自然殺傷細(xì)胞在頭頸部鱗癌發(fā)展及治療中的研究進(jìn)展

王鹿鳴，謝 尚

1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（北京 100081）

2. 北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科（北京 100081）

3. 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（北京 100081）

4. 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室（北京 100081）

5. 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100081）

頭頸部鱗癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其轉(zhuǎn)移率較高，生存率較低，常伴有發(fā)音、進(jìn)食等功能的障礙和面部外形的破壞[1]。研究發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗癌表現(xiàn)出免疫抑制的特點(diǎn)[2]。自然殺傷（nature killer，NK）細(xì)胞作為腫瘤免疫的第一道防線，在早期清除腫瘤細(xì)胞及激活下游免疫細(xì)胞上有重要作用，其功能的抑制往往導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。本文就NK細(xì)胞的生物學(xué)特性、抗腫瘤機(jī)制、在頭頸部鱗癌中的活化水平、基于NK細(xì)胞的免疫逃逸及目前與NK細(xì)胞相關(guān)免疫療法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NK細(xì)胞的生物學(xué)特性及抗腫瘤機(jī)制

NK細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，約占所有外周淋巴細(xì)胞的10%～15%。靜止的NK細(xì)胞多存在于外周血中，肝臟、脾臟及腹膜腔內(nèi)也有NK細(xì)胞存在。被細(xì)胞因子激活后，NK細(xì)胞能夠遷移并滲入大多數(shù)含有病原體感染或惡性細(xì)胞的組織中[3-4]。

NK細(xì)胞可根據(jù)表面標(biāo)記物的差異性表達(dá)劃分為具有不同功能特性的亞群。一般來說，NK細(xì)胞被定義為CD3-CD56+細(xì)胞，并可通過抗原CD56的豐度分為CD56dim和CD56bright兩個亞群。其中，CD56dim的NK細(xì)胞約占總數(shù)的90%，多存在于外周血循環(huán)中；而約占總數(shù)10%的CD56brightNK細(xì)胞則主要位于次級淋巴組織中[5-7]。CD16是另一種常用的NK細(xì)胞表面標(biāo)記物，其表達(dá)規(guī)律與CD56的豐度有關(guān)：CD56dimNK細(xì)胞常表達(dá)高水平的CD16（CD16high），而CD56brightNK細(xì)胞伴隨CD16的表達(dá)缺失或低水平表達(dá)（CD16-/low）。從功能上講，CD16使NK細(xì)胞能夠檢測抗體包被的靶細(xì)胞并發(fā)揮抗體依賴性細(xì)胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）[8]。此外，CD56brightNK細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)抑制性主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC） I類結(jié)合受體 CD94/NKG2A，但缺乏殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs） 和 激 活性MHC I類結(jié)合受體CD94/NKG2C的表達(dá)。而CD56dimNK細(xì)胞則顯示出CD94/NKG2A、CD94/NKG2C和KIRs的多樣化表達(dá)[9]。這種不同亞群間表面標(biāo)記物的差異性表達(dá)與他們不同的功能直接相關(guān)：CD56dimCD16highNK細(xì)胞識別靶細(xì)胞并分泌高水平的穿孔素和顆粒酶，有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可發(fā)揮免疫監(jiān)控的作用[10-11]；CD56brightCD16-/lowNK細(xì)胞則具有較弱的細(xì)胞毒性和介導(dǎo)ADCC的功能，更多地通過響應(yīng)單核細(xì)胞分泌的炎癥因子產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子，如干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）及白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[12-13]。

NK細(xì)胞的主要功能為裂解靶細(xì)胞和提供免疫調(diào)節(jié)。NK細(xì)胞與T細(xì)胞同為直接殺傷細(xì)胞，但應(yīng)答過程無需識別抗原預(yù)先致敏，具有應(yīng)答快速的特點(diǎn)。NK細(xì)胞的活性受表面抑制性受體如CD94/NKG2A、KIRs、T 細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3（T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3），以及活化性受體如CD16（FcγRIIIa）、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46等的共同調(diào)節(jié)。生理狀態(tài)下，正常細(xì)胞表面的配體結(jié)合NK細(xì)胞的抑制性受體，抑制性受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，NK細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，避免殺傷正常細(xì)胞；病理狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞表面的抑制性配體減少或活化性配體增加，NK細(xì)胞活化，通過胞吐穿孔素和顆粒酶、人凋亡相關(guān)因子配體（factor associated suicide ligand，F(xiàn)asL）和TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）的激活，或通過ADCC誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡[5]。NK細(xì)胞還可以通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，激活下游適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[8]。

