肌球蛋白輕鏈激酶介導(dǎo)的肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化研究

高 文，李 科，李雪萍，李 亞，宋 梅

（1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710003）

肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是一種專門依賴Ca2+/CaM（鈣調(diào)素）的蛋白激酶，廣泛存在于骨骼肌、平滑肌、心肌以及哺乳動(dòng)物非肌肉細(xì)胞中，通過(guò)催化肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（regulatory light chain of myosin，RLC）N 末端絲氨酸殘基的磷酸化，可增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白激活的肌球蛋白ATP 酶活性，從而促進(jìn)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白之間的相互作用[1]。MLCK 在選擇蛋白質(zhì)底物方面存在顯著特異性，RLC 是其唯一已知的生理底物。Ca2+/CaM 依賴的MLCK 磷酸化RLC 在細(xì)胞功能中起著不同作用[2，3]，例如平滑肌收縮的起始、骨骼肌和心肌收縮力的增強(qiáng)、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的聚集收縮、成纖維細(xì)胞的收縮和分泌以及軸突生長(zhǎng)錐的運(yùn)動(dòng)。本文將對(duì)MLCK 分型、結(jié)構(gòu)及RLC 磷酸化在不同肌肉組織中的生物學(xué)作用進(jìn)行闡述，旨在為相關(guān)疾病的臨床診療新技術(shù)提供思路及理論依據(jù)。

1 MLCK 的分型

MLCK 是由4 種不同的激酶MLCK1，MLCK2，MLCK3 和MLCK4 組成，分別由4 種不同的基因MYLK1，MYLK2，MYLK3 和MYLK4 編碼[4，5]。根據(jù)其肌肉類型的特異性表達(dá)和活動(dòng)，MLCK1 被稱為平滑肌MLCK（smooth muscle MLCK，smMLCK），MLCK2被稱為骨骼肌MLCK（skeletal muscle MLCK，skMLCK），MLCK3 被稱為心肌MLCK（cardiac muscle MLCK，cMLCK），MLCK4 是最近才被發(fā)現(xiàn)的，基于其在心肌細(xì)胞中的選擇性蛋白表達(dá)，可能是另一種心肌MLCK[4]。每塊肌肉中存在著特定的MLCK，這種差異表明每塊肌肉在體內(nèi)的特殊作用，并有助于以不同的方式在每一個(gè)組織中進(jìn)行不同的能量活動(dòng)。

2 MLCK 的結(jié)構(gòu)

與skMLCK 和cMLCK 相比，smMLCK 的基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，它的多種蛋白質(zhì)產(chǎn)物在所有組織中幾乎均有表達(dá)，包括骨骼肌和心肌[6]。MYLK1 基因以細(xì)胞特異性的方式表達(dá)3 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，這是由交替啟動(dòng)子決定的。在人類基因組中，MYLK1 基因編碼非肌肉亞型、平滑肌亞型以及由不同起始位點(diǎn)編碼的終止蛋白Telokin（也稱為激酶相關(guān)蛋白或KRP）亞型。由于非肌肉亞型結(jié)構(gòu)中存在N-末端氨基酸的延伸，因此非肌肉亞型是一種高分子量亞型，被稱為長(zhǎng)型MLCK，平滑肌亞型是低分子量亞型被稱為短型MLCK，其在平滑肌和非肌肉細(xì)胞中的表達(dá)存在差異性。短型MLCK 具有一個(gè)催化核心，是一個(gè)包含自抑制和鈣調(diào)素結(jié)合序列的調(diào)控片段，還包含3 個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)模塊（Ig）、纖連蛋白結(jié)構(gòu)模塊（Fn）、富含PEVK 重復(fù)區(qū)域和三個(gè)N-末端重復(fù)的DFRXXL 肌動(dòng)蛋白結(jié)合序列[7]。與短型MLCK 相比，長(zhǎng)型MLCK 是同一基因通過(guò)其他啟動(dòng)子編碼的蛋白產(chǎn)物，其N-末端含有額外的結(jié)構(gòu)模塊，在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及其他非肌肉細(xì)胞中的含量較豐富，且在細(xì)胞的遷移過(guò)程中起著重要作用[8]。Telokin 蛋白是由位于MLCK 基因內(nèi)含子中的另一啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的一種17 KDa 的平滑肌特異性蛋白，由于缺乏激酶結(jié)構(gòu)域，其催化活性較低。Telokin 結(jié)構(gòu)與MLCK 和鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域下游的C-末端結(jié)構(gòu)相同，該結(jié)構(gòu)可促進(jìn)酶與未磷酸化的RLC 或肌球蛋白的結(jié)合，從而增強(qiáng)MLCK 的收縮活性[7]。它僅僅在平滑肌組織和細(xì)胞中有表達(dá)，例如腸道、尿路上皮、生殖道平滑肌中含量最豐富[9]。

