注射用肉毒毒素制劑及其研發(fā)進(jìn)展

屈見聞，潘 博，趙雪蓮

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院整形七科，北京，100144；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院整形外科，石家莊 河北，050000）

自1979年Scott[1]首次將A型肉毒毒素應(yīng)用于矯正眼外肌失衡作為斜視手術(shù)的替代方法以來(lái)，注射肉毒毒素已成為各種局灶性肌張力障礙的治療選擇。1987年，加拿大眼科醫(yī)生Jean Carruthers在注射肉毒毒素治療眼瞼痙攣時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)眉間紋消失了。她和她的丈夫皮膚科醫(yī)生Alastair Carruthers于1996年發(fā)表了一份關(guān)于肉毒毒素在美容中應(yīng)用的報(bào)告[2]。1992年，Schantz和Scott公布了A型肉毒毒素治療皺紋的用途。自那以后，開啟了肉毒毒素在美容整形領(lǐng)域的開創(chuàng)性治療，包括消除額肌紋、魚尾紋、頸闊肌紋、提眉、治療咬肌肥大、改善面部輪廓、腿部塑形等[3-5]。肉毒毒素注射已成為中國(guó)最受歡迎的美容手段之一，本文概述了注射用肉毒毒素的作用機(jī)制，目前美國(guó)和中國(guó)上市肉毒毒素制劑，以及肉毒毒素制劑的研發(fā)進(jìn)展。

1 肉毒毒素的作用機(jī)制

肉毒毒素是由肉毒桿菌(Clostridium botulinum)分泌的神經(jīng)毒素、外毒素，共有A-G七種血清型，盡管各種類型毒素的氨基酸序列和免疫性存在差異，但它們均顯示出相似的分子結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞水平上，細(xì)菌分泌的毒素復(fù)合物包括肉毒毒素分子和非毒素蛋白（血凝素蛋白和非血凝素蛋白）。其中非毒素蛋白可以穩(wěn)定復(fù)合物中的毒素分子，同時(shí)防止其吸收時(shí)被消化酸變性[6]。事實(shí)上，復(fù)合物中起主要作用的是約150kDa無(wú)活性的單鏈多肽，其進(jìn)入機(jī)體后被活化成分子量為100kDa重鏈(High chain,HC)和50kDa的輕鏈(Light chain,LC)，兩者通過(guò)二硫鍵、非共價(jià)相互作用以及由重鏈N端組成的獨(dú)特片段圍繞球形的輕鏈結(jié)構(gòu)域相連接[7]。

最新研究表明，肉毒毒素作用機(jī)制大致分為5個(gè)過(guò)程[8]：①結(jié)合：通過(guò)消化道吸收或者局部注射的肉毒毒素進(jìn)入血液循環(huán)后，迅速來(lái)到神經(jīng)末梢突觸間隙，依靠H鏈的C端，與神經(jīng)節(jié)苷脂受體和突觸小泡腔中的受體結(jié)合[9]；②內(nèi)吞：毒素通過(guò)內(nèi)吞作用形成突觸小泡進(jìn)入神經(jīng)末梢；③移位：內(nèi)吞體內(nèi)pH下降，毒素變構(gòu)，借助重鏈的N端在內(nèi)吞體膜形成通道，將輕鏈結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿，此時(shí)依然通過(guò)二硫鍵保持連接[10]；④釋放：在硫氧還原蛋白還原酶-硫氧還原蛋白系統(tǒng)(Thioredoxin reductase-thioredoxin system,TrxR-Trx)作用下，兩條鏈分離，釋放輕鏈至胞漿[11]；⑤裂解：輕鏈裂解可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE蛋白)，阻礙乙酰膽堿胞吐的發(fā)生。輕鏈為一種Zn2+依賴性的蛋白內(nèi)切酶，可以裂解囊泡與質(zhì)膜融合過(guò)程中關(guān)鍵的三種SNARE蛋白，即突觸融合蛋白(Syntaxin)、SNAP-25(Synaptosomal-associated protein of 25kDa)和突觸囊泡蛋白(Synaptobrevin/VAMP)，導(dǎo)致乙酰膽堿釋放障礙，從而引起神經(jīng)麻痹[12]。因此，微小劑量的肉毒毒素能夠治療由功能亢進(jìn)的神經(jīng)末梢引起的疾病。

