絲素支架在肌肉骨骼組織工程的應(yīng)用及研究進(jìn)展

李艾元 施心雨 岳萬(wàn)福

摘要：?肌肉骨骼系統(tǒng)包括骨骼、軟骨和骨骼肌肉，由于臨床修復(fù)和再生的迫切需求，其已經(jīng)成為組織工程研究的主要目標(biāo)。肌肉骨骼組織工程支架性能主要取決于支架播種的細(xì)胞和材料的結(jié)構(gòu)。絲素蛋白組織工程支架的基本功能是將生長(zhǎng)因子和種子細(xì)胞輸送到目標(biāo)部位，以幫助損傷部位的修復(fù)與再生。絲素蛋白存在較好的生物相容性、可調(diào)節(jié)的生物降解性及優(yōu)異的機(jī)械性而被認(rèn)為是理想的材料。文章首先介紹了絲素支架在人類(lèi)健康領(lǐng)域的重要性，其次介紹了支架材料的發(fā)展現(xiàn)狀，然后論述了不同形式（如薄膜、顆粒、電紡纖維、水凝膠、三維多孔腳手架）制造絲素蛋白仿生支架方面的最新研究，以及它們?cè)诩∪夤趋澜M織再生方面的應(yīng)用。最后，展望了絲素蛋白支架的未來(lái)發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：

支架;支架材料;肌肉骨骼組織工程;絲素蛋白;再生醫(yī)學(xué);生物相容性

中圖分類(lèi)號(hào)： R318.08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)： 10017003（2021）11001805

引用頁(yè)碼： 111104

DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2021.11.004

Application and research progress of silk fibroin scaffold in musculoskeletal tissue engineering

LI Aiyuan， SHI Xinyu， YUE Wanfu

（College of Animal Science and Technology·College of Veterinary Medicine， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China）

Abstract：

Musculoskeletal system including bone， cartilage and skeletal muscle， has become the primary target of tissue engineering research due to the urgent need for clinical repair and regeneration. The performance of musculoskeletal tissue engineering scaffolds mainly depends on the fabrication and structure of cells and materials seeded on scaffolds. The fundamental function of silk fibroin tissue engineering scaffolds is to transport growth factors and cells to the target sites for facilitating the repair and regeneration of the injuries. Silk fibroin is considered to be an ideal material for its good biocompatibility， adjustable biodegradability and excellent mechanical properties. This paper firstly introduces the importance of silk fibroin in human health and the development status of scaffold materials， and then elaborates the latest research on the manufacturing of silk cellulose biomimetic scaffolds in various forms， such as films， granules， electrospun fibers， hydrogels， and three-dimensional porous scaffolds， as well as their applications in musculoskeletal tissue regeneration. In the end of this paper， the future development direction of silk fibroin scaffolds is prospected.

Key words：

scaffold; scaffold material; musculoskeletal tissue engineering; silk fibroin; regenerative medicine; biocompatibility

基金項(xiàng)目： 浙江省高等學(xué)校訪問(wèn)學(xué)者教師專業(yè)發(fā)展項(xiàng)目（2035170004）;浙江省科技廳湖羊肉用發(fā)展項(xiàng)目（2045210034）;農(nóng)業(yè)部中蜂高效健康養(yǎng)殖集成及示范推廣項(xiàng)目（2060570001）

作者簡(jiǎn)介： 李艾元（1995），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物學(xué)。通信作者：岳萬(wàn)福，副教授，yuewanfuzju@aliyun.com。

過(guò)度運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)不當(dāng)造成的器官損傷、功能衰竭是威脅人類(lèi)健康的一個(gè)原因[1]，每年有數(shù)百萬(wàn)病人死于器官疾病。肌肉骨骼組織包括骨骼、軟骨、肌腱、韌帶和骨骼肌肉，很容易受傷造成不可逆的影響[2]。然而，這些組織的恢復(fù)能力差，通常導(dǎo)致疼痛，關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致殘疾。在臨床治療方法上，通常是用正常組織或器官替換受損部位[3]。人們面臨的關(guān)鍵問(wèn)題是供體短缺，并且這種現(xiàn)象還會(huì)長(zhǎng)期存在。同時(shí)，這種持續(xù)的現(xiàn)實(shí)性推動(dòng)了組織工程的發(fā)展[4]。

