巨噬細(xì)胞與非酒精性脂肪性肝炎關(guān)系的研究*

施鈴靈，卞兆連，邵建國

(南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院消化內(nèi)科，南通 226006)

非酒精性脂肪肝性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為全球最常見的慢性肝病，影響到20%～30%的普通人群，其發(fā)病率普遍上升[1-2]，代表著一系列進(jìn)展性發(fā)展的肝病，包括單純的脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、相關(guān)肝硬化及潛在的肝細(xì)胞癌[3-4]。NAFLD的特點(diǎn)是循環(huán)中的游離脂肪酸增加、肝氧化損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂質(zhì)失衡。

盡管目前有大量對NAFLD 及NASH 的研究，但其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍是個(gè)未解之謎。最早提出“二次打擊”學(xué)說，即早期的脂肪變性和隨后的炎癥階段。新的研究[5]結(jié)果對早期的“二次打擊”學(xué)說提出質(zhì)疑，目前普遍公認(rèn)的是“多次打擊”學(xué)說，即多個(gè)危險(xiǎn)因素可以共同作用導(dǎo)致NAFLD 的進(jìn)展。首次打擊是指脂肪在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的過度積聚導(dǎo)致肝臟脂肪變性，從而增加了肝臟對炎癥損傷的敏感性。第二次打擊是在首次打擊的基礎(chǔ)上，各種氧化代謝產(chǎn)物、脂肪細(xì)胞因子、脂質(zhì)過氧化物、炎癥介質(zhì)等產(chǎn)生的活性氧及其代謝產(chǎn)物增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，當(dāng)產(chǎn)量明顯超過了機(jī)體自身去毒及防御范圍，兩者間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，激活肝臟的免疫細(xì)胞，將最終導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞由單純的脂肪變性向肝細(xì)胞炎癥、壞死以及纖維化方向發(fā)展[6]。第三次打擊是肝臟免疫功能紊亂所導(dǎo)致的肝臟纖維化及肝硬化。

肝臟有豐富的巨噬細(xì)胞，每100 個(gè)肝細(xì)胞中就有20～40 個(gè)巨噬細(xì)胞[7]。巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞，在組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病進(jìn)展中具有不同的天然免疫功能，它們識別、攝取和降解細(xì)胞碎片、外來物質(zhì)或病原體，調(diào)節(jié)代謝紊亂時(shí)的炎癥反應(yīng)，可刺激或消除肝纖維化，是抵御感染和組織損傷的第一道防線。因其來源及微環(huán)境的差異，肝巨噬細(xì)胞功能具有多樣性，因NAFLD 的飲食組成、代謝或炎癥刺激而改變，部分可由異質(zhì)性的巨噬細(xì)胞亞群來解釋，即駐留型巨噬細(xì)胞(Kupffer 細(xì)胞)和浸潤型巨噬細(xì)胞(monocyte derived macrophages,MDMs)，它們在個(gè)體發(fā)育、表型和功能特征上均有區(qū)別[8]。Kupffer 細(xì)胞來源于卵黃囊，駐留在肝竇、門靜脈和肝淋巴結(jié)中[9]，與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞密切接觸[10]，對抗來自腸道的微生物、病原體或異物。在肝損傷時(shí)，血液循環(huán)內(nèi)骨髓原性的單核細(xì)胞——MDMs 與Kupffer 細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同作用[11]。目前認(rèn)為，NASH 患者的肝相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)與相應(yīng)的肝臟病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，通過刺激Kupffer 細(xì)胞分泌促炎介質(zhì)和在肝臟內(nèi)招募白細(xì)胞導(dǎo)致肝臟炎癥[12]。利用模擬代謝疾病的小鼠模型進(jìn)行的多項(xiàng)研究[13-15]表明，肝巨噬細(xì)胞的活化和極化影響NAFLD和NASH 的進(jìn)展。巨噬細(xì)胞的炎癥極化與核心代謝通路的改變有關(guān)，如氧化磷酸化和糖酵解等。一些營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、脂肪酸甚至氧氣都會影響巨噬細(xì)胞的分化或細(xì)胞因子的接收[16]。

