL-8和IL-6的表達明顯增加，皮膚來源的間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄上調(diào)了卵母細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過抗炎特性，能夠減輕炎癥因子的活性，促使卵巢組織提高抗氧化應激能力，可以有效降低化療作用下卵巢組織結(jié)構(gòu)的損傷［16］。UCHIBORI等［17］的最新研究證實，損傷部位釋放的TNFα可刺激BM-MSCs產(chǎn)生抗炎因子，促炎因子同時促進BM-MSCs向損傷組織的遷移并存活，對組織器官損傷的再生治療有著積極作用。

3.3 上調(diào)卵泡發(fā)育的相關基因 彭靜等［18］通過BM-MSCs的移植治療上調(diào)卵泡發(fā)育相關基因Nan03，Nobox，Lhx8的表達，使得竇狀卵泡、次級卵泡和黃體數(shù)量增加，閉鎖卵泡數(shù)量減少，表明移植BM-MSCs能夠有效恢復受傷卵巢組織結(jié)構(gòu)并且促進卵泡發(fā)育，也說明臨床上將BM-MSCs應用于治療POI的合理性。MOHAMED等［19］研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs能夠均勻重新填充POI大鼠模型卵巢中生長期的卵泡，促使抗繆勒管激素（AMH）、卵泡刺激素（FSH）、抑制素A、抑制素B的表達顯著提高，通過恢復卵巢激素，上調(diào)卵巢組織卵泡發(fā)育相關基因的表達來激活卵泡形成，充分證實BM-MSCs在POI大鼠模型中對受損卵巢組織結(jié)構(gòu)和儲備功能有正向恢復作用。上述研究對BM-MSCs再生利用的評估為POI患者恢復生育能力提供了可行且有效的治療選擇。

3.4 調(diào)控CyclinD2和p21 許多研究表明，移植BM-MSCs治療POI大鼠模型后，卵巢細胞凋亡明顯減少，健康卵泡顯著增多。CyclinD2是細胞周期的重要調(diào)控因子，能夠正向調(diào)控細胞周期，而p21可以誘導細胞周期的停止，抑制細胞的增長發(fā)育和分化。BAO等［3］研究表明，POI大鼠模型移植BMMSCs后，CyclinD2表達水平增加，Bax、p53、p21表達水平明顯下降，提示BM-MSC可以有效抑制卵巢顆粒細胞凋亡，同時促進卵巢顆粒細胞增殖，為BM-MSCs在臨床上應用于POI患者的治療提供了有力的研究基礎。

4 BM-MSCs的臨床應用

眾多學者已經(jīng)對BM-MSCs的臨床治療應用進行多項基礎實驗研究，尤其是BM-MSCs的增殖、多向分化、免疫調(diào)節(jié)、分泌多種細胞因子、損傷組織修復和再生功能等特性研究。NAGAYA等［20］研究表明，通過移植體外擴增的BM-MSCs可在梗死心肌處形成血管結(jié)構(gòu)，增加毛細血管密度，通過促進心肌缺血處血管的形成，有效阻止心肌細胞的凋亡，誘導心肌再生和心室重塑，在一定程度上使得急性心梗后心肌梗死面積減少，修復急性心梗后的心臟功能。靜脈注射BM-MSCs至成年嚙齒動物的大腦中，不僅可以減少中風相關的功能缺陷，BM-MSCs還可直接遷移至腦中風損傷部位，在適當?shù)臈l件刺激下分化為神經(jīng)元，說明BM-MSCs能夠促進神經(jīng)元發(fā)育、突觸形成和神經(jīng)傳遞，增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而恢復受損腦神經(jīng)［21］。LEE等［22］研究表明，BM-MSCs可以通過增加胰島和介導產(chǎn)生小鼠胰島素的β細胞，促使糖尿病小鼠的血糖水平下降，促進胰島素分泌的同時，還可以預防、改善糖尿病患者的腎臟病變。針對POI卵巢組織功能受損和生育能力減退的情況，BM-MSCs的移植能夠起到修復再生的積極作用，此將成為臨床治療卵巢早衰的新方向［23］。

5 卵巢早衰的治療現(xiàn)狀

當前臨床上關于卵巢早衰的治療多是針對雌激素水平低下所引發(fā)的癥狀，對于改善POI患者生育能力的作用甚微。激素替代療法能夠改善POI雌激素缺乏而導致的血管舒縮癥狀、泌尿生殖系統(tǒng)癥狀、骨質(zhì)疏松癥狀，并降低髖部和脊椎的骨折風險，同時能夠有效緩解反復潮熱、失眠、情緒波動等身心不適癥狀［24］。一項有358例原發(fā)性POI患者的長期研究發(fā)現(xiàn)，86例（24%）患者可出現(xiàn)間歇性卵巢功能自發(fā)緩解，其中76例（88%）患者的間歇性卵巢功能的自發(fā)緩解發(fā)生在診斷后1年內(nèi)［25］。一項納入577例POI患者的研究發(fā)現(xiàn)，其中117例（23%）患者能夠自行恢復卵巢功能，恢復卵巢功能患者的妊娠率為3.5%，在接受激素替代治療的大多數(shù)患者并未監(jiān)測到卵巢活動的恢復［26］，因此POI患者對輔助生殖技術的需求逐漸增加，卵泡捐獻被認為是應對POI患者生育能力減退的最合理的治療方法［24］。但是，輔助生殖技術并非是POI患者的最佳選擇，因此探索BM-MSCs對損傷卵巢組織的恢復和再生治療的研究對改善卵巢早衰患者的生育結(jié)局具有重要意義。