自從利用活細(xì)胞制造人造組織的技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，組織工程領(lǐng)域已經(jīng)有了很大的發(fā)展[5]。在過(guò)去的幾十年中，組織工程基質(zhì)發(fā)生了從僅作為細(xì)胞附著的惰性結(jié)構(gòu)支撐材料到作為組織發(fā)育的更復(fù)雜的動(dòng)態(tài)環(huán)境的巨大變化[6]，未來(lái)的研究方向更強(qiáng)調(diào)為人工組織發(fā)育創(chuàng)造一個(gè)仿生微環(huán)境[7]。在這樣的背景下，以往一直被用作臨床縫合線[8]使用的絲素蛋白材料作為天然聚合物，正在成為組織工程有潛力的綠色材料[9]。

1 絲素仿生支架材料在肌肉骨骼組織工程的形態(tài)

1.1 多孔仿生支架前處理

由于殘留的絲膠蛋白可能導(dǎo)致生物不相容問(wèn)題，所以肌肉骨骼組織工程中使用的絲素蛋白（Silk Fibroin，SF）應(yīng)首先徹底去膠化[10]。目前形成了一套工廠化的生產(chǎn)方案：脫膠絲溶解、透析、離心，以獲得新鮮的SF溶液[11-12]。SF溶液可以制成薄膜、顆粒、電紡纖維、網(wǎng)、海綿、水凝膠和三維多孔支架，并已廣泛應(yīng)用于肌肉骨骼、血管、皮膚和神經(jīng)組織工程[13-14]。

表1為脫膠方法及脫膠程度等的匯總。

1.2 薄 膜

SF膜可以從SF溶液中獲得，也可以與其他聚合物或生長(zhǎng)因子混合[20]。從溶液中獲得的SF膜由于大多數(shù)仍然是無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致SF膜具有水溶性，因此這種澆鑄的穩(wěn)定性成膜率低[21]。為解決這一問(wèn)題，應(yīng)采用水退火、拉伸、醇浸等方法對(duì)鑄膜進(jìn)行后處理，以提高膜表面的β折疊的結(jié)晶度[22]。此外，SF溶液的某些預(yù)處理也可以獲得水不溶性膜，例如控制干燥過(guò)程或向SF溶液中添加甘油[23]。

1.3 顆 粒

SF顆?？梢酝ㄟ^(guò)凍結(jié)干燥SF溶液或?qū)⒐腆wSF磨成微/納米粒子來(lái)產(chǎn)生[24]，還可以通過(guò)自組裝、冷凍解凍、噴射破碎或噴霧干燥來(lái)制造絲素顆粒。雖然磨削顆粒這種物理方法通常用于改善仿生支架機(jī)械特性和細(xì)胞相容性，但可再生的SF顆粒主要用于藥物控釋載體。除了大特異性表面和生物相容性外，生物降解性使絲素顆粒在藥物輸送領(lǐng)域具有很大的優(yōu)勢(shì)[25]。納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要性日益提高，引起了許多研究人員的關(guān)注。

1.4 電紡纖維

電紡儀可以將SF變成表面凸起的生物材料[26-27]，粗糙的表面積有利于細(xì)胞黏附和增殖。當(dāng)然制作過(guò)程需要適當(dāng)?shù)酿ざ热芤?，溶劑?huì)揮發(fā)，以防止紡紗纖維黏貼。全水過(guò)程生產(chǎn)的SF具有良好的生物相容性，然而直接獲取的SF溶液很難滿足電紡儀對(duì)材料的特定要求。纖維的直徑大小差異很大，形態(tài)不規(guī)則，因此，有機(jī)溶劑如六氟二醇（HFIP）和福微酸被廣泛使用[27]?；谟袡C(jī)溶劑的溶液可以很容易地制成纖維直徑相對(duì)均勻的電紡絲，但是這種方法同樣有缺點(diǎn)，殘余的有機(jī)溶劑會(huì)降低材料與細(xì)胞的相容性，同時(shí)還會(huì)刺激機(jī)體的免疫原性。絲素纖維可以制備成各種直徑的蛋白纖維材料，主要由溶液獲取方式和處理模式（黏度和電導(dǎo)率、場(chǎng)強(qiáng)度、流速、溫度、旋轉(zhuǎn)尖端與集合板之間的空間）等環(huán)境參數(shù)控制。電紡絲素纖維的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也可以通過(guò)甲醇等有機(jī)溶劑處理進(jìn)一步提高[26，28-29]。