NAFLD 的特點(diǎn)是過量的脂肪酸和脂質(zhì)在肝臟中的積累，脂肪細(xì)胞增大促進(jìn)脂肪細(xì)胞破裂，巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的募集和激活，脂肪細(xì)胞因子釋放入循環(huán)進(jìn)入肝臟，導(dǎo)致局部炎癥，增加游離脂肪酸在肝臟中的積累產(chǎn)生脂質(zhì)毒性及胰島素抵抗，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中產(chǎn)生脂質(zhì)毒性應(yīng)激，釋放腫瘤壞死因子相關(guān)性凋亡誘導(dǎo)配體，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[17-19]，從而造成肝損害。同時(shí)，由于高脂攝入，腸上皮通透性增加，腸道屏障破壞，有利于細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物異位至門靜脈，進(jìn)而導(dǎo)致病原體相關(guān)分子模式介導(dǎo)的Kupffer 細(xì)胞活化[20]。在NAFLD 的早期和慢性階段，并不存在明顯的肝細(xì)胞壞死，而巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤是其重要特征，通過清除巨噬細(xì)胞可阻止NASH 進(jìn)程，從而可證明巨噬細(xì)胞在NASH 中的致病作用[21]。炎性巨噬細(xì)胞和星狀細(xì)胞的激活促進(jìn)了脂肪變性向NASH 進(jìn)展[22]。

在NAFLD 中，按照活化狀態(tài)不同，巨噬細(xì)胞可分為M1 型巨噬細(xì)胞(經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞)和M2 型巨噬細(xì)胞(替代活化巨噬細(xì)胞)[23]。M1 型巨噬細(xì)胞以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和γ 干擾素(interferon-γ,INF-γ)信號傳導(dǎo)為主，與促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生有關(guān)，其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子對宿主有很重要的防御作用，但在慢性炎癥的情況下可誘導(dǎo)組織損傷和免疫細(xì)胞激活，發(fā)揮促炎作用[24]。M2 型巨噬細(xì)胞通常通過白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4/13、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號途徑、IL-10 等誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子和生長因子刺激新血管和瘢痕的形成，與傷口愈合和疾病恢復(fù)有關(guān)，對于組織重塑和慢性肝病的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重[25-26]。很多實(shí)驗(yàn)探討巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的的機(jī)制，如對抗LPS 信號傳導(dǎo)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNFα)及還原型輔酶Ⅱ氧化酶從而減輕脂肪肝和炎癥。在一項(xiàng)不同品系小鼠巨噬細(xì)胞激活模式與NASH 易感性差異的研究[15]中發(fā)現(xiàn)，在蛋氨酸膽堿缺乏(methionine-choline-deficient,MCD)飲食喂養(yǎng)4 周建立起NASH 模型，肝臟組織學(xué)顯示有大血管脂肪變性，伴有小葉炎癥、脂肪肉芽腫、肝細(xì)胞凋亡和局灶性壞死。從轉(zhuǎn)氨酶、肝臟組織半定量評估等評估NASH 的嚴(yán)重程度，結(jié)果表明C57BL/6 小鼠比Balb/C 小鼠NASH 程度更重。研究結(jié)果還表明了M1 反應(yīng)在NASH發(fā)生發(fā)展中的重要性，即MCD 誘導(dǎo)的C57BL/6 小鼠肝臟炎癥的增加與M1 的表達(dá)有關(guān)。此外，在無癥狀的早期NASH 中，M1 促炎巨噬細(xì)胞活化是其主要特征，可作為合理的治療靶點(diǎn)[27]。M1/M2 平衡的破壞可能影響巨噬細(xì)胞的發(fā)育、內(nèi)環(huán)境平衡和疾病，在NASH 患者及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)肝巨噬細(xì)胞表型的缺陷，除了吞噬作用外，肝巨噬細(xì)胞還可能刺激機(jī)體的免疫功能。S.S.RENSEN 等[28]研究表明NASH 患者肝活檢中大量沉積不同補(bǔ)體，與肝細(xì)胞凋亡、粒細(xì)胞浸潤和IL-1β、IL-6 和IL-8 的mRNAs 的高表達(dá)有關(guān)，補(bǔ)體級聯(lián)通道通過C3b 和C5b 受體相互作用活化噬菌體及釋放過敏性毒素。這些結(jié)果表明C57BL/6小鼠在肝巨噬細(xì)胞反應(yīng)中的M1 偏倚有助于增加該菌株對NASH 的易感性，遺傳/表觀遺傳因素調(diào)節(jié)噬菌體活化在NAFLD 進(jìn)展為NASH 中至關(guān)重要。在動(dòng)物模型中，消耗或修復(fù)肝巨噬細(xì)胞，因補(bǔ)體C3a 和(或)C5a 缺乏引起的損害會減弱肝臟的再生[29]。肝臟再生由缺陷的巨噬細(xì)胞活化引起，可能需要考慮修復(fù)巨噬細(xì)胞功能刺激再生來用于治療NASH 患者[30]。由此可見，巨噬細(xì)胞的極化與NAFLD、NASH等慢性肝病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展密切相關(guān)。

巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子受多種因素的影響，如模式識別受體或細(xì)胞因子受體激活，以及JUN 氨基末端激酶(JUN amino-terminal kinase,JUK)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)依賴的炎癥基因表達(dá)上調(diào)，及NOD-、LRR-和NLRP3 炎癥小體的形成[31]。大多數(shù)巨噬細(xì)胞表達(dá)多種模式識別受體，其中TLRs 是迄今為止最好的特征。TLR-4、TLR-2 和TLR-9 被證明能觸發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)，并被脂質(zhì)、氧化產(chǎn)物和受損肝細(xì)胞所釋放的分子所激活。當(dāng)LPS 激活TLR4 信號通路時(shí)，CD14 激活Kupffer 細(xì)胞，增加了細(xì)胞對LPS 的敏感性。其他TLRs 特異性識別危險(xiǎn)信號如細(xì)菌肽聚糖、鞭毛蛋白、游離DNA 或線粒體DNA[32]。TLR9 識別游離線粒體DNA。受損肝細(xì)胞釋放的微粒中包含線粒體DNA，NASH 患者血清中線粒體DNA 水平升高。巨噬細(xì)胞可以通過TLR9 識別線粒體DNA，缺乏TLR9 的小鼠可以避免高脂肪飲食引起的肝損傷[33]。研究[34]發(fā)現(xiàn)，與食物控制組分離的線粒體DNA 相比，從NASH 小鼠中分離的Kupffer 細(xì)胞線粒體DNA 可誘導(dǎo)更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。表明Kupffer 細(xì)胞可以通過TLR9 識別線粒體DNA，從而感知肝損傷的嚴(yán)重程度。TNF-α 通過促進(jìn)骨髓來源的單核細(xì)胞浸潤而被證明是NASH 的重要因素，通過死亡受體激活細(xì)胞凋亡和壞死，并通過NFκB 通路介導(dǎo)炎癥信號[35]，維持組織中單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的生存及平衡[36]，在NASH 的發(fā)展過程中起著重要作用。此外，肝巨噬細(xì)胞招募CD4+T 細(xì)胞進(jìn)入肝臟，然后通過INF-γ 及CD40L 激活肝巨噬細(xì)胞導(dǎo)致NASH 進(jìn)展。NF-κB、MAPK、ERK 1、p38、JNK和IRF3 信號通路也被證明參與激活Kupffer 細(xì)胞的過程[37]。

Kupffer 細(xì)胞具有免疫原性，在正常情況下表現(xiàn)為M2 樣表型并表達(dá)多種受體，與肝竇內(nèi)的多種免疫細(xì)胞相互作用，包括T 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和先天淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化和產(chǎn)生有效的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)。由于長期的肝細(xì)胞脂質(zhì)積聚，Kupffer 細(xì)胞被激活，驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞，一旦向M1 表型激活，就會釋放大量的炎性細(xì)胞因子和趨化因子。單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞主要通過CCL2-CCR2 軸進(jìn)入肝臟[38]。缺乏膽堿的氨基酸所致的脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤和肝纖維化增加了CCL2 及其受體的表達(dá)[39]?；诖?，促使了對這些途徑的藥物抑制劑進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)研究[40]。C.BAECK 等[41-42]發(fā)現(xiàn)mNOX-E36 通過結(jié)合抑制CCL2，減少了NASH 小鼠肝內(nèi)巨噬細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子的含量，改善了MCD 飲食小鼠的肝臟脂肪變性，靶向肝巨噬細(xì)胞是治療肝臟疾病的一種很有前途的方法。最近有報(bào)道[43-44]，雙CCR2/CCR5 拮抗劑西尼維羅能顯著減少纖維化和NAFLD 活性評分，肯定了巨噬細(xì)胞在NAFLD 中的作用。

肝巨噬細(xì)胞參與NAFLD 的進(jìn)展過程，但目前在靶向人肝巨噬細(xì)胞方面仍有很多難題有待克服。首先，必須區(qū)分老鼠模型和人類模型之間的差異，盡管它們之間有很大的相似之處，但小鼠的實(shí)驗(yàn)條件與人類疾病不同。NAFLD 和NASH 的分子機(jī)制中仍有許多問題值得探討，通過進(jìn)一步研究，巨噬細(xì)胞有望成為治療NAFLD 和NASH 的新靶點(diǎn)。