肉毒毒素在靶肌肉中的作用隨著時(shí)間的推移而減弱，神經(jīng)和肌肉之間的信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)逐漸恢復(fù)。事實(shí)上，目前尚不清楚毒素是如何從神經(jīng)末梢代謝或以何種方式被清除的，對(duì)于毒素的吸收、分布、代謝和消除機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍沒有完全掌握。有學(xué)者認(rèn)為，毒素不可逆地與突觸末梢結(jié)合后，這種蛋白會(huì)逐漸被人體降解，功能輕鏈從神經(jīng)終板清除[13]，從而失去療效。亦有人認(rèn)為，SNAP-25再生或終板旁生新芽形成新的神經(jīng)聯(lián)接[14,15]，使神經(jīng)肌肉的信號(hào)傳導(dǎo)和肌肉收縮力得以恢復(fù)。文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)，肉毒毒素用于面部除皺治療的持續(xù)時(shí)間大多數(shù)為3至4個(gè)月，偶爾也可達(dá)到6個(gè)月[16]。為達(dá)到理想治療效果，患者一年內(nèi)需多次注射以保持一定程度的改善，不僅增加治療費(fèi)用，也減弱了其便捷性。因此，科學(xué)家們?cè)诓粩嗵剿鞒掷m(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、效果更佳、安全性更高的新型肉毒素。

隨著BoNT/A適應(yīng)癥進(jìn)一步擴(kuò)大，制劑的抗原性問題變得越來(lái)越重要。關(guān)于BoNT/A誘導(dǎo)的免疫原性問題備受爭(zhēng)議，然而，已經(jīng)有許多治療失敗的報(bào)道和BoNT/A誘導(dǎo)的中和抗體的觀察[17]。研究發(fā)現(xiàn)，毒素復(fù)合物中的蛋白如血凝素可作為佐劑，增加機(jī)體對(duì)制劑注射的免疫反應(yīng)。例如，血凝素-33是一種高度免疫反應(yīng)性的神經(jīng)毒素相關(guān)蛋白，可激活樹突細(xì)胞啟動(dòng)免疫反應(yīng)[18]，去除血凝素-33可最大限度地降低免疫原性?？贵w的形成是一個(gè)令人擔(dān)憂的問題，這可能導(dǎo)致隨著時(shí)間的推移療效下降，甚至治療無(wú)反應(yīng)[19]。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期使用A型肉毒毒素治療超過(guò)10年以上的患者，體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體的發(fā)病率高達(dá)13.9%[20]。若患者對(duì)毒素復(fù)合物形成中和抗體后，再次注射時(shí)需要使用更大量的毒素才能達(dá)到同樣的療效，這種情況必須更加謹(jǐn)慎注射，以防大量毒素釋放入血引起肉毒毒素中毒[21]。

2 美國(guó)和中國(guó)上市的注射用肉毒毒素制劑

用于醫(yī)學(xué)治療的肉毒毒素主要為A型和B型，A型作用持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，而B型起效時(shí)間更快。目前，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)4種在售的肉毒毒素制劑，包括3種A型肉毒毒素OnabotulinumtoxinA,IncobotulinumtoxinA,AbobotulinumtoxinA和1種B型肉毒毒素RimabotulinumtoxinB。中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)上市的是OnabotulinumtoxinA，CBTX-A，以及2020年批準(zhǔn)的AbobotulinumtoxinA和韓國(guó)Hugel公司生產(chǎn)的注射用A型肉毒毒素。