2 NK細(xì)胞在頭頸部鱗癌中的表達(dá)、活化水平及與預(yù)后的關(guān)系

NK細(xì)胞參與了腫瘤防御的第一道防線，而頭頸部鱗癌中常出現(xiàn)NK細(xì)胞數(shù)量減少、低水平浸潤或功能喪失。研究顯示，頭頸部鱗癌患者的癌組織中僅能檢測到低水平的NK細(xì)胞浸潤，且多為調(diào)節(jié)性的CD56brightNK細(xì)胞而不是具有細(xì)胞毒性的CD56dimNK細(xì)胞[14-15]。此外，腫瘤浸潤性NK細(xì)胞活性升高的患者預(yù)后更加良好，且區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也更低[16-17]。相對的，低NK細(xì)胞毒性的患者區(qū)域和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高，且死亡風(fēng)險更高。分析發(fā)現(xiàn)這類患者的外周血中存在一種免疫復(fù)合物，可抑制NK細(xì)胞的功能[18]。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陽性患者的CD56dimNK細(xì)胞腫瘤浸潤比率要高于HPV陰性患者，這可能是HPV陽性患者臨床預(yù)后較好的原因[19]。與CD56類似，表面抗原CD57與良好預(yù)后、低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率成正相關(guān)[20-21]。對外周血循環(huán)中的NK細(xì)胞進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，早期腫瘤患者外周血循環(huán)中的NK細(xì)胞數(shù)量高于晚期腫瘤患者[22]。同腫瘤組織浸潤的NK細(xì)胞類似，循環(huán)NK細(xì)胞的數(shù)量[23-24]及細(xì)胞毒性水平降低[25]，CD56brightNK細(xì)胞的數(shù)量多于CD56dimNK細(xì)胞；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CD56dimNK細(xì)胞較CD56brightNK細(xì)胞優(yōu)先發(fā)生自發(fā)凋亡[26]。雖然也有研究報道循環(huán)NK細(xì)胞中CD56dimNK細(xì)胞的比例上升，但仍檢測到了總體循環(huán)NK細(xì)胞數(shù)量的減少和細(xì)胞毒性的抑制[27]。提示隨著腫瘤發(fā)展進(jìn)程，NK細(xì)胞的數(shù)量和功能可能受到抑制。

放療聯(lián)合化療是局部晚期和轉(zhuǎn)移的頭頸部鱗癌的治療方案。放化療的全身性副作用包括對免疫功能的抑制。一項(xiàng)對23例僅接受放療的患者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，放療前后循環(huán)NK細(xì)胞的水平無明顯變化[28]，另一研究發(fā)現(xiàn)化療（順鉑/紫杉醇與卡鉑/多西他賽聯(lián)合方案）后NK細(xì)胞數(shù)量減少，而同期放化療后NK細(xì)胞數(shù)量增多[29]。由于目前對NK細(xì)胞的活化水平不明確，故NK細(xì)胞對放化療療效的影響仍待進(jìn)一步研究。

NK細(xì)胞的部分配體也可作為頭頸部鱗癌預(yù)后及預(yù)測臨床病理特征的指標(biāo)。抑制性受體癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1（carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1， CEACAM1）的高表達(dá)與生存率降低和預(yù)后不良有關(guān)[30-31]，CEACAM1還抑制活化受體NKG2D的信號傳導(dǎo)，并因此抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤功能[32]。而CEACAM1的配體RCAS1可誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸中起作用。研究顯示其在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)預(yù)示著較高的腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[33]。