1.5 三維多孔絲素支架

3D生物材料支架的高孔隙率對(duì)細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和遷移至關(guān)重要[30]，必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物都是通過(guò)多孔結(jié)構(gòu)交換的。3D多孔支架通常由孔隙浸出、氣體發(fā)泡或凍干技術(shù)制成。凍干式多孔材料的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如強(qiáng)度和拉伸，可以通過(guò)控制冷凍溫度和溶液中SF的濃度來(lái)調(diào)節(jié)。通常，較低的冷凍溫度會(huì)導(dǎo)致毛孔尺寸變小，毛孔尺寸分布在幾十到幾百微米之間。冷凍干燥的支架具有良好的孔隙和孔結(jié)構(gòu)[31]，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性很差，提高β折疊的結(jié)晶度可以提高其穩(wěn)定性。鹽浸式3D多孔支架的孔徑取決于孔原顆粒大小，其具有出色的連接結(jié)構(gòu)、高孔隙度和易于調(diào)節(jié)的孔隙大小[32]。此外，鹽浸式3D多孔支架的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的。這些優(yōu)點(diǎn)使鹽浸式3D多孔支架在肌肉骨骼組織工程中常用[32]。

1.6 絲素蛋白水凝膠

水凝膠是以水為分散介質(zhì)的3D聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其為細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的輸送提供了水環(huán)境[33]。此外，絲素蛋白水凝膠的物理性能與某些組織再生的承重需求相匹配[1]。SF水凝膠可以使用酒精、酸、聲波、離子或嗜酸劑等方法獲得，水凝膠中的結(jié)構(gòu)主要是β折疊。SF水凝膠的凝膠過(guò)程可受SF溶液的pH值調(diào)節(jié)[31]，當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，凝膠時(shí)間將很短。SF凝膠時(shí)間還受SF濃度、凝膠溫度、離子濃度和超聲波功率等因素的影響。上述因素均與SF凝膠的時(shí)間負(fù)相關(guān)[34]。最近有報(bào)道表面活性劑可大幅縮短凝膠時(shí)間，這對(duì)于研發(fā)可注射凝膠系統(tǒng)有意義[35]。

1.7 復(fù)合支架

天然聚合物和合成聚合物已廣泛應(yīng)用于肌肉骨骼組織工程[2]。聚乳酸（PLA）、聚氨酯（PU）、多丙烯酸等合成材料由于其特性（如降解時(shí)間、可塑性和機(jī)械特性），可制成有用的生物材料，用于定制某些特定功能組織。然而，上述的這些優(yōu)勢(shì)也無(wú)法掩蓋其降解產(chǎn)物是酸性的缺點(diǎn)，由于對(duì)身體有害而限制了它們的發(fā)展前景。與合成聚合物相比，雖然膠原蛋白、彈性蛋白、明膠和石棉等天然生物聚合物可以嵌入式結(jié)合功能分子獲得更好的生物相容性，但材料加工難度高，而且不易得到良好的機(jī)械性能[36]。為了克服這些方法的局限性，人們開(kāi)發(fā)了復(fù)合支架。組合制造是一種采用兩種或兩種以上制造技術(shù)制造支架的方法，如多孔支架/顆粒、多孔支架/膜、水凝膠/纖維，可以更好地滿足組織再生要求，并拓寬SF材料的使用范圍[37]。

2 絲素仿生支架在肌肉骨骼組織工程中的應(yīng)用

2.1 骨組織工程

骨骼是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜、高強(qiáng)度、高度血管化的生物結(jié)構(gòu)，由70%的礦物質(zhì)和30%的干重有機(jī)物組成的結(jié)締組織。骨組織包括鈣化細(xì)胞和骨細(xì)胞。骨骼的主要作用是支撐身體，防止體內(nèi)器官受損，骨損傷或疾病將嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。在這一領(lǐng)域，已經(jīng)產(chǎn)生各種多孔仿生支架，并研究了這些支架在骨骼再生中使用的影響。然而，能夠完全模仿原生骨骼結(jié)構(gòu)的理想仿生支架仍然未能開(kāi)發(fā)出來(lái)[38]。

絲素以其優(yōu)良的生物相容性和良好的機(jī)械性能在體外骨骼修復(fù)重建中表現(xiàn)良好，可成功將骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。此外有報(bào)告稱，使用不同溶劑和工藝制作的支架用于骨組織工程時(shí)，最佳的孔徑在400～600 μm[39]。Uebersax等[40]用全水工藝獲得多孔SF支架制作頭骨缺陷模型，并測(cè)試絲素多孔支架的體內(nèi)修復(fù)能力。活體動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)8周的植入，檢測(cè)到了新的骨骼在缺陷處形成。然而，材料單一多孔的SF支架，通常不能滿足骨組織工程的機(jī)械需求。為了獲得具有令人滿意機(jī)械性能的絲素支架用于骨質(zhì)組織形成，Rockwood等[41]用SF微粒加固了SF水凝膠。與SF水凝膠相比，彈性模量改進(jìn)了6倍以上。隨著SF支架負(fù)荷的增加，絲素支架的機(jī)械性能顯著提高，同時(shí)鈣的吸收也大幅增強(qiáng)。