6 BM-MSCs治療卵巢早衰的可實施性分析

由于卵巢早衰患者的卵巢組織受損，雌激素水平低下，生育能力降低，容易對患者的生理和心理產(chǎn)生多重不良影響。BM-MSCs對恢復卵巢功能具有積極影響，為卵巢早衰的治療帶來了正向引導。研究證實，用miR-21慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)染后的BM-MSCs移植到POI大鼠模型卵巢中，在RNA聚合酶II的作用下，miR-21基因首先在細胞核中轉(zhuǎn)錄成primiR-21，修飾成熟的miR-21，有效減少了移植后BM-MSCs的凋亡率，同時增強了移植后BM-MSCs的活力，還發(fā)現(xiàn)POI大鼠模型體內(nèi)的E2水平上升，F(xiàn)SH水平明顯下降，卵泡在不同發(fā)育階段的數(shù)目也有所增加，更好地修復改善了大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)和儲備功能［27］?？梢?，BM-MSCs所具備的自我更新和多向分化、免疫調(diào)節(jié)、促血管生成、抗炎抗氧化應激、旁分泌和歸巢等特性，用于卵巢早衰的治療具有廣闊前景。

7 BM-MSCs移植存活率

BM-MSCs治療的主要局限性是它的移植成功率和移植后的存活率［28］。（1）低氧預處理：LIU等［29］研究顯示，低氧預處理的BM-MSCs移植到大鼠體內(nèi)后，血管重建速率明顯加快，移植后BM-MSCs的存活率顯著上升，對促進內(nèi)皮細胞增殖和抑制內(nèi)皮凋亡均發(fā)揮積極作用，這表明低氧預處理在維持干細胞的多能性、促進胚胎的正常發(fā)育、動員干細胞的歸巢中皆存在重要意義。（2）基因修飾：在體內(nèi)移植BMMSCs之前，對BM-MSCs進行基因修飾可有效保護BM-MSCs免受氧化刺激而引起的細胞凋亡，使得移植后的BM-MSCs在體內(nèi)的存活機率明顯提升［30］。（3）熱休克預處理：熱休克蛋白可激活BM-MSCs的自噬，預防BM-MSCs凋亡的同時可促進其在再生醫(yī)學細胞修復治療中的應用［31］。（4）移植方法：目前，靜脈注射、局部注射、動脈注射、全身注射等是BM-MSCs的主要移植途徑。其中，局部注射最為常用，可使受損組織部位細胞大量高濃度聚集，明顯緩解組織受損部位的缺血，加快損傷組織的再修復，改善器官功能，但局部注射具有一定的侵襲性，反復多次注射易導致?lián)p傷部位組織水腫，誘導炎癥反應。靜脈注射，是一種相對無創(chuàng)且易操作的程序，BM-MSCs通過靜脈注射輸送到體內(nèi)，可增加細胞通過毛細血管通道的機率，誘導細胞大量進入受損組織部位修復再生［32］，不過雖有一定的優(yōu)勢，但由于BM-MSCs離目標組織有一定距離，使得BM-MSCs的遷移率過低，導致目標部位BM-MSCs數(shù)量不足，導致修復功能受限，嚴重影響治療效果。WALCZAK等［33］研究證實，在MRI的追蹤監(jiān)測下動脈注射的BM-MSCs輸送到腦缺血大鼠模型顱內(nèi)后，細胞大量遷移到腦病變?nèi)毖獡p傷部位，對照發(fā)現(xiàn)通過靜脈輸送途徑的BM-MSCs隨機分散在全身各個器官組織中，腦缺血損傷部位只發(fā)現(xiàn)了少量BM-MSCs。然而，動脈注射BM-MSCs也存在一定風險，因為動脈注射的血管穿刺屬于侵入性操作，刺傷血管易導致炎癥反應的發(fā)生，引起血栓形成，造成栓塞。

8 小結(jié)與展望

綜上所述，BM-MSCs治療卵巢早衰具有積極作用且潛力巨大，BM-MSCs移植前在體外通過基因修飾、低氧等預處理可以使其移植成功率和移植后的存活幾率顯著上升，進一步提高修復損傷組織的再生能力，進而恢復卵巢早衰患者的卵巢功能，改善其生育能力。隨著對BM-MSCs的研究和認識日漸深入，未來BM-MSCs將更廣泛地應用于不同種類臨床疾病的治療中。同時，BM-MSCs在疾病治療研究中的進展，也會促進研究者對BM-MSCs生物學功能及臨床應用的深入認識。當前，BM-MSCs的臨床應用尚存在不足之處，如移植后的存活率、移植方法、移植效率以及患者的接受程度等，后續(xù)的深入研究應是如何高效率實施BM-MSCs在臨床疾病治療和再生醫(yī)學中的進一步應用。