3 基于NK細(xì)胞的頭頸部鱗癌免疫逃逸

頭頸部鱗癌的免疫系統(tǒng)多處于抑制或失活狀態(tài)[34]。NK細(xì)胞通過細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的監(jiān)管作用，而腫瘤細(xì)胞則通過一系列方式逃逸NK細(xì)胞的監(jiān)管作用。頭頸部鱗癌細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，或使抑制性受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，或使活化性受體信號阻斷，或通過腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）抑制NK細(xì)胞募集，最終導(dǎo)致NK細(xì)胞抗腫瘤功能的下降。

抑制NK細(xì)胞表面的活化性受體是頭頸部鱗癌細(xì)胞免疫逃逸的常見原因。程序性死亡1（programmed death 1，PD-1）在NK細(xì)胞上高表達(dá)時是一種NK細(xì)胞的激活表型，高水平的循環(huán)PD-1陽性NK細(xì)胞與更好的總體生存率相關(guān)。PD-1陽性NK細(xì)胞富集于腫瘤組織中，但其對NK細(xì)胞的活化作用在與TME中的程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）結(jié)合后喪失[22]。大多數(shù)頭頸部鱗癌過表達(dá)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），而PD-L1的表達(dá)受EGFR及其下游JAK2/STAT1依賴性誘導(dǎo)，最終過表達(dá)PD-L1的頭頸部鱗癌逃避NK細(xì)胞的監(jiān)視[35]。NKG2D是NK細(xì)胞表面的活化性受體，在免疫監(jiān)視中起著重要的作用，因此頭頸部鱗癌細(xì)胞通過分泌各種NKG2D配體（NKG2DLs）來逃避NK細(xì)胞的監(jiān)視。高水平NKG2DLs存在下NK細(xì)胞不能浸潤腫瘤組織且細(xì)胞毒性降低，而從頭頸部鱗癌患者血漿中去除脫落的NKG2DLs可以恢復(fù)NK細(xì)胞功能[14]。復(fù)發(fā)的頭頸部鱗癌中可溶性主要組織相容性復(fù)合物I類鏈相關(guān)肽A和轉(zhuǎn)化生長因子-β的表達(dá)升高，并抑制依賴NKG2D的NK細(xì)胞活化[36]。同為活化性受體的NKp30和NKp46也有表達(dá)下降的報道[37]。

NK細(xì)胞抑制性受體及其配體的過度表達(dá)也是頭頸部鱗癌細(xì)胞免疫逃逸的原因。CD56dimNK細(xì)胞受其表面抑制受體KIRs的控制。研究顯示頭頸部鱗癌較其他實(shí)體瘤表達(dá)更高水平的KIRs[2]，意味著NK細(xì)胞的活性可能因此受到抑制，頭頸部鱗癌患者更有可能在抗KIRs抗體治療中獲益。顧小軍等的研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌患者外周血NK細(xì)胞表面抑制性受體TIM-3表達(dá)上升，并與腫瘤臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示其與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[38]。

Ludwig等的研究顯示，頭頸部鱗癌患者的血漿中分離出的外泌體可下調(diào)NKG2D表達(dá)水平并抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[39]，而前述NKG2DLs通過外泌體釋放后較單體NKG2DLs引起更多的NKG2D下調(diào)[40]；Theodoraki等也報道了頭頸部鱗癌患者血漿中可分離出攜帶PD-L1的外泌體，且外泌體內(nèi)的PD-L1水平與腫瘤的活動性和淋巴結(jié)狀態(tài)相關(guān)[41]，提示腫瘤免疫逃逸的新機(jī)制及外泌體作為癌癥進(jìn)展的非侵入性標(biāo)志物和免疫功能低下指標(biāo)的潛力。

除上述調(diào)節(jié)方式外，NK細(xì)胞與頭頸部鱗癌腫瘤患者的其他免疫效應(yīng)細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性B細(xì)胞等之間還存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，有待進(jìn)一步的研究[42-46]。

4 基于NK細(xì)胞的免疫療法在頭頸部鱗癌治療方案中的應(yīng)用

目前，基于NK細(xì)胞的免疫療法側(cè)重于恢復(fù)或增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。主要方法包括以下幾類：①基于西妥昔單抗（Cetuximab ）的聯(lián)合用藥方案；②基于白細(xì)胞介素家族細(xì)胞因子的聯(lián)合用藥方案；③經(jīng)工程改造的NK細(xì)胞產(chǎn)物療法等。