2.1 OnabotulinumtoxinA (Botox;Allergan,Inc.,Irvine,CA,USA)

Botox，中文名為保妥適，是一種無(wú)菌、凍干粉形式的A型肉毒毒素。主要用于治療眼瞼痙攣、面肌痙攣及相關(guān)局灶性肌張力障礙，同時(shí)也可以暫時(shí)改善成人中度至重度的眉間紋。Botox由C botulinum細(xì)菌的Hall株產(chǎn)生，并在含有N-Z胺和酵母提取物的特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共有每瓶50U，100U和200U三種規(guī)格，每100U中包含0.5 mg的人血白蛋白和0.9 mg的氯化鈉。最初，由于擔(dān)心毒素的熱穩(wěn)定性，在復(fù)原之前將藥瓶保存在冰箱中。但是證據(jù)表明，在使用前可以在冷藏溫度下安全存放至少36個(gè)月[22]。

2.2 AbobotulinumtoxinA (Dysport;Ipsen Limited,Slough Berkshire,UK)[23]

Dysport，中文名為吉適，是美國(guó)FDA在2009年批準(zhǔn)的第二種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑[24]，于2020年中國(guó)獲批。自1990年以來(lái)，該制劑已在70多個(gè)國(guó)家/地區(qū)成功使用[25]。Dysport有300U和500U兩種規(guī)格，每500U中包含0.125 mg人血白蛋白和2.5 mg乳糖。Dysport與Botox在單位、化學(xué)性質(zhì)、生物活性、重量等方面都不同。因此，這兩種劑型不具有互換性，給藥也不能基于單一的轉(zhuǎn)化率。最近證據(jù)表明Dysport:Botox接近2.5:1對(duì)治療除皺有效[26]。與所有神經(jīng)毒素一樣，總體建議是使用毒素的量與肌肉肥大的程度相匹配，以達(dá)到預(yù)期效果。

2.3 IncobotulinumtoxinA (Xeomin;Merz Pharmaceuticals GmbH,Frankfurt,Germany)[27]

Xeomin是于2011年獲得FDA的批準(zhǔn)A型神經(jīng)毒素，用于治療慢性流涎、上肢痙攣、頸部肌張力障礙、眼瞼痙攣和眉間紋。共有50U和100U兩種規(guī)格，每100U中包含1 mg人血白蛋白和4.7mg蔗糖。Xeomin的純化過(guò)程將毒素從復(fù)合蛋白中分離出來(lái)，最終得到僅含有150 kDa活性成分的凍干產(chǎn)品[28]。因此，理論上它的免疫原性較小，降低了中和抗體產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)[29]。如果療程中需要注射大劑量肉毒毒素時(shí)，Xeomin具有一定優(yōu)勢(shì)。

2.4 RimabotulinumtoxinB (Myobloc/NeuroBloc;Solstice Neurosciences Inc.,CA,USA)[30]

Myobloc是美國(guó)目前唯一可用的B型肉毒毒素。臨床應(yīng)用幾乎僅限于神經(jīng)肌肉疾病，包括頸部肌張力障礙，不過(guò)它已經(jīng)成功地用于說(shuō)明書注明以外的面部動(dòng)態(tài)皺紋治療[31]。Myobloc是一種非凍干和穩(wěn)定的液體制劑，規(guī)格有2500U/0.5mL，5000U/mL和10000U/2mL，其中每2500U/0.5mL中包含0.235mg人血白蛋白、2.9mg氯化鈉和1.35mg琥珀酸鈉。與療效可以持續(xù)3至4個(gè)月的A型肉毒毒素相比，Myobloc起效更快，但作用持續(xù)時(shí)間更短（約2個(gè)月）[32]，而且由于溶液的酸堿度呈酸性，注射時(shí)可能會(huì)引起疼痛，有一定的不適感。Myobloc與A型肉毒毒素?zé)o交叉反應(yīng)，可有效地用于接受大劑量毒素且對(duì)A型肉毒素?zé)o反應(yīng)或產(chǎn)生中和抗體的患者[33]。

