血管內(nèi)皮生長因子對青光眼的視神經(jīng)保護機制的研究進展

孫 俊，余 歡，黃守約

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院眼科，上海 200025）

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種通過二硫鍵結(jié)合的同型二聚體糖蛋白，因其具有誘導(dǎo)血管形成、增加血管通透性、調(diào)節(jié)淋巴管生成和促進神經(jīng)發(fā)生并保護神經(jīng)等多種作用，已成為了目前心血管、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和眼科等領(lǐng)域的研究熱點[1]。青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell,RGC）變性及典型的視盤改變?yōu)樘卣鞯耐诵行砸暽窠?jīng)病變，病理性高眼壓為其主要危險因素，最終將導(dǎo)致不可逆性眼盲。

2015年的研究報道顯示，我國罹患青光眼的人數(shù)約為1 312 萬，預(yù)計到2050年，患者人數(shù)將增長到約2 516 萬，嚴(yán)重?fù)p害人群的健康，并顯著增加了公共衛(wèi)生成本和社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2]。

青光眼的發(fā)病機制可能涉及眼壓的增高、供血不足、組織缺氧、氧化應(yīng)激、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的免疫應(yīng)答及自噬相關(guān)機制，但仍尚未完全闡明[3]。采用藥物、激光和手術(shù)等方式控制眼壓，是目前臨床僅有的可有效延緩青光眼病程進展的方法，但仍有很多患者，即使眼壓控制良好，其青光眼視神經(jīng)病變導(dǎo)致的視覺功能惡化也無法減緩?？梢?，視神經(jīng)保護策略一直是青光眼治療中的重點和難點。近年來，體外實驗及動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 可維持軸突運輸、抑制炎癥反應(yīng)和減輕氧化應(yīng)激等，從而抑制青光眼動物模型中的RGC 凋亡，提示VEGF 可能具有視神經(jīng)保護作用，表明其在青光眼治療領(lǐng)域有一定的應(yīng)用潛力。本文總結(jié)近年來國內(nèi)外關(guān)于VEGF 對青光眼的神經(jīng)保護作用的研究進展及相關(guān)背景，旨在為基礎(chǔ)和臨床研究提供參考。

VEGF 的分類和功能

一、VEGF 分類

1983年，Senger 在培養(yǎng)有豚鼠腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)一種能強力誘導(dǎo)血管生成的物質(zhì)，并將其命名為血管通透因子。1989年，F(xiàn)errara 等[4]從牛垂體濾泡細(xì)胞中分離了一種促有絲分裂的肝素結(jié)合蛋白，命名為VEGF。cDNA 和蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果顯示，血管通透因子與VEGF 是同一種物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)的VEGF 家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盤生長因子（placenta growth factor，PIGF）、VEGF-E（由副痘病毒屬基因編碼）和VEGF-F（在蛇毒中發(fā)現(xiàn)）[5]。

VEGF 可與血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）特異性結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。VEGFR 包括其同源受體酪氨酸激酶受體（VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3）、神經(jīng)纖毛蛋白（Neuropilin，NRP）-1 和NRP-2，及非酪氨酸激酶受體（硫酸乙酰肝素和整聯(lián)蛋白）。

二、VEGF 家族成員及功能

1.VEGF-A：在很多文獻中，VEGF-A 也被直接稱為VEGF[6]，其在生理性和病理性血管生成過程中占主導(dǎo)地位。根據(jù)轉(zhuǎn)錄過程中外顯子剪接的不同，VEGF-A 被分為VEGFA 121、VEGF-A 165、VEGF-A 189 和VEGF-A 206 等多種亞型[1]，這些亞型間的主要區(qū)別為它們與肝素的結(jié)合能力不同。VEGF-A 可與VEGFR-1、VEGFR-2 結(jié)合。VEGFR-1 與VEGF-A 結(jié)合后，可增強炎癥細(xì)胞（巨噬細(xì)胞等）的吸引和遷移。與VEGFR-1 相比，VEGFR-2 與VEGF-A 的親和力較低，但其與VEGF-A 結(jié)合后的血管生成作用約為VEGFR-1 與VEGF-A 結(jié)合后的10 倍，因此VEGFR-2 其實是主要的信號受體。VEGFR-2 主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達，促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。

2.VEGF-B 和PIGF：VEGF-B 和PIGF 只能特異性結(jié)合VEGFR-1。VEGF-B 在血管生成調(diào)節(jié)方面的作用不大，其在維持心肌和冠狀動脈系統(tǒng)正常功能方面發(fā)揮重要作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-B 能直接作用于神經(jīng)元，通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]。PIGF 則可直接與VEGFR-1 結(jié)合，也能以置換VEGF-A 和形成PIGF/VEGF-A 復(fù)合物的形式影響內(nèi)皮細(xì)胞的生長、遷移和存活[8]。