Cetuximab已被列入過表達(dá)EGFR的頭頸部鱗癌（約占總數(shù)90%）的治療方案。Cetuximab包被EGFR陽性HNSCC細(xì)胞后，通過與NK細(xì)胞表面的活化性受體FcγRIIIa結(jié)合激活NK細(xì)胞，進(jìn)而NKG2D依賴性激發(fā)DC成熟、效應(yīng)因子IFN-γ及趨化因子Th1分泌[47]。然而Cetuximab的臨床應(yīng)答率僅為10% ～ 15%。Baysal等報道，Cetuximab耐藥性可能被基于NK細(xì)胞的免疫反應(yīng)克服[48]。Faden等的研究發(fā)現(xiàn)，Cetuximab無應(yīng)答的患者存在較高的人白細(xì)胞抗原-C（human leukocyte antigen-C，HLA-C）失活性突變，而HLA-C與NK細(xì)胞表面的KIRs結(jié)合后能夠激活NK細(xì)胞，針對HLA-C/KIRs軸的聯(lián)合用藥方案（如抗KIRs單克隆抗體Lirilumab與Cetuximab）可以取得更好的臨床治療效果[49]。Jie等報道Cetuximab上調(diào)CTLA-4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg），使ADCC受到抑制；使用Ipilimumab消除腫瘤內(nèi)的CTLA-4+Treg，增強(qiáng)Cetuximab誘導(dǎo)的NK細(xì)胞ADCC[50]。體外實(shí)驗(yàn)中一種Toll樣受體8的激動劑也可以通過激活NK細(xì)胞及下游ADCC作用增強(qiáng)Cetuximab對頭頸部鱗癌細(xì)胞的殺傷作用[51]。Concha-Benavente等發(fā)現(xiàn)Cetuximab增加NK細(xì)胞上活化受體PD-1的表達(dá)，但被外源性PD-L1封閉；使用阻斷PD-1-PD-L1軸的Nivolumab可顯著增強(qiáng)Cetuximab對過表達(dá)PD-L1的頭頸部鱗癌細(xì)胞的毒性[22]。Bochen等的研究顯示，維生素D缺乏常見于頭頸部鱗癌患者，進(jìn)行維生素D的替代治療后，腫瘤組織內(nèi)及周邊的NK細(xì)胞浸潤增多，單獨(dú)用藥或與Cetuximab聯(lián)用均可增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性[52]；STING激動劑與Cetuximab聯(lián)用也在體外實(shí)驗(yàn)中展示了較單藥更好的抗腫瘤作用[53]。

白細(xì)胞介素家族中的數(shù)個因子被報道能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的活化。Pinette等的研究表明，IL-15具有促進(jìn)NK細(xì)胞增殖、分化、存活和活化的功能，提高NK細(xì)胞分泌IFN-γ和T細(xì)胞趨化因子RANTES和IL-8的水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-15激動劑ALT-803和Cetuximab聯(lián)合用藥，可明顯減少裸鼠腫瘤體積[54]；I期臨床試驗(yàn)中也觀察到了ALT-803對NK細(xì)胞數(shù)量和活性的良好的上調(diào)作用[55]。與IL-15有類似結(jié)構(gòu)和作用的IL-12也在治療不可切除的原發(fā)或復(fù)發(fā)頭頸部鱗癌患者的I/II期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出了和Cetuximab的聯(lián)合治療作用[56]，一種攜帶IL-12的疫苗在裸鼠頭頸部鱗癌移植瘤模型中完全阻止了腫瘤復(fù)發(fā)[57]。同為IL-12家族的IL-27也可激活NK細(xì)胞，并通過誘導(dǎo)ADCC來抑制NK細(xì)胞抗性頭頸部鱗癌[58]。IL-2是已經(jīng)證實(shí)的NK細(xì)胞活化性配體，在一項(xiàng)36例無法切除的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌病例的IIb期臨床試驗(yàn)中觀察到IL-2的經(jīng)皮和結(jié)節(jié)內(nèi)注射能夠提升NK細(xì)胞的腫瘤浸潤率和細(xì)胞毒性[59]。主要活性成分是IL-2，IL-1β，IFNγ和TNFα的細(xì)胞因子生物制劑IRX-2通過恢復(fù)活化性受體NKp30和NKp46的表達(dá)水平來恢復(fù)NK細(xì)胞功能，IIa期臨床試驗(yàn)中觀察到了良好的耐受性和對總生存率的延長[37]。