2.5 CBTX-A (Prosigne/Lantox/Redux;Lanzhou Biological Products Institute,Lanzhou,China)

CBTX-A，商品名為衡力，是由中國(guó)蘭州生物制品研究所生產(chǎn)，活性成分為A型肉毒結(jié)晶毒素，生產(chǎn)用菌種為產(chǎn)毒力高的A型肉毒梭菌Hall株。每瓶含A型肉毒毒素50U或100U，輔料為蔗糖、右旋糖苷、明膠。相對(duì)于同體人血白蛋白，明膠為異體蛋白，需警惕過(guò)敏反應(yīng)。CBTX-A主要用于治療眼瞼痙攣，面肌痙攣等成人患者及某些斜視，特別是急性麻痹性斜視，對(duì)于改善眉間紋也有一定的療效[34]。CBTX-A在≤8 ℃條件下可以保存3年，在室溫保存期限為6個(gè)月，藥品復(fù)溶后在2～8 ℃無(wú)菌條件可保存6天[35]。

2.6 LetibotulinumtoxinA (Botulax/Letybo;Hugel Inc.,Gangwon-do,Republic of Korea)

Letybo，中文名稱為樂提葆，韓國(guó)生物制藥公司Hugel生產(chǎn)的注射用A行肉毒毒素，于2020年獲得中國(guó)批準(zhǔn)。生產(chǎn)菌種為肉毒梭菌CBFC26[36]，有效成分為900kDa肉毒毒素，賦形劑為氯化鈉和人血白蛋白，規(guī)格為100U/瓶，儲(chǔ)存條件在2-8℃。目前主要用于治療成人原發(fā)性眼瞼痙攣，中風(fēng)后上肢痙攣，2歲以上腦癱患兒動(dòng)態(tài)馬蹄足畸形，以及暫時(shí)改善與皺眉肌相關(guān)的皺紋，和成年人眼輪匝肌活動(dòng)相關(guān)的眼部皺紋[37]。

雖然不同形式的肉毒毒素顯示出相似的效果，但每種產(chǎn)品都有獨(dú)特的制造工藝、賦形劑、配方等，且每種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑都有一條非平行的劑量-反應(yīng)曲線，這意味著它們的相對(duì)性能在一系列劑量比范圍內(nèi)并不一致[38]。因此，它們并不具有生物同一性。一種給定單位的毒素劑量與另一種毒素的轉(zhuǎn)化并非恒定的。臨床醫(yī)生必須徹底了解每種產(chǎn)品的特性和臨床性能，充分考慮患者的個(gè)性化需求，結(jié)合治療區(qū)域和適當(dāng)劑量，以實(shí)現(xiàn)安全有效地使用。

3 研發(fā)進(jìn)展

3.1 新型制劑

多數(shù)具有藥理作用的蛋白質(zhì)具有粘附于固體表面的特性，在將其注入容器中時(shí)，部分蛋白質(zhì)會(huì)粘附于容器內(nèi)壁而造成活性成分的損失。同時(shí)，蛋白質(zhì)易被氧化或被降解成小片段。因此商品化肉毒毒素制劑除包含純毒素分子或毒素復(fù)合物外，還添加了一種或多種賦形劑，如蛋白、離子化合物、糖等。蛋白主要指人血清白蛋白或明膠。然而，它們是動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)，有攜帶血液中病原體而引發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)。部分患者可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)，在重復(fù)注射后引起過(guò)敏[39]。