3.VEGF-C 和VEGF-D：VEGF-C、VEGF-D 與VEGFR-3、NRP-2 親和力高，因此它們組成VEGF-C/D-VEGFR3/NRP2軸，可調(diào)節(jié)費林蛋白酶、接觸蛋白1 和趨化因子受體4 等信號分子產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)，在淋巴管生成和腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9]。施萊姆管的發(fā)育及其屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性都依靠VEGF-C/VEGFR3 的誘導(dǎo)和維持，是房水流出通道發(fā)生、發(fā)育的關(guān)鍵因素，與眼壓高低密切相關(guān)[10]。

VEGF 在青光眼患者中的視神經(jīng)保護作用機制

青光眼視神經(jīng)損害的機制尚未完全闡明，眼壓升高、視神經(jīng)頭的供血不足和神經(jīng)退行性變是目前的主流學(xué)說[11]，其機制也涉及視神經(jīng)軸突運輸障礙、內(nèi)源性和外源性凋亡信號通路的激活、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等[3]。

一、促神經(jīng)發(fā)生及促血管生成

關(guān)于VEGF 神經(jīng)保護機制的研究目前集中于其通過增加血流灌注以促進神經(jīng)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡和促進神經(jīng)再生等方面，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和眼部疾病的相關(guān)研究中均有體現(xiàn)[12]。VEGF 可直接作用于視神經(jīng)元，刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖并促進神經(jīng)發(fā)生[13]，也可通過促血管生成作用間接促進神經(jīng)發(fā)生。在神經(jīng)損傷的病理情況下，巨噬細(xì)胞可遷移到軸突間隙中，分泌VEGF 誘導(dǎo)血管形成，從而使施萬細(xì)胞（Schwann cell）能利用這些血管遷移到軸突間隙中，實現(xiàn)軸突再生[14]。在人眼內(nèi)，血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、米勒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和睫狀體非色素上皮細(xì)胞均能產(chǎn)生VEGF[1,15]。目前的研究認(rèn)為，VEGF 一般局限于其產(chǎn)生的部位發(fā)揮作用，而不會擴散到其他部位[16-19]。

二、VEGF-A 可維持視神經(jīng)軸突運輸來保護視神經(jīng)

RGC 凋亡是青光眼發(fā)病機制中公認(rèn)的病理基礎(chǔ)。RGC的細(xì)胞體位于內(nèi)側(cè)視網(wǎng)膜，軸突位于視神經(jīng)中。VEGF 可維持軸突運輸、抑制炎癥反應(yīng)和減輕氧化應(yīng)激等來抑制青光眼動物模型中的RGC 凋亡，達到對青光眼動物的視神經(jīng)保護作用。張水華等[17]發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)擠壓傷小鼠模型中視網(wǎng)膜組織的內(nèi)源性VEGF 表達增多，且在玻璃體腔內(nèi)注射重組人VEGF 治療后，存活的RGC 數(shù)量可顯著增加，提示VEGF 對受損的小鼠視神經(jīng)具有保護作用。內(nèi)源性VEGF-A 能抑制青光眼RGC 的凋亡[18]。Nishijima 等[19]的研究則發(fā)現(xiàn)，補充外源性VEGF-A 亦能有效抵抗缺血-再灌注損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡，而在玻璃體腔注射抗VEGF 藥物后，RGC 數(shù)量隨VEGF 濃度的降低而減少，且呈劑量依賴性，神經(jīng)元軸突運輸?shù)慕M成及VEGF-A 的作用如下。

1.神經(jīng)元軸突運輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)組成和功能：神經(jīng)元軸突運輸包括微管、馬達蛋白和運輸?shù)纳窠?jīng)營養(yǎng)物質(zhì)[20]。微管是道路，馬達蛋白則是運載物質(zhì)的交通工具。馬達蛋白分為兩類，一類是負(fù)責(zé)將細(xì)胞器、囊泡等從神經(jīng)元胞體運往軸突末端，即參與順向軸突運輸過程的驅(qū)動蛋白家族；另一類是負(fù)責(zé)將物質(zhì)從軸突末端運往神經(jīng)元胞體，即參與逆向軸突運輸過程的動力蛋白[21]。微管異常的原因包括年齡等因素導(dǎo)致的微管數(shù)量減少，以及Tau 樣蛋白和α-synuclein 突觸前蛋白等導(dǎo)致的微管裝配解離失衡。微管、馬達蛋白或運輸?shù)纳窠?jīng)營養(yǎng)物質(zhì)異常均可影響正常的軸突運輸，從而損害正常神經(jīng)功能。