PD-L1 t-haNK細(xì)胞是一種經(jīng)過工程改造的高親和力NK細(xì)胞（high affinity NK cells，haNK細(xì)胞），表達(dá)CD16高親和力FcγRIIIa（158V）受體，可以內(nèi)源性合成IL-2[60]及靶向PD-L1的特異性嵌合抗原受體，檢測發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞可分泌更高水平的穿孔素和顆粒酶。PD-L1 t-haNK細(xì)胞的這些特征使其可以通過三種不同的機(jī)制靶向腫瘤細(xì)胞：嵌合抗原受體介導(dǎo)的殺傷、ADCC介導(dǎo)的殺傷和天然NK細(xì)胞受體介導(dǎo)的殺傷。體外實(shí)驗(yàn)中，PD-L1 t-haNK細(xì)胞對來自乳腺、肺、結(jié)腸、泌尿生殖系統(tǒng)等20種組織的惡性腫瘤細(xì)胞都有較haNK細(xì)胞更良好的裂解作用，在與抗PD-1抗體和IL-15激動劑ALT-803聯(lián)用后對裸鼠頭頸部鱗癌移植瘤的生長有明顯的抑制作用[61-62]；將晚期HPV陰性頭頸部鱗癌患者的外周血白細(xì)胞與PDL1 t-haNK一起體外孵育24小時，顯著降低高表達(dá)PD-L1的巨噬細(xì)胞和CD14+/ CD15+骨髓細(xì)胞亞群[63]。這些結(jié)果提示了PD-L1 t-haNK細(xì)胞在治療高表達(dá)PD-L1的頭頸部鱗癌患者中的應(yīng)用前景。

其他用藥方案還包括：對NK細(xì)胞表面受體抑制劑的開發(fā)如NKG2A的單克隆抗體Monalizumab[64]或NKp44的抑制劑[65]；基于細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的開發(fā)如WEE1激酶抑制劑逆轉(zhuǎn)G2/M期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的激活，最終增加頭頸部鱗癌細(xì)胞對NK細(xì)胞裂解作用的敏感性[66]；使用CXCR1 / 2小分子抑制劑SX-682抑制骨髓來源的抑制性細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而增強(qiáng)NK細(xì)胞的腫瘤浸潤和細(xì)胞毒性[67]；使用同樣具有激活NK細(xì)胞功能的Nimotuzumab替代Cetuximab，避免對TIM-3和PD-L1上調(diào)及Tregs細(xì)胞百分比上升造成的免疫逃逸[68-69]等。

5 結(jié)語

總體來看，NK細(xì)胞在頭頸部鱗癌中的功能受到抑制，使免疫系統(tǒng)無法及時清除腫瘤細(xì)胞，可能是導(dǎo)致頭頸部鱗癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制?？紤]到頜面部組織保留的重要性，減少腫瘤體積以及由轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)導(dǎo)致的多次手術(shù)具有重要意義。相比較其他手段，免疫療法通過重新激活NK細(xì)胞的抗腫瘤能力，靶向清除頭頸部鱗癌細(xì)胞，能夠更好地保留頜面部的形態(tài)和功能。然而NK細(xì)胞受抑制的機(jī)制復(fù)雜，既包括腫瘤細(xì)胞本身分泌的各種細(xì)胞因子在腫瘤微環(huán)境及外周血循環(huán)中對NK細(xì)胞的抑制，也涉及免疫系統(tǒng)各組分間復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。目前的基于NK細(xì)胞的免疫治療方案，雖在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)上展現(xiàn)了良好的抗腫瘤能力，但由于NK細(xì)胞復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，與實(shí)際的臨床應(yīng)用還有較大距離，NK細(xì)胞在頭頸部鱗癌治療中的應(yīng)用有待進(jìn)一步的探索。