DaxibotulinumtoxinA for injection (DAXI/RT002,Revance Therapeutics,Inc,Newark,CA)，一款新研發(fā)的注射用A型肉毒素，不含人血白蛋白，避免了上述不良反應(yīng)的產(chǎn)生。其主要成分為純化的150 kDa神經(jīng)毒素，與凍干粉中的專利肽一起配制[40]。該肽具有帶正電荷的賴氨酸主鏈，可以與負(fù)電荷的核心神經(jīng)毒素靜電結(jié)合，并允許在沒有人血清白蛋白的情況下配制DAXI，且保證其重構(gòu)前的穩(wěn)定性和作用效果[41]。此外，已證明該肽可提供高親和結(jié)合力，從而限制了注射后肉毒毒素的擴(kuò)散，表現(xiàn)出更長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間。對(duì)小鼠腓腸肌分別注射DAXI和Botox后測(cè)定肌肉麻痹結(jié)果顯示，兩者具有相同效力，且相鄰脛骨前肌的肌肉麻痹結(jié)果表明DAXI的擴(kuò)散明顯較少。當(dāng)使用既定劑量分別注射兩種制劑時(shí)，DAXI的作用持續(xù)時(shí)間可延長(zhǎng)58%至100%[42]。此前人們認(rèn)為，毒素復(fù)合物的分子大小決定了它在組織中的擴(kuò)散能力，然而實(shí)驗(yàn)研究表明，擴(kuò)散系數(shù)與毒素復(fù)合物的大小無(wú)關(guān)[43]。目前已開展了使用DAXI治療眉間紋的1-3期臨床試驗(yàn)[44-46]，結(jié)果顯示注射40U DAXI患者耐受性好，且具有最有利的風(fēng)險(xiǎn)-效益比，與20U Botox相比，表現(xiàn)出更高的應(yīng)答率和更長(zhǎng)的應(yīng)答持續(xù)時(shí)間[47]。同時(shí)，DAXI治療皺紋嚴(yán)重程度恢復(fù)至基線的中位時(shí)間≥24周[48]。因此，其極有可能成為持續(xù)時(shí)間為6個(gè)月甚至更久的長(zhǎng)效注射用A型肉毒毒素。

3.2 液體組合制劑

肉毒毒素分離的過(guò)程由一系列酸制劑產(chǎn)生，形成由活性毒素和血凝素蛋白組成的結(jié)晶復(fù)合體。然后將該制劑重新溶解在鹽水和蛋白中，消毒真空干燥，以凍干粉形式保存及運(yùn)輸。凍干或冷凍干燥的過(guò)程，是指先將物質(zhì)凍結(jié)，然后降低周圍壓力，使凍結(jié)凝固的水升華為氣相，這種方法可以最大限度降低由高溫引起的蛋白質(zhì)變性風(fēng)險(xiǎn)。然而通過(guò)凍干等方式制備的干粉制品，需要在使用前進(jìn)行重新溶解，使用時(shí)不方便。為了保證作用效果，需要仔細(xì)配制準(zhǔn)確的濃度，溶解過(guò)程中存在稀釋造成毒素量的偏差。Botox制造商Allergan建議將不含防腐劑的生理鹽水緩慢注射到制劑小瓶中，通過(guò)緩慢旋轉(zhuǎn)小瓶將肉毒毒素與鹽水混合，避免劇烈攪拌，溶解后需保存在2℃至8℃之間，且24小時(shí)內(nèi)使用[22]。有些人認(rèn)為，泡沫的形成和劇烈攪拌可能會(huì)使肉毒毒素溶液易受氣泡引起的表面變性，或氣泡可能會(huì)導(dǎo)致毒素分散在小瓶表面從而影響療效。此外，稀釋過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致污染[49]。因此，對(duì)能夠改善便利性無(wú)需重新溶解，且能夠保證毒素穩(wěn)定有效的液體組合制劑的需求不斷增長(zhǎng)。研究者通過(guò)將一些賦形劑，如離子化合物、糖、聚山梨酯、糖醇等與毒素按不同比例組合，可以增強(qiáng)制劑的熱穩(wěn)定性，增加溶解度，還可以減少聚集程度，在液態(tài)下穩(wěn)定毒素分子并防止其變性。不僅可在常溫以上的高溫下維持肉毒毒素的活性，還可以維持長(zhǎng)期的貯存穩(wěn)定性。