2.VEGF-A 維持生理性軸突運輸：神經(jīng)元軸突運輸障礙是青光眼疾病進程中的早期病理改變，其先發(fā)生于遠(yuǎn)端軸突終止的上丘，再逐漸向近端發(fā)展[22]。Foxton 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗VEGF 藥物可導(dǎo)致部分軸突運輸能力喪失，該作用發(fā)生于RGC 數(shù)量減少前。楊平等[24]發(fā)現(xiàn)，VEGF 可以由神經(jīng)元囊泡釋放，與驅(qū)動蛋白1B 結(jié)合后實現(xiàn)順行軸突運輸，發(fā)揮維持神經(jīng)元活性和促進軸突生長的作用。因此，VEGF-A 在細(xì)胞的正常生理機制中可能起著維持突觸結(jié)構(gòu)和軸突運輸功能的作用。

（1）調(diào)節(jié)P38/熱休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）維持軸突運輸：結(jié)合VEGF-A 后，VEGFR-2 會自磷酸化，其中一個自磷酸化位點結(jié)合cdc42,調(diào)節(jié)下游的P38 和Hsp27 信號通路，從而影響到軸突運輸。Foxton 等[23]發(fā)現(xiàn)，小鼠玻璃體腔注射抗VEGF 藥物后，磷酸化的p38 和Hsp27在整個內(nèi)層視網(wǎng)膜的表達顯著增多。p38 是絲裂原激活蛋白激酶家族中的一員，在青光眼動物模型的視網(wǎng)膜中，特別是RGC 中表達增多，如其在大鼠青光眼模型增中加了2～3 倍，在小鼠青光眼模型中則增加約3 倍[25]。Hsp27 是熱休克蛋白家族的一員，通常被認(rèn)為具有維持蛋白穩(wěn)態(tài)、抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護的作用。但研究發(fā)現(xiàn)，向大鼠眼部玻璃體內(nèi)注射Hsp27 能導(dǎo)致RGC及其軸突變性，提示Hsp27 參與了青光眼的發(fā)病[26]。

（2）調(diào)節(jié)磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶信號通路促進軸突生長：VEGF-A/VEGFR-2 復(fù)合物可以結(jié)合Src 蛋白和Src 同源蛋白β，從而激活下游的磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶信號通路。該信號通路能抑制bcl 相關(guān)死亡蛋白質(zhì)和胱天蛋白酶9，從而抑制青光眼模型中RGC 的凋亡，同時也能激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶和叉頭框蛋白O1，促進細(xì)胞存活和軸突生長[27-28]。Shen 等[18]設(shè)計了2 種新的VEGF 變異體——eVEGF-38 和eVEGF-53，其能上調(diào)NRP-1 和微管相關(guān)蛋白質(zhì)1B 等基因表達，促使RGC 軸突增長約12 倍，同時也能提高胚胎干細(xì)胞向RGC 轉(zhuǎn)化的效率，有望成為RGC 和視神經(jīng)損傷的潛在治療方法。

關(guān)于VEGF-A 在視神經(jīng)軸突運輸中的作用及其相關(guān)信號通路的具體調(diào)節(jié)機制，目前尚未完全明確，需要進一步行更詳盡和深入的研究。

三、VEGF-B 保護視神經(jīng)的作用機制

1.抑制細(xì)胞凋亡：線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)折疊異常以及蛋白酶體降解系統(tǒng)的缺陷等因素均可導(dǎo)致活性氧水平升高，并進一步通過DNA 損傷和蛋白質(zhì)修飾等方式促使RGC凋亡[29]，而在青光眼動物模型中應(yīng)用葉黃素和玉米黃素等抗氧化劑能，減輕高眼壓引起的視網(wǎng)膜損傷[30]。Li 等[31]在視神經(jīng)擠壓損傷小鼠模型中觀察到內(nèi)源性VEGF-B 表達增多，并進一步在視神經(jīng)擠壓損傷、N-甲基天冬氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷和腦缺血中風(fēng)的動物模型中，應(yīng)用外源性VEGF-B 補充治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-B 可與VEGFR1 結(jié)合，從而抑制唯BH3蛋白基因和其他凋亡相關(guān)基因的表達，進而抑制神經(jīng)元的凋亡。其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)唯BH3 蛋白，是Bcl-2 蛋白家族中的一類僅含有BH3 同源區(qū)域的促凋亡分子，是啟動細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子，其活性主要在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)[32]。

2.上調(diào)關(guān)鍵抗氧化基因：導(dǎo)致青光眼RGC 死亡的機制復(fù)雜多樣，由活性氧與抗氧化劑之間的失衡引起的氧化應(yīng)激是其中的關(guān)鍵因素之一。VEGF-B 可上調(diào)的抗氧化基因，包括谷胱甘肽過氧化酶、家族、超氧化物歧化酶、硫氧還原蛋白過氧化物酶類、硫氧還蛋白還原酶家族和含MYND 結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白17 等[7]。VEGF-B 能上調(diào)這些重要抗氧化基因的表達水平，保護RGC 免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷。