在骨骼肌中，skMLCK 選擇性表達(dá)一種獨(dú)特的MLCK，在快速抽搐纖維中含量最高[4]。有研究報(bào)道[10]，skMLCK 也存在于心臟，但其含量太低，無(wú)法維持RLC 的基本磷酸化。skMLCK 具有與smMLCK 相似的催化核心和調(diào)控片段，C 末端含有一個(gè)自抑制序列，該序列包含一個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合序列，并與酶的活性位點(diǎn)直接相互作用以抑制激活[11]。盡管這兩種酶都是RLC 作為唯一生理底物的特異性蛋白激酶，但是二者在底物識(shí)別決定因子方面的催化特性存在差異。

cMLCK 基因在心房和心室肌細(xì)胞中都有特異性表達(dá)，由保守的激酶結(jié)構(gòu)域組成，該區(qū)域包括一個(gè)C-末端的ATP 酶結(jié)合位點(diǎn)，其氨基酸末端具有獨(dú)特性，與其它已知蛋白無(wú)明顯同源性[12]。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，cMLCK 在人類心力衰竭過(guò)程中可被同源盒蛋白Nkx2-5 高度調(diào)控。

最近發(fā)現(xiàn)的MLCK4 也是在心肌中有表達(dá)，催化的結(jié)構(gòu)域序列與其它MLCK 相似，但缺乏一個(gè)自抑制調(diào)控片段[14]。其晶體結(jié)構(gòu)以活性構(gòu)象顯示催化結(jié)構(gòu)域，一個(gè)短的C 端“假調(diào)節(jié)螺旋”（PRH）代替了一個(gè)完整的自我調(diào)節(jié)片段，由于缺少連接區(qū)，不能抑制催化作用[5]。通過(guò)比較MLCK4 的晶體結(jié)構(gòu)與其它MLCK 的結(jié)構(gòu)序列，可以推測(cè)MLCK4 可能具有Ca2+/CaM 獨(dú)立的激酶活性。

3 RLC 的磷酸化及其生物學(xué)作用

3.1 RLC 磷酸化在平滑肌中的作用 所有的平滑肌細(xì)胞中都含有肌球蛋白，肌球蛋白分子是由兩條重鏈和兩對(duì)肌球蛋白輕鏈組成的六聚體結(jié)構(gòu)[15]。重鏈運(yùn)動(dòng)域可逆地與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合，通過(guò)水解ATP，從而將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能。Ca2+/CaM 依賴的MLCK 激活平滑肌與非肌肉細(xì)胞肌球蛋白，并磷酸化RLC，以促進(jìn)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間的相互作用[16]。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，RLC 的磷酸化對(duì)于調(diào)節(jié)肌動(dòng)球蛋白的細(xì)胞骨架功能具有重要意義，例如局灶性黏連和應(yīng)力纖維的形成、離子交換、胞質(zhì)分裂、軸突生長(zhǎng)錐的推進(jìn)、細(xì)胞擴(kuò)散、內(nèi)皮和上皮屏障的形成、細(xì)胞的遷移等[17，18]。在平滑肌中，RLC 的磷酸化也被認(rèn)為是參與肌肉收縮起始的關(guān)鍵步驟[2]。長(zhǎng)型MLCK 和短型MLCK 在細(xì)胞功能上有著顯著差異，綠色熒光蛋白標(biāo)記的長(zhǎng)型MLCK 的熒光成像顯示，該亞型定位于有絲分裂HeLa 細(xì)胞的卵裂溝中，而綠色熒光蛋白標(biāo)記的短型MLCK 則廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中。

由于其專一的性質(zhì)，MLCK 在調(diào)節(jié)非肌肉細(xì)胞的多種功能和平滑肌收縮活動(dòng)中的重要性顯而易見(jiàn)，MLCK 表達(dá)的改變將影響細(xì)胞的生理功能，例如在心血管系統(tǒng)中，MLCK 表達(dá)的改變將影響內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能和血管平滑肌細(xì)胞的張力，從而影響血壓[19]。相關(guān)研究也表明，在血管損傷[20]，腸道炎癥[21]，氣道超敏反應(yīng)[22，23]等病理?xiàng)l件下，MLCK 的表達(dá)也隨之發(fā)生變化。

3.2 RLC 磷酸化對(duì)快速骨骼肌收縮的調(diào)節(jié)作用 骨骼肌肌節(jié)是由肌動(dòng)蛋白細(xì)絲和肌球蛋白粗絲規(guī)律排列構(gòu)成的。來(lái)自神經(jīng)肌肉接頭處的動(dòng)作電位穿過(guò)肌膜，并進(jìn)入T 管，觸發(fā)肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，細(xì)胞內(nèi)升高的Ca2+通過(guò)與肌節(jié)細(xì)絲中的肌鈣蛋白結(jié)合，引起骨骼肌的收縮，從而允許粗絲中的肌球蛋白跨橋與細(xì)絲中的肌鈣蛋白結(jié)合[24]。釋放到肌節(jié)中的Ca2+也能夠調(diào)節(jié)skMLCK 的活性，并作為一種生化記憶，在長(zhǎng)時(shí)間或重復(fù)活動(dòng)中增強(qiáng)肌肉的收縮力量。近年來(lái)關(guān)于動(dòng)物快速抽搐骨骼肌的研究表明，skMLCK 介導(dǎo)的RLC 磷酸化與強(qiáng)直性肌肉刺激后等長(zhǎng)抽搐力的振幅增加存在時(shí)間相關(guān)性[25-27]。由于肌肉疲勞，使得肌肉力量出現(xiàn)可逆性下降，這是肌肉持續(xù)活動(dòng)的必然結(jié)果。然而，快速抽搐骨骼肌的一個(gè)顯著特性是在疲勞期間抽搐力增強(qiáng)與強(qiáng)直力下降共存[28]。由于疲勞不會(huì)干擾RLC 磷酸化的能力，因此在這種情況下，此機(jī)制似乎可以增強(qiáng)低頻肌肉的力量，以幫助維持肌肉功能。