3.3 工程化肉毒毒素

目前，市售肉毒毒素均通過(guò)培養(yǎng)天然肉毒桿菌，隨后進(jìn)行一系列分離和純化毒素復(fù)合體來(lái)生產(chǎn)的，這種方式過(guò)程復(fù)雜且蛋白產(chǎn)量低。在下一代測(cè)序和重組技術(shù)的時(shí)代，基因工程重組蛋白的生產(chǎn)達(dá)到了新高度。通過(guò)將BoNT的DNA編碼部分（開放閱讀框）整合到大腸桿菌或其他微生物中，帶有BoNT開放閱讀框的微生物隨后產(chǎn)生毒素蛋白[43]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)允許使用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。生物安全風(fēng)險(xiǎn)也沒有培養(yǎng)肉毒桿菌大，因?yàn)橛糜诋愒幢磉_(dá)的大腸桿菌菌株沒有致病性。這將為BoNT及其他神經(jīng)毒素的轉(zhuǎn)基因提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化和更安全的生產(chǎn)過(guò)程[50]。事實(shí)上，構(gòu)建全功能重組BoNT絕非易事，其中一個(gè)重要因素是成熟蛋白的雙鏈結(jié)構(gòu)。如前所述，雖然最終發(fā)揮毒素效應(yīng)的是輕鏈，單鏈BoNT蛋白也能夠進(jìn)入神經(jīng)元并在一定程度上抑制囊泡釋放，但它們的效力較低。此外，在不存在重鏈的情況下，分離的輕鏈在水溶液中難以溶解，且易受到蛋白水解酶降解。可見，雙鏈的二肽形式是BoNT發(fā)揮完全神經(jīng)毒素所必需的[51]。這就要求保留連接兩條鏈的二硫鍵、結(jié)構(gòu)域，同時(shí)保證兩者之間正確的折疊。因此，在體外單獨(dú)表達(dá)并將純化的重鏈和輕鏈生產(chǎn)活性雙鏈的過(guò)程是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

3.4 透皮給藥

目前臨床上使用的肉毒毒素制劑均為注射給藥，然而注射伴隨一些副作用，例如注射部位的刺激、炎癥、感染、出血等。對(duì)于多汗癥等情況，可能需要在敏感部位（如手掌或腋窩）進(jìn)行多次皮下注射，導(dǎo)致患者不適甚至疼痛。透皮給藥系統(tǒng) (Transdermal drug delivery system,TDDS)作為一種非侵入性治療方法，通過(guò)在皮膚表面給藥，使藥物以近似恒定的速率進(jìn)入皮膚，產(chǎn)生全身或局部治療效果，具有良好的順應(yīng)性及非創(chuàng)傷給藥的特點(diǎn)，成為目前研發(fā)的重點(diǎn)。從凝膠、乳膏、軟膏到即用型貼劑，增加了便利性，并減少了注射造成的不適。但由于生物屏障的限制及毒素分子量過(guò)大，難以透過(guò)皮膚，故需借助載體或外界設(shè)備透過(guò)皮膚屏障。目前正在開發(fā)的無(wú)針法遞送藥物的范圍相對(duì)淺表，尚不能替代那些涉及到使用BoNT治療深層肌肉運(yùn)動(dòng)障礙的注射方法。此外，這種方法缺乏靶向性，存在進(jìn)入任何細(xì)胞的可能，會(huì)增加非特異性毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

3.4.1 細(xì)胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides,CPPs)