VEGF 相關(guān)青光眼研究的內(nèi)容及方向展望

青光眼是多因素、多機制共同作用引起的視神經(jīng)退行性疾病，其導(dǎo)致視神經(jīng)損傷的機制可能涉及眼壓增高、血液循環(huán)不足、組織缺氧、神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的丟失、興奮性中毒、氧化應(yīng)激、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的免疫應(yīng)答及自噬相關(guān)機制等。VEGF對青光眼的視神經(jīng)保護作用即是對青光眼病程中視神經(jīng)損害相關(guān)綜合因素的拮抗，上述機制均有待進一步的研究。

一、VEGF 與缺氧刺激間的關(guān)系

生理情況下，VEGF 呈低水平表達，而低氧等刺激因素可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α及其下游靶基因（一氧化氮合酶等）的轉(zhuǎn)錄激活，從而提高VEGF 表達水平，以改善氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)[33]。RGC 等神經(jīng)元在缺氧時可分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血小板源性生長因子等，調(diào)節(jié)VEGF 的分泌，從而刺激血管生長，以滿足組織的代謝需求，并實現(xiàn)內(nèi)環(huán)境平衡。缺氧是青光眼發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)，因此有理由相信在青光眼病理狀態(tài)下，VEGF 的表達水平會受到缺氧因素誘導(dǎo)而增加，但是否會同時加強引入VEGF 的視神經(jīng)保護功能尚不明確，需待進一步研究明確。

二、VEGF 與小膠質(zhì)細(xì)胞間的關(guān)系

在青光眼等慢性神經(jīng)炎癥性病變中，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活通常被認(rèn)為是有害的，因其具有促炎作用。目前已知的研究一般公認(rèn)，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活發(fā)生在青光眼RGC 損傷之前,其激活后造成RGC 損傷的機制可能包括促炎因子的釋放、氧化應(yīng)激、多種補體分子表達升高等[34]。VEGF 能與小膠質(zhì)細(xì)胞上的VEGFR 特異性結(jié)合，從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面亦分布有VEGFR，且神經(jīng)細(xì)胞自身便具有合成VEGF 的功能。小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子α 則能夠增加VEGF 的表達，也能通過p38 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、c-Jun 氨基末端激酶和核因子κB 發(fā)揮促炎和增加血管生成活性的作用[35]。小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β 也可經(jīng)Src 蛋白依賴性途徑和絲裂原激活蛋白激酶、胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號途徑誘導(dǎo)VEGF 表達上調(diào)，而VEGF 和IL-1β 均能促血管生成和血管通透性增加[36]。另外，也有研究報道，小膠質(zhì)細(xì)胞直接產(chǎn)生的VEGF-B 能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞上的VEGFR-1，從而促進神經(jīng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展[37]。上述研究結(jié)果提示，VEGF 極有可能通過小膠質(zhì)細(xì)胞間接參與了青光眼視神經(jīng)病變的進程，但其具體機制如何，有待未來進行深入的研究發(fā)掘。

結(jié) 語

盡管VEGF 的神經(jīng)保護作用在多種動物模型中得以驗證，但在青光眼領(lǐng)域的相關(guān)研究成果很少，且目前研究局限于VEGF-A 和VEGF-B，仍需大量基礎(chǔ)實驗探究青光眼動物模型中VEGF 的神經(jīng)保護作用機制?？紤]到VEGF 是一個具有多重功能的生長因子，其有促進新生血管生成和血管通透性增加等的作用不容忽視，如何在特異性地發(fā)揮其神經(jīng)保護作用的同時，弱化其促血管生成功能，仍需要進行大量實驗研究探索。相比其他VEGF 家族成員，VEGF-B 的血管生成作用更弱，可能有望作為該研究方向的潛在突破口。

目前，直接阻斷VEGF 作用的抗VEGF 藥物，如雷珠單抗、康柏西普和阿柏西普等已，廣泛應(yīng)用于新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病和新生血管性青光眼等眼科疾病的治療。部分研究發(fā)現(xiàn)，接受抗VEGF 藥物治療后患者存在持續(xù)性高眼壓、視神經(jīng)損害等病理現(xiàn)象，但抗VEGF 藥物的安全性仍被大部分臨床醫(yī)師認(rèn)可[15,38]。如未來以VEGF 作為神經(jīng)保護因子應(yīng)用于臨床眼科疾病的治療，將會對眼科醫(yī)師對疾病機制的理解和藥物使用指征的把握提出更高的要求，需在臨床實踐中進一步完善和提高。隨著更詳盡和深入的研究，相信VEGF 未來能夠在青光眼的視神經(jīng)保護治療領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。