目前對(duì)于skMLCK 和RLC 磷酸化在人骨骼肌中的作用的認(rèn)識(shí)有限。人類骨骼肌的激活后增強(qiáng)（postactivation potentation，PAP）最近受到廣泛關(guān)注，因其可能影響人類在力量和耐力運(yùn)動(dòng)中的表現(xiàn)[28]。PAP 是由強(qiáng)烈的自發(fā)收縮引起的，在隨后的抽搐收縮過(guò)程中，這種自發(fā)收縮會(huì)增加峰值力和力的發(fā)展速度。PAP 的潛在機(jī)制是RLC 磷酸化和運(yùn)動(dòng)單位的增加。因此，在隨后的爆發(fā)性肌肉活動(dòng)中比如跳躍、短跑等，可以通過(guò)調(diào)節(jié)收縮來(lái)增強(qiáng)力量，從而誘發(fā)PAP[3]。

3.3 RLC 磷酸化在心臟生理病理中的作用 心臟是由心肌細(xì)胞組成的無(wú)意識(shí)橫紋肌，通過(guò)協(xié)調(diào)心肌收縮和舒張的連續(xù)循環(huán)，將血液從心房和心室泵入肺部及全身血管。在持續(xù)跳動(dòng)的心臟中，肌肉在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)不會(huì)因肌絲收縮蛋白Ca2+激活或失活的周期性增加和減少而放松。心臟與調(diào)節(jié)其功能的信號(hào)傳導(dǎo)模塊之間有著復(fù)雜的聯(lián)系。在心肌細(xì)胞的收縮裝置中，主要的驅(qū)動(dòng)因素是肌球蛋白分子的ATP 酶活性，而cMLCK 通過(guò)磷酸化心肌RLC 來(lái)激活或調(diào)節(jié)肌球蛋白的ATP 酶活性。Sevrieva 等[29]通過(guò)建立動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是cMLCK 的消融還是RLC 的磷酸化都可導(dǎo)致心肌收縮力障礙和心肌病理性肥厚。心力衰竭是由多因素引起的復(fù)雜疾病，收縮反應(yīng)中的肌原纖維蛋白磷酸化的改變?cè)谛牧λソ呋颊咝谋霉δ芟陆抵衅鹬匾饔?。在人類心力衰竭和心衰的?dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，cMLCK 表達(dá)和RLC的磷酸化程度都降低[30]。cMLCK 的過(guò)度表達(dá)增加了心肌收縮力，cMLCK 的下調(diào)則降低了心肌收縮力。這些研究充分表明RLC 磷酸化是心臟功能的決定因素，RLC 磷酸化的水平降低直接影響心臟功能。cMLCK 的過(guò)度表達(dá)增加了心肌收縮力，cMLCK 的下調(diào)則降低了心肌收縮力，cMLCK 和RLC 的磷酸化在維持正常心肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。

家族性肥厚性心肌病（familial hypertrophic cardiomyopathy，F(xiàn)HC）是一種常染色體顯性遺傳疾病，由包括心室RLC 在內(nèi)的所有主要肌節(jié)蛋白的突變引起，從而導(dǎo)致肌原纖維紊亂和心室肌增厚，并損害心臟的收縮功能。研究表明[31]，RLC 基因突變的小鼠心室RLC 磷酸化水平的降低與FHC 存在相關(guān)性。還有研究表明人心肌RLC 中谷氨酸-22 突變?yōu)橘嚢彼嵋才c肥厚型心肌病有關(guān)，這種突變抑制了磷酸化和Ca2+與RLC 的結(jié)合，此外，還增加了肌力發(fā)育和肌原纖維ATP 酶活性的Ca2+敏感性[32]。

總之，導(dǎo)致激酶活性喪失和RLC 磷酸化降低的cMLCK 基因突變將會(huì)導(dǎo)致肌節(jié)功能障礙和心力衰竭。對(duì)cMLCK 及RLC 磷酸化重要性的認(rèn)識(shí)能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其在人類心臟病理生理中的作用提供新的臨床靶點(diǎn)。

4 總結(jié)

近年來(lái)，MLCK 備受關(guān)注，這突出了酶在生物醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，本文綜述了MLCK 的結(jié)構(gòu)以及RLC 磷酸化在不同肌肉組織中的生物功能，體現(xiàn)了RLC 磷酸化對(duì)健康和疾病中的肌肉活動(dòng)有重要影響，從而為相關(guān)肌肉疾病的臨床研究提供新的思路，并可能成為未來(lái)的治療靶點(diǎn)。