2.2 軟骨組織工程

軟骨組織使軟骨下骨免受關(guān)節(jié)內(nèi)的高壓影響。軟骨沒(méi)有骨骼那么硬，因此可以有效地分配載荷，以避免大部分損傷。軟骨損傷通常與關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、劇烈疼痛有關(guān)[42]。然而，軟骨是一種無(wú)血管的結(jié)締組織，軟骨的自愈能力較差。其中，組織工程植入物仍然是最有潛力的一種綠色修復(fù)方法，為軟骨再生提供了一種有希望的途徑。Wang等[43]通過(guò)水性工藝制備了高度多孔的SF支架，并將其與人成纖維細(xì)胞（hMSCs）結(jié)合用于體外軟骨再生。在TGF-β3和地塞米松等誘導(dǎo)劑存在下，hMSCs在3D基質(zhì)中沿軟骨形成途徑分化良好[44]。然后，研究人員在相同的SF支架上培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度對(duì)軟骨細(xì)胞的分化起決定性作用。這項(xiàng)工作使細(xì)胞來(lái)源多樣化，并與SF基支架結(jié)合用于軟骨再生應(yīng)用。在另一項(xiàng)研究中，Mandal等[45]設(shè)計(jì)了一個(gè)三層SF半月板材料系統(tǒng)，以模擬天然半月板結(jié)構(gòu)。將人軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以類(lèi)似于天然組織的方式種植在支架上，機(jī)械性能的改善和細(xì)胞外基質(zhì)ECM的共培養(yǎng)時(shí)間結(jié)果的一致性表明，該構(gòu)建物是定向半月板樣組織生長(zhǎng)的一個(gè)有希望的模板。

2.3 骨骼肌組織工程

骨骼肌也叫橫紋肌，是指將葡萄糖中儲(chǔ)存的化學(xué)能有效地轉(zhuǎn)化為機(jī)械能的組織，是生物體中最重要的功能器官之一。人體內(nèi)有600多塊骨骼肌，可以引起生物體自身的運(yùn)動(dòng)和內(nèi)臟器官的運(yùn)動(dòng)[46]?？v向排列的肌絲以肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白為主要成分構(gòu)成骨骼肌纖維。創(chuàng)傷性損傷或肌肉萎縮等疾病可能導(dǎo)致肌肉功能損害，盡管已經(jīng)做了很多嘗試，骨骼肌組織再生仍然是一個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)[47]。

SF有利于成肌細(xì)胞的增殖和分化。試驗(yàn)證明，SF改性PU支架可用于下咽組織工程。Shen等[48]制備了一種SF的聚合（酯-氨基甲酸乙酯）支架，以改善其親水性和生物相容性。與對(duì)照組相比，骨骼肌細(xì)胞和人下咽成纖維細(xì)胞增殖分化良好，細(xì)胞毒性低，生物相容性好。在大鼠背部皮下植入SF支架后，發(fā)現(xiàn)其與周?chē)M織的生物相容性更好，降解速度更快[49]。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外絲素支架研究總結(jié)，得到以下結(jié)論：

1）絲素蛋白能夠用作組織工程的原因是因?yàn)樗己玫募?xì)胞相容性、緩慢的生物降解性和優(yōu)異的機(jī)械性能;2）SF支架的特性可以通過(guò)調(diào)整其二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)，其中最重要的結(jié)構(gòu)是β折疊;3）絲素蛋白支架能夠克服目前手術(shù)修復(fù)肌肉骨骼的弊端，屬于一種綠色的新型生物療法;4）絲素蛋白支架結(jié)合生長(zhǎng)因子和其他細(xì)胞信號(hào)因子來(lái)優(yōu)化細(xì)胞功能，支持干細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖;5）基于絲素蛋白的生物材料可以開(kāi)發(fā)為一個(gè)可持續(xù)的、可生物降解的材料平臺(tái)，廣泛地應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)方面。

與生長(zhǎng)因子結(jié)合的生物材料已被證明提高了修復(fù)能力，盡管膠原蛋白、彈性蛋白、明膠和殼聚糖等天然生物聚合物由于嵌入功能分子的結(jié)構(gòu)而提供了更好的生物相容性，但具有加工困難和機(jī)械性能差等局限性。絲素仿生支架的材料研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛，然而，關(guān)于它們的臨床應(yīng)用研究仍然很缺乏。因此，希望加強(qiáng)絲素仿生支架的材料的臨床應(yīng)用研究的同時(shí)，進(jìn)一步深化對(duì)絲素蛋白材料應(yīng)用于各種組織器官組織工程材料的開(kāi)發(fā)研究。

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