CPPs主要指來(lái)源于不同生物的短肽，具有共價(jià)或非共價(jià)附著到大分子（包括肽、蛋白質(zhì)、核酸等）上的能力，并攜帶它們穿過(guò)細(xì)胞膜，而不發(fā)生任何構(gòu)象變化[52]。常見的CPPs有HIV-TAT的多肽片段、觸角足突變(Antennapedia)?；罴?xì)胞攝取CPPs的確切機(jī)制仍不清楚，目前推測(cè)與能量無(wú)關(guān)的細(xì)胞膜“直接轉(zhuǎn)運(yùn)”和能量依賴的“胞吞作用介導(dǎo)的易位”有關(guān)[53]。Saffarian等[54]通過(guò)將BoNT/A輕鏈與TAT肽共價(jià)連接，構(gòu)建了一種重組蛋白TAT-BoNT/A(1-448)。用BoNT/A輕鏈代替全蛋白來(lái)降低最終分子大小，增加了皮膚吸收的可能性。通過(guò)在小鼠皮膚表面上局部施用含TAT-BoNT/A溶液，免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)顯示30分鐘后觀察到了蛋白滲透的跡象，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平隨著時(shí)間的推移而增加。高效液相色譜分析表明，這種重組蛋白的生物活性是BoNT/A(1-448)蛋白的1.5倍。因此，他們認(rèn)為TAT-BoNT/A具有生物活性，與作為對(duì)照的BoNT/A(1-448)相比，可以在體外和體內(nèi)成功地通過(guò)活細(xì)胞傳遞，且更有效。Revance公司正在開發(fā)一種外用產(chǎn)品RT001（A型肉毒毒素凝膠）[55]，由純化的150kDa BoNT/A蛋白組成，配制在含有基于CPP的滲透增強(qiáng)肽賦形劑RTP004的泊洛沙姆(Poloxamer)凝膠中。隨后，開展了一系列2期研究證明RT001在治療中度至重度外側(cè)魚尾紋或多汗癥方面是安全有效的[56]。2015年，Revance宣布已開始在一項(xiàng)3期關(guān)鍵研究中對(duì)患者進(jìn)行給藥，以評(píng)估RT001治療外側(cè)魚尾紋的安全性和有效性。然而該研究未達(dá)到其共同主要終點(diǎn)，因此停止了進(jìn)一步的開發(fā)計(jì)劃[57]。

3.4.2 納米技術(shù)

許多機(jī)構(gòu)正在研發(fā)出能夠幫助大分子和小分子藥物滲透到完整皮膚中的納米粒子。Chajchir等[58]報(bào)道了一種BoNT/A乳霜制劑(CosmeTox)，每毫升含有2U BoNT/A。這種新的藥物遞送方法基于小于1-10nm的混合膠束離子納米粒子技術(shù)(Ionic nanoparticle technology,InParT)，該技術(shù)將活性分子封裝在載體中，以增加其在皮膚中的生物利用度。Chajchir等希望將其用于治療那些害怕針頭和不想注射的人，或那些想延長(zhǎng)肉毒毒素注射效果的人，在注射治療后長(zhǎng)期使用這種乳膏作為維持治療，以減緩皺紋再次形成的過(guò)程。他們隨機(jī)選擇了40名女性受試者，每天晚上在面部、下巴和頸部外用CosmeTox或安慰劑霜，連續(xù)使用4-7周。使用CosmeTox的受試者整個(gè)過(guò)程總計(jì)外用BoNT/A可達(dá)50-70U。根據(jù)患者報(bào)告的面部線條結(jié)果評(píng)分問卷結(jié)果顯示，CosmeTox可以顯著改善面部特征和年齡外觀。然而由于使用固定的BoNT/A劑量非常低，這一結(jié)果令人驚訝，而且試驗(yàn)結(jié)果是根據(jù)患者主觀感受填寫問卷，制劑的真實(shí)療效還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4.3 借助外界設(shè)備

當(dāng)含有小分子的液體置于弱電流下時(shí)，分子可獲得容易穿透完整皮膚表面的能力，這種技術(shù)稱為離子電滲療法(Iontophoresis)。通過(guò)這種方法，許多具有小分子、表面極性和適當(dāng)水溶性的藥物可以安全無(wú)痛地輸送到皮膚中。BoNT/A為負(fù)電荷水溶性藥物，滿足離子導(dǎo)入的條件。Kavanagh等[59]利用離子電滲裝置(Iomed Phoresor II) 輔助BoNT/A透過(guò)皮膚，對(duì)這兩名嚴(yán)重手多汗癥患者進(jìn)行治療。當(dāng)用淀粉碘試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，治療結(jié)果令人滿意，甚至接近于注射型肉毒毒素(約70%)，證明了離子電滲確實(shí)可以成功地輸送肉毒毒素。然而，存在一些限制，包括該方法中使用的設(shè)備成本相對(duì)較高，長(zhǎng)期和高頻率的治療周期增加了最終成本，另一方面，增加了皮膚過(guò)敏的可能性[60]。

經(jīng)皮氣動(dòng)噴射(Transcutaneous pneumatic injection,TPI)是指根據(jù)治療目的調(diào)節(jié)滲透壓力和溶液體積，將特定溶液微創(chuàng)但強(qiáng)力地輸送到皮膚中。Kim等[61]報(bào)告了一種利用壓力和劑量控制、無(wú)針、經(jīng)皮氣動(dòng)噴射法治療腋窩和掌跖多汗癥。在局部應(yīng)用麻醉乳膏后，使用TPI裝置(Shemax?;Shenb Co.,Ltd)在2.05巴（壓強(qiáng)單位）下以0.08mL/shot將含有BoNT/A溶液噴射至治療區(qū)域，通過(guò)淀粉碘測(cè)試結(jié)果和多汗癥疾病嚴(yán)重程度量表評(píng)分來(lái)評(píng)估其功效。研究表明低濃度BoNT/A可以有效且安全地治療了腋窩和掌跖多汗癥，利用二維超聲發(fā)現(xiàn)BoNT/A在腋窩和掌跖皮膚的整個(gè)真皮和真皮-皮膚脂肪連接處產(chǎn)生了界限分明的浸潤(rùn)區(qū)。然而，這項(xiàng)研究參與者少，隨訪時(shí)間短，缺乏對(duì)照組，并且沒有評(píng)估出汗的客觀指標(biāo)。因此，需要在更大的人群中進(jìn)一步證實(shí)其安全性和有效性。此外，沒有可靠的組織學(xué)證據(jù)證明BoNT/A在噴射后滲透到活的皮膚組織內(nèi)?？紤]到BoNT/A全蛋白的大尺寸(150kDa)，它不太可能通過(guò)具有選擇性滲透性的皮膚細(xì)胞膜，如果正如作者所述，應(yīng)該進(jìn)一步解釋和探究BoNT/A進(jìn)入皮膚的分子機(jī)制。

此外，也有將低頻超聲、X射線、核磁共振等與BoNT透皮給藥相結(jié)合[62]，這些方法將進(jìn)一步擴(kuò)大肉毒毒素在醫(yī)學(xué)美容領(lǐng)域的應(yīng)用。

4 結(jié)論

肉毒毒素的使用為許多疾病提供了替代治療方案，也為整形美容行業(yè)帶來(lái)了巨大改變。市場(chǎng)上各類產(chǎn)品由于其不同的生產(chǎn)過(guò)程和條件，在單位、化學(xué)性質(zhì)、生物活性和重量方面有所不同，因此不可簡(jiǎn)單地互換。為了安全的臨床實(shí)踐，并獲得最佳療效，從業(yè)者必須徹底了解每種制劑的特性、規(guī)格、轉(zhuǎn)化率和安全性（毒素?cái)U(kuò)散和免疫原性）等臨床問題。此外，各大機(jī)構(gòu)也在加快研發(fā)新興產(chǎn)品，新型制劑展現(xiàn)出巨大潛能，如提供更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間、更優(yōu)的治療效果、更少的不良反應(yīng)，甚至是更多樣化的給藥途徑。雖要拋棄新鮮事物“猛于虎”的思想，也應(yīng)對(duì)其臨床應(yīng)用的可行性進(jìn)行全面地評(píng)價(jià)。隨著對(duì)毒素作用機(jī)制的更好理解和生物技術(shù)的進(jìn)步，相信未來(lái)的產(chǎn)品會(huì)為患者提供更多的選擇。